表达agt1的重组酵母的制作方法

表达agt1的重组酵母的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对糖转运体AGT1的多种变体的鉴定，这些变体在酵母中重组表达时可提供低聚糖的增强的发酵。本发明进一步涉及编码这些变体的多核苷酸、表达这些变体的重组酵母细胞、以及这些重组酵母细胞在发酵低聚糖中的应用。
【专利说明】表达AGT1的重组酵母
发明领域
[0001]本发明涉及对糖转运体AGTl ( α-葡萄糖苷转运体-1)的变体的鉴定，这些变体在酵母中重组表达时提供了低聚糖的增强的发酵。本发明进一步涉及编码这些变体的多核苷酸、表达这些变体的重组酵母细胞、以及这些重组酵母细胞在发酵低聚糖中的应用。
[0002]发明背景
[0003]随着全球矿物燃料消耗的不断增加，在可替代能源选择方面也越来越引起重视。乙醇的使用已经引起了人们相当大的关注。燃料乙醇可以从含有淀粉的作物，例如饲料谷物、食品谷物、以及块茎，例如马铃薯和甘薯来制备。含糖作物，例如甜菜、甘蔗、以及甜高粱也可以用于乙醇的生产。糖，以粗制糖或精制糖的形式，在发酵前不需要预水解(与玉米淀粉不同)。结果，从糖产生乙醇的过程比玉米淀粉转化为乙醇更简单。然而，高效地生产足够量的乙醇仍然是一个关注点。
[0004]因此，设计并发展新方法和系统以增加乙醇生产过程的效率是令人希望的。本发明通过提供一种增强低聚糖发酵水平和比率的改进的发酵过程而解决了本领域中的以前的缺点。
[0005]发明概述
[0006]本发明部分地基于对AGTl的变体的鉴定，这些变体当在酵母中重组表达时增强低聚糖发酵的水平 和/或比率。本发明进一步基于这些变体在通过酵母而增强低聚糖发酵效率的应用。
[0007]因此，作为一个方面，本发明提供了一种低聚糖发酵来生产乙醇的方法，该方法包括:将低聚糖与重组酵母细胞接触，该重组酵母细胞包括编码酵母AGTl多肽的异源的多核苷酸；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
[0008]在另一个方面，本发明提供了一种修饰酵母细胞以减少低聚糖发酵期间乙醇生产的迟延时间的方法，该方法包括:将编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到酵母细胞中；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
[0009]在另个方面，本发明提供了一种修饰酵母细胞以增加低聚糖发酵期间乙醇生产量的方法，该方法包括:将编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到酵母细胞中；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
[0010]在又一个方面，本发明提供了一种用于从低聚糖进行乙醇生产的重组酵母细胞，该重组酵母细胞包括:编码酵母AGTl多肽的异源多核苷酸；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
[0011 ] 在下文的本发明描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。
[0012]附图简要说明[0013]图1显示了酵母基因组DNA与由AGTl的氨基酸编码区组成的探针的Southern杂交。
[0014]图2显示了从8个酵母菌株扩增和测序的MALI区。
[0015]图3显示了 AGTl序列的系统树。
[0016]图4显示了由酵母菌株对4%的异麦芽酮糖(IM)的发酵，该酵母菌株中的AGTl基因已全部测序。
[0017]图5显示了由表达AGTl变体的AAGTl酵母菌株(缺少天然(native) AGTl基因)对4%頂的发酵。
[0018]图6将载有不同AGTl-表达盒的酵母所产生的乙醇的量显示为发酵的时间函数。
[0019]图7显示了由菌株1334对4%潘糖的发酵。
[0020]发明详细说明
[0021]现在将参照附图对本发明进行更加详细的描述，其中展示了本发明的优选的实施例。然而，本发明能以不同的形式呈现，并且本发明不应该被理解为局限于在此阐述的实施例。当然，提供这些实施例以使得本披露将是深入的和完整的，并且将向本领的普通技术人员充分地传达本发明的范围。
[0022]除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此处的本发明的说明中使用的术语是仅用于描述具体实施例的目的并且不意在限制本发明。在此引用的所有的公开、专利申请、专利、专利公开、由登录号标识`的序列、以及其他参考文件对于与引用中提及的句子和/或段落相关的传授内容通过引用以其全文结合在此。
