专利名称：一种聚磷酸酰胺及其作为基因载体的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于有机高分子化合物领域，涉及在高分子主链中由形成含除硅、硫、氮、氧及碳以外的原子的键合反应得到的高分子化合物，具体涉及主链含磷的高分子化合物。
背景技术：
基因治疗(gene therapy)是指利用分子生物学方法将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷或异常引起的疾病，以达到治疗目的，受到人们的重视和关注。基因载体是影响基因治疗的重要因素。良好的基因载体应具备易进入细胞、靶向性、稳定性、安全性和易制备等特点。基因载体可以分为病毒类和非病毒类两大类。病毒类载体因转染效率高，在基因治疗领域的应用最为广泛。但是病毒类载体的致癌作用、基因携帯能力低和免疫原性限制其应用。非病毒类载体具有无免疫原性、处理简单方便等优点，在基因治疗领域备受瞩目。非病毒类载体主要有阳离子脂质体、聚こニ醇和阳离子聚合物。阳离子脂质体的细胞毒性大，且稳定性低。聚こニ醇DNA复合能力低，基因载入量小。阳离子聚合物可以和带负电荷的基因静电结合形成带正电荷的多聚复合物，保护基因免于核酸酶降解，提高基因稳定性。目前研究较多的阳离子聚合物主要有阳离子聚磷酸酷。阳离子聚磷酸酯是近年来发展较快的ー类新型生物可降解材料，其主链或者侧链上含有磷酸酯键，因此阳离子磷酸酯类聚合物具有在生理条件下易降解和优异的生物相容性的特点，且其结构可变性高，有利于对其进行结构修饰及功能化，广泛应用为药物控释载体、组织工程材料和基因载体。Wang等制备了可降解侧链含胺基的聚磷酸酷，研究结果显示该类阳离子型聚磷酸酯能够成功地与DNA结合，体内、体外的毒性实验和组织相容性实验结果表明，该类聚合物具有良好的生物相容性和基因转染作用。但是，上述阳离子型聚磷酸酯在制备过程中，必须使用Sn (Oct) 2等有机金属化合物对2-氯-2-氧_1，3，2- ニ氧磷杂环戊烷衍生物进行开环聚合，虽然其后续的透析エ艺可除去金属离子，但金属离子的残留仍无法避免。此外，在开环聚合中，严格要求无氧无水，因此现有阳离子型聚磷酸酯的生产エ艺复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种聚磷酸酰胺，该聚合物不仅无金属离子残留，而且生物相容性好，制备エ艺简便。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种聚磷酸酰胺，该聚磷酸酰胺的化学结构如下式(I)所示
OI
モトN'へゾN、ズ'''Nナ
R(I)式(I)中，η为14 42，R为Cl 4烷基或者苯基。本发明所述的聚磷酸酰胺中η较好为20 30。
本发明所述的聚磷酸酰胺中，R较好是甲基、こ基、异丙基或者苯基中的一种或者两种以上，最好是こ基或/和异丙基。本发明所述的聚磷酸酰胺是由ニ氯磷酸酯和N-甲基-2，2’-ニ氨基ニこ胺按1:1的物质的量比以下方法制备得到将N-甲基-2，2’ -ニ氨基ニこ胺、有机溶剂和三こ胺混合均匀，在(TC下加入ニ氯磷酸酷，室温下反应12 24h后将所得到的反应物倒入体积比为こ醚/甲醇=10/1的混合溶液中，沉淀过滤即得；其中所述的有机溶剂为THF、ニ氯甲烷和三氯甲烷中的ー种或者两者以上。上述的聚磷酸酰胺的制备方法中，所述的ニ氯磷酸酯是ニ氯磷酸Cl 4烷基酯或者ニ氯磷酸苯基酷，较好是ニ氯磷酸こ酷、ニ氯磷酸异丙酯、ニ氯磷酸甲酯和ニ氯磷酸苯酯中的ー种或者两种以上，最好是ニ氯磷酸こ酯或/和ニ氯磷酸异丙酷。本发明所述的聚磷酸酰胺的主链含有胺基，可用作为基因载体，具体使用方法是将所述的聚磷酸酰胺与基因进行静电复合，再与细胞一起培养，利用细胞内吞作用将基因 导入细胞。本发明的聚磷酸酰胺与现有技术相比，不仅无金属离子残留，生物相容性好，而且制备エ艺简单方便。
