专利名称：一种干酪乳杆菌及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明提供的是一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培养基。
背景技术：
干酿乳杆菌(Lactobacilluscasei L7-13)属于乳杆菌属(Lactobacillus),是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动；兼性厌氧，有时微好氧，在有氧时生长差，降低氧分压时生长较好；兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，不还原硝酸盐，接触酶和氧化酶皆为阴性；最适生长温度为37°C，G+C含量为45.6% 47.2% ;菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌分布广泛，通常存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中，罕见致病。干酪乳杆菌的生理功能(I)发酵后营养作用干酪乳杆菌发酵后产生乳酸，可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收。乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑磷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系。众所周知，有人患有乳糖不耐症，若食用牛奶等鲜乳制品会引起腹泻，而发酵乳发酵消耗原奶中20% 40%的乳糖，当引用酸奶后，还有一部分乳糖酶在继续起作用，有利于肠的消化。还有助于防止缺铁、缺钙引起的贫血症和软骨病。结肠粘膜不能自己从血液中吸收营养，因此它的营养必须由肠道内的益生菌(多数是乳酸菌)产生。Bengmark等研究发现，胃肠道中的干酪乳杆菌能提供重要的营养、维生素和抗氧化剂，减少吸收食品中的有毒成分，防止食物腐败，根除病原体。(2)改善胃肠道功能干酪乳杆菌通过自身及其代谢产物和其他细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合及这种组合的稳定。胃肠道中各种微生物的种类、数量和定居部位 是相对稳定的，它们相互协调，相互制约，共同形成一个平衡的微生态系统。它们的数量取决于各自的活性，各种微生物都分泌特殊的物质抑制其他有害菌种的生长，乳酸菌正是其中的“佼佼者”。有害菌会产生腐败代谢产物，如氨、硫化氢、吲哚等物质，这些有害物质会造成胃肠道功能异常，而优势的乳酸菌可以产生多种抗菌物质，抑制有害菌的定植，这就是所谓的阻抗定位作用。干酪乳杆菌在体内发酵糖类，产生大量的乙酸和乳酸，使肠道内PH和Eh下降，肠道处于酸性环境，对于病原性细菌，如志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有拮抗作用。低PH和Eh能维持正常生理功能，对肠炎、痢疾、急慢性腹泻、结肠炎等多种肠道疾病有良好的预防和治疗作用。干酪乳杆菌在代谢过程中可以产生H2O2，抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。在肠道中，产H2O2的干酪乳酸菌同时在代谢过程中产生乳酸，增强了 H2O2的杀菌作用，从而使乳酸菌成为肠道中的优势菌。(3)抗肿瘤作用关于乳酸菌的抗肿瘤作用的报道是Bogdanov (1962)，他从保加利亚乳杆菌中分离出了 3种具有抗癌活性的糖肽。1978年，Kilara和Shahani报道，乳酸菌对抑制肿瘤细胞的增殖有一定效果，光岗知足也得到了类似的结果。1980年Kato等研究了干酪乳杆菌的抗肿瘤作用。1990年，Macleod等发现了干酪乳杆菌对抑制肝细胞肿瘤增长的功效。研究者们认为，乳酸菌的抗肿瘤活性是由于乳酸菌菌体本身及其代谢产物所致。目前这一研究已从推测进入实验论证和机理阐明阶段。虽然乳酸菌抑制肿瘤的真正机制目前并不十分清楚。但可大致归纳出6项可能的作用机理，包括:①降解或者吸附致癌物改善肠道菌群，阻止肠内致癌物的形成；③增强宿主免疫系统；④产生抗突变物质；⑤改变肠道的生理生化环境；⑥影响宿主的生理机能。(4)降低胆固醇作用胆固醇在人体内具有重要的生理作用，但血清中胆固醇含量过高容易诱发动脉硬化，从而导致一系列心血管疾病。在一些人民生活富裕的国家，因血液中胆固醇含量过高引发的心血管疾病，已经成为威胁人类身心健康的最大杀手。近年来国外的研究表明，乳酸菌具有较高的降低胆固醇作用，适量服用乳酸菌及乳酸菌发酵产品可以有效降低血液胆固醇含量，从而减少心血管疾病的发病概率。1977年，美国调查发现经常饮用酸奶和相关发酵乳制品的人，其体内血清胆固醇含量也较低。长期以来，人们对乳酸菌降低胆固醇作用及其机理进行了广泛而有效的研究。尽管大量的体内和体外实验都证实了乳酸菌的降低胆固醇作用，但其作用机理至今尚未定论，通常认为是几种理论协同作用的结果。