[0023]除非上下文中另外指出，在此所描述的本发明的多样的特征特别地意在能以任何组合使用。例如，涉及一个实施例所描述的特征也可以应用于并且结合于本发明的其他实施例和方面。
[0024]而且，本发明还思考了在本发明的一些实施例中，在此所阐述的任何特征或特征的组合能被排除在外或省略。
[0025]在此出现的核苷酸序列仅对单链，5’到3’方向，从左至右，除非特别地以另外的方式表明。核苷酸和氨基酸在此是以由IUPAC-1UB生物化学命名委员会推荐的方式所代表，或者(对于氨基酸)由一个字母代码或者3个字母代码的方式所代表，两者与37C.F.R.§ 1.822和既定用法一致。
[0026]除了以另外的方式表明，本领域普通技术人员已知的标准方法可以被用于基因克隆、扩增和核酸检测，以及类似。O此类技术是本领域普通技术人员已知的。参见，例如，Sambrook (萨姆布鲁克)等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.(《分子克隆:实验室手册第二版》)(Cold Spring Harbor, NY, 1989 (冷泉港，纽约，1989))；Ausubel(奥苏贝尔)等人，Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物学实验指南》)(Green Publishing Associates, Inc.and John ffiley&Sons, Inc., New York (格林出版联合公司以及约翰威利父子公司，纽约))。
[0027]1.定义
[0028]如在本发明的说明书和所附的权利要求书中所用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、以及“该(the)”意在还包括复数形式，除非上下文清楚地以另外的方式表明。[0029]如本文所用，“和/或”是指并且包括一个或多个相关的所列项的任何一个及全部可能组合，以及当按替代性(“或”)解读时，是指并且包括组合的缺少。
[0030]在此使用的术语“约(about)”当指可测量的值(比如多肽、剂量、时间、温度、酶活性或其他生物活性以及类似物的量)时，意为包括±20%、土 10%、±5%、土 1%、±0.5%或甚至±0.1%的具体数值的变化。
[0031]术语“基本上由……组成”(以及语法上的变体)当应用于本发明的多核苷酸或多肽序列时，是指由列举的序列(例如，SEQ ID NO)以及该列举的序列的5’和/或3’端上，或者N-端和/或C-端末端的全部十个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)的额外的核苷酸或氨基酸两者组成的一个多核苷酸或多肽，这样使得该多核苷酸或多肽的功能未实质上发生改变。该全部十个或更少的额外的核苷酸或氨基酸包括全部数量的、两个端上加在一起的额外的核苷酸或氨基酸。术语“实质上地改变”，当应用于本发明的多核苷酸时，是指相较于由列举的序列组成的多核苷酸的表达水平，增加或减少至少约50%或更多的表达已编码多肽的能力。术语“实质上地改变”，当应用于本发明的多肽时，是指相较于由列举的序列组成的多肽的活性，增加或减少至少约50%或更多的多肽的生物学活性(例如，糖转运活性或发酵的增强)。
[0032]如本文所用，“核酸”、“核苷酸序列”、以及“多核苷酸”是可互换使用的，并且包括RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成的(例如，化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体。术语多核苷酸、核苷酸序列、或核酸是指与链长无关的核苷酸链。核酸可以是双链的或单链的。在单链的情况下，核酸可以是正义链或反义链。使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸核苷酸)能够合成核酸。例如，此类寡核苷酸可以用于制备核酸，该核酸已改变碱基配对的能力或已增强对核酸酶的抗性。本发明进一步提供了一种核酸，该核酸是本发明的核酸、核苷酸序列、或多核苷酸的补体(其可以是全部补体或部分补体两者)。