图I实施例I制备的聚磷酸酰胺对HEK293和肺癌A549细胞毒性实验结果的直方图。图2实施例I制备的聚磷酸酰胺的细胞毒性的时间依赖性曲线图。图3实施例I制备的聚磷酸酰胺基因复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱。图4GFP质粒转染HEK293细胞培养24h的荧光显微镜显示图。
具体实施例方式实施例I(I)聚磷酸酰胺制备氮气保护下，将I. 17g N-甲基-2，2’-ニ氨基ニこ胺，20mL ニ氯甲烷，IOmL三こ胺加入IOOmL烧瓶中。在0°C下，缓慢加入1.63g ニ氯磷酸こ酷。室温下反应12h后，将上述反应物倒入400mLこ醚/甲醇(こ醚/甲醇=10/lv/v)中，沉淀过滤得到聚磷酸酰胺。(2)聚磷酸酰胺表征聚磷酸酰胺的结构用NMR表征。其结果如下所示1H NMR (400MHz, DMS0_d6) : 4· 51 4· 72 (m, 2H, CH2)，3. 08 (m, 11H, -NCH2CH2) N (CH3)CH2CH2N-)，I. 09 I. 31 (m, 3H, CH3)13C NMR(IOOMHz, DMS0_d6) :11. 7, 37. 2，46. 6，53. 4，59. 2聚磷酸酰胺的的重均分子量采用凝胶渗透色谱法检測。其检测条件是P230系统(PU-980, CO-965 and RI-210)，THF 为洗脱液。其重均分子量为 4351。由上述NMR可以知道制备的聚磷酸酰胺具有以下结构
权利要求
1.一种聚磷酸酰胺，该聚磷酸酰胺的化学结构如下式(I)所示
2.根据权利要求I所述的聚磷酸酰胺，其特征在于，式(I)中的η是20 30。
3.根据权利要求I所述的聚磷酸酰胺，其特征在干，式(I)中的R是甲基、こ基、异丙基和苯基中的一种或者两种以上。
4.根据权利要求I所述的聚磷酸酰胺，其特征在干，式(I)中的R是こ基或/和异丙基。
5.权利要求I至4其中之一所述的聚磷酸酰胺作为基因载体的用途。
6.权利要求I至4其中之一所述的聚磷酸酰胺的制备方法，该方法由以下步骤组成是由N-甲基-2，2’ - ニ氨基ニこ胺和ニ氯磷酸酯按照物质的量比为I: I依据以下步骤制备得到将N-甲基-2，2’-ニ氨基ニこ胺、有机溶剂和三こ胺混合均匀，在0°C下加入ニ氯磷酸酷，室温下反应12 24h后将所得到的反应物倒入体积比为こ醚/甲醇=10/1的混合溶液中，过滤即可；其中，所述的有机溶剂为THF、ニ氯甲烷、三氯甲烷中的一种或者两种以上。
7.根据权利要求6所述的聚磷酸酰胺的制备方法，其特征在干，所述的ニ氯磷酸酯是ニ氯磷酸Cl 4烷基酯或者ニ氯磷酸苯基酷。
8.根据权利要求6所述的聚磷酸酰胺的制备方法，其特征在于，所述的ニ氯磷酸酯是ニ氯磷酸こ酷、ニ氯磷酸异丙酯、ニ氯磷酸甲酯和ニ氯磷酸苯酯中的ー种或者两种以上。
9.根据权利要求6所述的聚磷酸酰胺的制备方法，其特征在于，所述的ニ氯磷酸酯是ニ氯磷酸こ酯或/和ニ氯磷酸异丙酷。
全文摘要
本发明涉及一种聚磷酸酰胺，该聚磷酸酰胺的化学结构如下式(I)所示，式(I)中，n为14～42，R为C1～4烷基或者苯基。本发明所述的聚磷酸酰胺是将二氯磷酸酯和N-甲基-2,2'-二氨基二乙胺进行反应得到。本发明所述的聚磷酸酰胺的主链含有胺基，可用作为基因载体，而且不含有金属离子，制备方法简单和生物相容性好。
文档编号C12N15/85GK102690420SQ20121018328
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者刘瑞源, 曾方银, 柯志勇, 许万福, 邓凡 申请人:南方医科大学