①体外研究证明，在厌氧条件下，乳杆菌和双歧杆菌在含有胆盐的高胆固醇培养基生长时，能降低培养基中胆固醇含量，人们推测细菌细胞吸收了肠道中的胆固醇，可能会减少机体对胆固醇的吸收,从而导致体内血清中胆固醇含量也相应下降。②体外实验证明，乳酸菌产生的胆盐水解酶可以将结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和胆固醇形成复合物共同沉淀下来。这就是乳酸菌与胆固醇的共沉淀作用。这种共沉淀作用可以使环境中的胆固醇含量降低。(5)增强机体免疫作用致病微生物(病毒、病菌、支原体等)广泛存在于自然界中，并且不断产生新的变异体， 不仅导致人体产生各种炎症，甚至引发肿瘤等恶性疾病。现有疫苗和抗生素往往只能针对某些已知的致病微生物引起的疾病进行治疗，而对其变异体则无能为力。因此，通过提高人体的免疫力来预防和治疗各种致病微生物引起的疾病，日益成为各国科学家关注的热点。今年研究表明:乳杆菌可以作为特异性免疫调节因子，增强肠道非特异性免疫能力，促进巨噬细胞产生TNA-a和IL-6，激活淋巴细胞，增加血液中免疫球蛋白的含量，从而提高机体抵抗病原体的能力。乳酸菌的细胞壁主要是由肽聚糖、多糖和磷壁酸组成。已知肽聚糖对免疫反应具有促进作用。对溶菌酶消化作用十分敏感的乳酸菌可能在肠道中释放肽聚糖，并在胃肠黏膜表面产生诱导免疫反应。研究证明，用干酪乳杆菌的发酵液经加热杀死活菌后仍能增强免疫反应，说明乳酸菌发酵产物也能增强机体的免疫力。乳酸菌发酵制品中，还有大量的短链多肽、游离氨基酸，不饱和脂肪酸，同时乳酸菌发酵液中的各种可溶态的微量元素也大大高于发酵前的培养基。酪蛋白水解后产生一种活性六肽，它可以刺激巨噬细胞的吞噬作用，同时还能刺激T细胞和白细胞的增殖和成熟，从而提高机体的免疫力，抵抗病原菌的入侵。(6)延缓机体衰老自从俄国作家梅切尼科夫的著作《长寿说》问世以来，乳酸菌能延长人的寿命已经有了很多证据。梅切尼科夫的研究表明，保加利亚人的长寿证实因为他们喜欢喝酸奶，而酸奶是由乳酸菌发酵而成的。人从婴幼儿、青少年、壮年直至老年，由于生理变化，肠道内的微生物数量、种群和优势菌群也不断发生变化。人在出生时没有乳酸菌；青壮年时，乳酸菌数量成为优势菌，益生菌的数量达到顶峰；老年人体内的有害菌相对较多，益生菌数量相对较少。老年人的身体器官和机能都出去衰退时期，而乳酸菌可使肠内菌群平衡，加强乳酸菌等益生菌成为肠道内优势菌的地位。日本光岗知足表明，长期饮用发酵乳，能够增加老年人的免疫力，促进心、肝等器官的功能，达到延年益寿的目的。
发明内容
本发明的目的就提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培养基，用于发酵乳制品工业中。—种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13),该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏日期:2010年7月2日，登记入册编号为:CGMCC N0.3993。本发明还具有如下特征:1、所述的干酪乳杆菌形态学特征为:革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。2、所述的干酪乳杆菌的16S核糖体DNA (16S rDNA)全序列为如序列表SEQIDN0.1。3、一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的培养基，配方如下:溶剂为水，葡萄糖10.0-80.0g/L、低聚果糖10.0-50.0g/L、低聚木糖10.0-50.0g/L、大豆蛋白胨 10.0-30.0g/L、酵母浸粉 10.0-50.0g/L、牛肉粉 5.0-30.0g/L、磷酸氢二钾 0.5-3.0g/L、柠檬酸三钠 0.5-3.0g/L、柠 檬酸铵 0.1-3.0g/L、MgSO4.7H20 0.1-2.0g/L、MnSO4.4H200.1-1.0g/L、吐温 80 0.l-20mL/L ;在 ρΗ4.5-6.5、温度 30_42°C条件下培养 18-36 小时，菌体生长良好。本菌种产乳酸速度快，产酸高；繁殖速度快，活力高，抗逆性强；具有改善胃肠道的功能，能抑制有害菌的定植；该菌种能产生胆盐水解酶，可以将结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和胆固醇形成复合物共同沉淀下来，因此，该菌种具有降低胆固醇作用。
图1为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的光学显微镜照片；图2为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的电子显微镜照片。