[0033]“分离的多核苷酸”是一种核苷酸序列(例如，DNA或RNA)，该核苷酸序列不与在其衍生而来的生物的自然发生的基因组中的与其紧邻(一个位于5’末端并且一个位于3’末端)的核苷酸序列相邻。因此，在一个实施例中，一个分离的核酸包括5’非编码(例如,启动子)序列的一些或全部，这些序列紧邻编码序列。因此，该术语包括，例如，一种重组DNA，它整合进入一种载体、进入一种自我复制的质粒或病毒、或进入一种原核生物或真核生物的基因组DNA，或者它作为独立于其他序列的一种单独分子(例如，一种cDNA或一种利用PCR或限制性内切核酸酶处理所得到的基因组DNA片段)而存在。它还包括重组DNA，该重组DNA是编码额外多肽或肽序列的杂交核酸的部分。包含一种基因的分离的多核苷酸不是包含此种基因的染色体片段，更确切地说是包括与该基因相关联的编码区和调节区的染色体片段，但是在该染色体上并未自然地发现额外的基因。
[0034]术语“分离的”还可以指大体上不含细胞物质、病毒物质、和/或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学品(当化学合成时)的核酸或多肽。此外，“分离的片段”是核酸或多肽的片段，该片段不天然地作为片段存在并且不会以天然状态被发现。“分离的”不意指制备物在技术是纯粹(均匀)的，但是它充分地纯，以提供处于一种形式的多肽或核酸，在该形式下，该多肽或核酸可以用于预期目的。
[0035]“分离的细胞”是指一种细胞，该细胞是以其自然的状态，从通常与其相关联的其他组分中分离出的。例如，分离的细胞可以是在培养基中的细胞和/或在药学上可接受的载体中的细胞。因此，分离的细胞可以被递送至和/或引入到一个受试者中。在一些实施例中，分离的细胞可以是一种取自受试者并且离体操作，然后返回至该受试者的细胞。
[0036]术语“片段”，当应用于多核苷酸时，将被理解为意在一种相对于参比核酸或核苷酸序列具有减少的长度的核苷酸序列，并且该核苷酸序列包括与参比核酸或核苷酸序列完全相同或几乎完全相同(例如，至少70%、80%、90%、92%、95%、98%、或99% —致性)的连续核苷酸的核苷酸序列，基本上由其组成，和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种核酸片段可以包含于它作为组分的一个较大的多核苷酸内。在一些实施例中，这类片段可以包括具有至少约 8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多个根据本发明的核酸的连续核苷酸的长度的寡核苷酸，基本上由其组成，和/或由其组成。
[0037]术语“片段”，当应用于多核苷酸时，将被理解为意在一种相对于参比多肽或氨基酸序列具有减少的长度的氨基酸序列，并且包括与参比多肽或氨基酸序列完全相同或几乎完全相同(例如，至少70%、80%、90%、92%、95%、98%、或99% —致性)的连续氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种多肽片段可以包含于它作为组分的一个较大的多肽内。在一些实施例中，这类片段可以包含具有至少约4、
6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多个根据本发明的多肽或氨基酸序列的连续氨基酸的长度的肽，基本上由其组成，和/或由其组成。
[0038]“载体”是用于将核酸克隆至细胞内，和/或将核酸转运至细胞内的任何核酸分子。载体可以是复制子，另外的核苷酸序列可以附于该复制子上，以允许所附核苷酸序列的复制。“复制子”可以是任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒基因组)，该遗传元件作为核酸体内复制的自发单元起作用，即，能够在其自身控制下进行复制。术语“载体”包括病毒的和非病毒的(例如，质粒)核酸分子，用于将核酸体外、离体、和/或体内引入细胞中。本领域中已知的大量的载体可以用于操作核酸、将效应元件以及启动子渗入至基因中，等。例如，可以通过将合适的核酸片段连接到具有互补粘性末端的所选载体中，实现将与效应元件和启动子相应的核酸片段插入至合适的载体。可替代地，核酸分子的末端可以是酶促改性的或可以通过将核苷酸序列(接头)连接到该核酸终端产生任何位点。此类载体可以被设计为包含编码选择性标记的序列，这些可选择的标记提供对含有该载体和/或已经将该载体的核酸合并到细胞基因组内的细胞的选择。此类标记允许宿主细胞的鉴定和/或选择，这些宿主细胞结合并表达由该标记编码的蛋白。“重组子”载体指的是一种病毒或非病毒载体，该载体包括一种或多种异源核苷酸序列(即，转基因)，例如，2、3、4、5或更多异源核苷酸序列。“表达”载体指的是一种病毒或非病毒载体，该载体被设计为表达由已插入该载体中的异源核苷酸序列编码的产物。
[0039]术语“转染”或“转导”意指由细胞对外源或异源核酸(RNA和/或DNA)的吸收。当此类核酸已经被引入或转运至细胞内部时，该细胞已经被外源或异源的核酸“转染”或“转导”了。当该转染或转导的核酸在细胞中赋予了一种表型改变和/或赋予该细胞活性或功能的改变时，则该细胞已经通过外源或异源核酸被“转化”了。该转化的核酸可以被整合(共价结合)至形成细胞基因组的染色体DNA中，或该转化的核苷酸可以作为一个稳定的质粒存在。
[0040]相对于多核苷酸，术语“异源的”意指一种多核苷酸，该多核苷酸不是天然存在于其所在的细胞中的，或，可替代地，意指一种多核苷酸，该多核苷酸通常被发现于细胞中，但是相比其通常在细胞中的位置而言，其是在不同的位置的(例如，在一个载体或在该基因组中的不同位置)。
[0041]术语“重组酵母细胞”指的是一种酵母细胞，该酵母细胞包括异源的多核苷酸。异源的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方式被插入到酵母细胞中。在一个实施例中，多核苷酸通过基因工程被插入(例如，表达载体的插入)。在另一个实施例中，多核苷酸是通过育种被插入(例如，基因渗入)。
[0042]如本文所用，术语“蛋白”与“多肽”是互换地使用，并且包括肽和蛋白两者，除非以另外的方式表明。
[0043]“融合蛋白”是一种多肽，该多肽是编码在自然界未被发现融合在一起的两种(或更多)不同的多肽的两段外源核苷酸序列或其片段在正确的翻译阅读框内融合在一起时而产生的。说明性的融合多肽包括将本发明的多肽(或其片段)融合到谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、或报告蛋白(例如，绿色荧光蛋白、β_葡萄糖醛酸酶、β_半乳糖苷酶、荧光素酶，等)、血凝素、原癌基因、FLAG抗原表位，等的全部或部分上的融合物。
[0044]如本文所用，“功能性”多肽或“功能片段”是一种大体上保留了至少一种通常与该多肽相关的生物活性(例如，糖转运活性、发酵的增强)的多肽或片段。在一个具体的实施例中，“功能性”多肽或“功能片段”大体上保留了未经修饰的肽所具有的全部活性。对于“大体上保留”生物活性，其意指该多肽保留了至少约20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或更高的天然多肽的生物活性(并且甚至可以具有比天然多肽更高水平的活性)。“非功能性”多肽是一种展示了极少或基本上没有展示通常与该多肽相关的可检测的生物活性的多肽(例如，至多，仅微不足道的量，例如，比10%或甚至比5%少)。使用本领域熟知的以及在此所描述的试验可以测量生物活性，例如糖转运活性和发酵增强。
[0045]对于多核苷酸`编码序列的术语“表达(express)”或“表达(expression)”,其意指该序列被转录、并且可任选地被翻译。典型地，根据本发明，本发明的编码序列的表达将导致本发明的多肽的产生。已表达的多肽或片段的整体未经纯化也可以在完整细胞中起作用。
[0046]如本文所用，术语“迟延时间”，指的是从低聚糖与重组酵母细胞第一次接触的时间到乙醇水平增加第一次被检测出的时间。
[0047]11.表汰AGTl的重纟目酵母
[0048]AGTl是一种酵母蛋白，该酵母蛋白的功能是作为一种普通的α-葡萄糖苷转运体。本发明部分地基于对AGTl变体的发现，当这些变体在酵母中被重组表达时，这些AGTl变体在提高低聚糖发酵生成乙醇的水平和/或比率方面极其有效。
[0049]因此，本发明的一个方面是提供了一种从低聚糖生成乙醇的重组酵母细胞，该重组酵母细胞包括一种编码酵母AGTl多肽的异源多核苷酸；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
[0050]本发明的另一个方面是提供了一种对酵母细胞进行修饰用来在低聚糖的发酵期间减少乙醇生产的迟延时间的方法，该方法包括将一种编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到该酵母细胞中；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDN0:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。在某些实施例中，该减少的迟延时间是与在采用一种不表达本发明中的AGTl多肽的酵母细胞进行发酵的期间的迟延时间相比较的。