具体实施例方式下面举例对本发明作更详细的描述:实施例1本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13)的分离和培养方法，本发明的目的是这样实现的:本发明中所涉及的百分比均为重量百分比。1.首先从自然界中采集样品:将采样工具及各种采样容器进行灭菌，采样地点选择在乳品生产厂附近下水道的淤泥中，养牛挤奶场的土壤中，堆放的鲜储固态饲料内层中，进行多点采样。2.将采集的样品进行稀释:将采集的某种样品在无菌条件下混合均匀，称取20克样品，溶解于IOOmL无菌水中，其中装有80-100粒玻璃珠，用力摇动10分钟，静止一分钟，用ImL无菌吸管吸取ImL上清液，移入9mL无菌水试管中，彻底摇匀，然后再从这一稀释的样品中取出ImL样品再移入9mL无菌试管中，彻底摇匀，如此依次进行稀释，直至稀释到10'3.涂布分离:从上述稀释的样品中用0.1mL无菌吸管分别取出0.1mL样品，移入BCP琼脂平板培养基中，用无菌三角刮棒，涂布均匀，每个稀释度做3个重复。BCP培养基配方(g/100mL):葡萄糖0.5g、乳糖0.5g、酵母浸粉0.5g、琼脂1.5 2.0g、溴甲酹紫(5g/100mL) 1.0mL、自来水 IOOmL, pH 6.8 7.0。4.培养:将涂布的平板置于37°C培养箱中倒置培养24小时，观察挑菌。5.挑菌:将黄色菌落或培养基周围变为黄色的菌落挑入试管斜面中，挑取200个菌落，然后再进行二次分离纯化，最后得到纯培养，从上述200株菌种中选出两株黄色圈最大者，进行紫外线照射诱变。6.紫外线诱变初筛:将其中两株菌分别在MRS培养基中进行培养12小时，取出离心，用无菌水洗涤两次，再用生理盐水稀释，用玻璃珠摇匀打碎，使细胞数达到107，在15W紫外灯下，距离IOcm照射3分钟，红光下操作，然后涂布于上述琼脂平板上，避光培养36小时。挑取黄色圈大的菌落，移入试管斜面中，挑取50株菌株。7.复筛:将50株菌种逐个进行培养产酸和凝乳性能测试，从其中筛选出2株性能最佳者，再进行诱变筛选，反复进行3次，最后得到一株最优良菌种L7-13。8.根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版，进行形态学、生理生化和16srDNA菌种鉴定。菌落形态特 征描述^MRS固体培养基上生长的单一菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐、表面光滑、菌落中心突起，质地均匀。菌种个体形态特征:光学显微镜观察到，菌体呈细长的杆状，部分有不规则的弯曲、无芽孢、无运动性，革兰氏染色阳性。通过电镜照片可看到，其菌体形态和光学显微镜下的形态基本一致。(附光学显微镜和电子显微镜照片图1-2)生理生化实验结果:(表I)
权利要求
1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei L7-13),该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为=CGMCC N0.3993。
2.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei L7-13),其特征在于:所述的干酪乳杆菌形态学特征为:革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。
3.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei L7-13),其特征在于:所述的干酪乳杆菌的16S核糖体DNA (16S rDNA)全序列为如序列表SEQ ID N0.1。
4.根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei L7-13)的培养基，其特征在于，配方如下:溶剂为水，葡萄糖10.0-80.0g/L、低聚果糖10.0-50.0g/L、低聚木糖 10.0-50.0g/L、大豆蛋白胨 10.0-30.0g/L、酵母浸粉 10.0-50.0g/L、牛肉粉 5.0-30.0g/L、磷酸氢二钾 0.5-3.0g/L、柠檬酸三钠 0.5-3.0g/L、柠檬酸铵 0.1-3.0g/L、MgSO4.7H20·0.1-2.0g/L、MnSO4.4Η200.1-1.0g/L、吐温 80 0.l_20mL/L ;在 ρΗ4.5-6.5、温度 30-42。。条件下培养18-36小时，菌体生长良好。
全文摘要
本发明公开一种干酪乳杆菌及其培养基，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.3993，其拉丁文命名为Lactobacillus casei L7-13，形态学特征为革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，菌落粗糙，呈灰白色或微黄色。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列；本菌种产乳酸速度快，产酸高；繁殖速度快，活力高，抗逆性强；具有改善胃肠道的功能，能抑制有害菌的定植；该菌种能产生胆盐水解酶，可以将结合胆酸分解为游离胆酸，而游离胆酸则可以和胆固醇形成复合物共同沉淀下来，因此，该菌种具有降低胆固醇作用。
文档编号C12N1/20GK103114052SQ201210578740
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者梁金钟, 肖文娟 申请人:哈尔滨美华生物技术股份有限公司