[0051]在另一个方面，本发明提供了一种对酵母细胞进行修饰用来在低聚糖的发酵期间增加乙醇生产量的方法，该方法包括将一种编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到该酵母细胞中；其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。在某些实施例中，该增加的乙醇生产量是与在采用一种不表达本发明中的AGTl多肽的酵母细胞进行发酵的期间的乙醇生产量相比较 的。
[0052]MKNIISLVSKKKAASKNEDKNISESSRDIVNQQEVFNTENFEEGKKDSAF 50
[0053]ELDHLEFTTNSAQLGDSDEDNENVINETNTTDDANEANSEEKSMTLKQAL 100
[0054]LIYPKAALWSILVSTTLVMEGYDTALLNALYALPVFQRKFGTLNGEGSYE 150
[0055]ITSQWQIGLNMCVQCGEMIGLQITPYMVEFMGNRYTMITALGLLTAYVFI 200
[0056]LYYCKSLAMIAVGQVLSAMPWGCFQGLTVTYASEVCPLALRYYMTSYSNI 250
[0057]CWLFGQIFASGIMKNSQENLGNSDLGYKLPFALQWIWPAPLMIGIFFAPE 300
[0058]SPWWLVRKDRVAEARKSLSRILSGKGAEKDIQIDLTLKQIELTIEKERLL 350
[0059]ASKSGSFFDCFKGVNGRRTRLACLTWVAQNTSGACLLGYSTYFFERAGMA 400
[0060]TDKAFTFSVIQYCLGLAGTLCSWVISGRVGRWTILTYGLAFQMVCLFIIG 450
[0061]GMGFGSGSGASNGAGGLLLALSFFYNAGIGAVVYCIVTEIPSAELRTKTI 500
[0062]VLARICYNIMAVINAILTPYMLNVSDWNWGAKTGLYWGGFTAVTLAWVII 550
[0063]DLPETSGRTFSEINELFNQGVPARKFASTVVDPFGKGKTQHDSLADESIS 600
[0064]QSSSIKQRELNAADKC 616
[0065](SEQ ID NO:1)
[0066]在某些实施例中，该AGTI多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98%、98.5%、99%, 99.5%或100%的一致性。在一个实施例中，该AGTl多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在另一个实施例中，该AGTl多肽包含SEQ ID N0:3的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
[0067]MKNIISLVSKKKAASKNEDKNISESSRDIVNQQEVFNTENFEEGKKDSAF 50
[0068]ELDHLEFTTNSAQLGDSDEDNENVINETNTTDDANEANSEEKSMTLKQAL 100
[0069]LIYPKAALWSILVSTTLVMEGYDTALLNALYALPVFQRKFGTLNGEGSYE 150
[0070]ITSQWQIGLNMCVQCGEMIGLQITPYMVEFMGNRYTMITALGLLTAYVFI 200
[0071]LYYCKSLAMIAVGQVLSAMPWGCFQGLTVTYASEVCPLALRYYMTSYSNI 250
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[0075]TDKAFTFSVIQYCLGLAGTLCSWVISGRVGRWTILTYGLAFQMVCLFIIG 450
[0076]GMGFGSGSGASNGAGGLLLALSFFYNAGIGAVVYCIVTEIPSAELRTKTI 500
[0077]VLARICYNIMAVINAILTPYMLNVSDWNWGAKTGLYWGGFTAVTLAWAII 550
[0078]DLPETTGRTFSEINELFNQGVPARKFASTVVDPFGKGKTQLIR 593[0079](SEQ ID NO:3)
[0080]该AGTl多肽包含多个功能部位或片段(以及编码这些功能部位或片段的多核苷酸序列)，这些功能部位或片段从N端开始具有至少约590个氨基酸。在某些实施例中，该功能片段的长度可以是大约 590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615 或 616 个氨基酸。
[0081]Han (韩)等人在Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)17:1093 (1995)中描述，已经发现了一种AGTl的等位基因(“Han等位基因”)，该AGTl的等位基因在发酵期间对于乙醇生产的提高是不起作用的。该Han等位基因包含将单个赖氨酸残基插入到SEQ ID NO:1的残基396之后,而且对下述位置的另外的三个氨基酸进行置换:SEQ ID NO:1的位置396处的赖氨酸、位置397处的谷氨酰胺以及位置398处的缬氨酸。在某些实施例中，本发明的AGTl多肽不包含SEQ ID NO:1的残基390-405 (例如残基395-400)处的任何序列变化(添加、删减和/或置换)。在一个实施例中，本发明的AGTl多肽不包含在SEQ ID N0:1的氨基酸396处插入一个或多个氨基酸残基。
[0082]本发明还包括AGTl融合多肽(以及编码这些融合多肽的多核苷酸)。例如，它可能在表达该多肽(或功能片段)中是有用的，作为一种可被市售抗体(例如FLAG基序)识别的融合蛋白或者作为一种可以另外更易被纯化(例如通过添加poly-His尾)的融合蛋白。此外，可以生成增强该多肽的稳定性的融合蛋白，例如包含麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白。作为另一种选择，该融合蛋白可包含一种报道分子。在其他实施例中，该融合蛋白可包含一种多肽，该多肽提供了一种与AGTl多肽的活性相同或不同的功能或活性，例如IE向、结合或酶活性或功能。
[0083]同样，应 当理解的是，在此具体披露的多肽典型地将容许在氨基酸序列中的置换，并可大体上保留生物活性。为了对本发明的多肽(而不是在此具体披露的那些)进行识别，氨基酸置换可以是基于本领域中已知的任何特征的，包括氨基酸侧链置换的相对相似性或差异性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。
[0084]除了在此披露的氨基酸置换以外，可根据下述密码子表，通过改变该DNA序列(或RNA序列)的密码子来完成氨基酸置换。
[0085]
【权利要求】
1.一种发酵低聚糖来生产乙醇的方法，该方法包括将该低聚糖与一种重组酵母细胞进行接触，该重组酵母细胞包括一种编码酵母AGTl多肽的异源多核苷酸； 其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
2.如权利要求1所述的方法，其中该多核苷酸是在一种表达载体中的。
3.如权利要求2所述的方法，其中该表达载体保持为每一个细胞的单拷贝。
4.如权利要求3所述的方法，其中该表达载体包括一个CEN/ARS复制起点。
5.如权利要求2所述的方法，其中该表达载体保持为每一个细胞的多拷贝。
6.如权利要求5所述的方法,其中该表达载体包括一个2μ复制起点。
7.如权利要求1所述的方法，其中该多核苷酸是被整合到该重组酵母细胞的基因组中的。
8.如权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中该AGTl多肽包括SEQID NO:1的氨基酸序列。
9.如权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中该AGTl多肽包括SEQID ΝΟ:3的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中该重组酵母细胞不包括功能性的内源性AGTl基因。
11.如权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中该重组酵母细胞是来自于一种菌株的，该菌株选自下组，该组由以下各项组成:酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝抱酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、Arxula、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)以及亚罗酵母属(Yarrowia)。
12.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中该重组酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
13.如权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中该低聚糖是一种二糖或三糖。
14.如权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中该低聚糖选自下组，该组由以下各项组成:异麦芽酮糖、海藻糖、麦芽糖、潘糖、以及麦芽三糖。
15.如权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该低聚糖是异麦芽酮糖。
16.如权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中该低聚糖是潘糖。
17.如权利要求1-16中的任一项所述的方法，其中该低聚糖是从植物材料中获得的。
18.如权利要求17所述的方法，其中该植物材料来自于玉米、甜菜、高粱或甘蔗。
19.如权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中在与该低聚糖接触的15个小时之内，在发酵期间产生的乙醇量达到了最大值的一半。
20.如权利要求19所述的方法，其中在与该低聚糖接触的10个小时之内，在发酵期间产生的乙醇量达到了最大值的一半。
21.一种对酵母细胞进行修饰用来在低聚糖的发酵期间减少乙醇生产的迟延时间的方法，该方法包括将一种编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到该酵母细胞中； 其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
22.一种对酵母细胞进行修饰用来在低聚糖的发酵期间增加乙醇生产量的方法，该方法包括将一种编码酵母AGTl多肽的多核苷酸插入到该酵母细胞中； 其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
23.如权利要求21或22所述的方法,其中该多核苷酸是在一种表达载体中的。
24.如权利要求23所述的方法，其中该表达载体保持为每一个细胞的单拷贝。
25.如权利要求24所述的方法，其中该表达载体包括一个CEN/ARS复制起点。
26.如权利要求23所述的方法，其中该表达载体保持为每一个细胞的多拷贝。
27.如权利要求26所述的方法，其中该表达载体包括一个2μ复制起点。
28.如权利要求21或22所述的方法，其中该多核苷酸是被整合到该酵母细胞的基因组中的。
29.如权利要求21或22所述的方法，其中该多核苷酸是通过基因渗入而被插入的。
30.如权利要求21-29中的任一项所述的方法，其中该AGTl多肽包括SEQID NO:1的氨基酸序列。
31.如权利要求21-29中的任一项所述的方法，其中该AGTl多肽包括SEQID NO:3的氨基酸序列。
32.如权利要求21-31中的任一项所述的方法，其中该酵母细胞不包括功能性的内源性AGTl基因。
33.如权利要求21-32中的任一项所述的方法，其中该重组酵母细胞是来自于一种菌株的，该菌株选自下组，该组由以下各项组成:酵母菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、Arxula、假丝酵母属、克勒克酵母属以及亚罗酵母属。
34.如权利要求21-33中的任一项所述的方法，其中该重组酵母细胞是酿酒酵母。
35.一种用于从低聚糖生产乙醇的重组酵母细胞，该重组酵母细胞包括一种编码酵母AGTl多肽的异源多核苷酸； 其中该酵母AGTl多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或具有至少约590个氨基酸的其N端片段具有至少98%的一致性。
36.如权利要求35所述的重组酵母细胞,其中该多核苷酸是在一种表达载体中的。
37.如权利要求36所述的重组酵母细胞，其中该表达载体保持为每一个细胞的单拷贝。
38.如权利要求37所述的重组酵母细胞，其中该表达载体包括一个CEN/ARS复制起点。
39.如权利要求36所述的重组酵母细胞，其中该表达载体保持为每一个细胞的多拷贝。
40.如权利要求39所述的重组酵母细胞，其中该表达载体包括一个2μ复制起点。
41.如权利要求35所述的重组酵母细胞，其中该多核苷酸是被整合到该重组酵母细胞的基因组中的。
42.如权利要求35-41中 的任一项所述的重组酵母细胞，其中该AGTl多肽包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。
43.如权利要求35-41中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该AGTl多肽包括SEQIDNO:3的氨基酸序列。
44.如权利要求35-43中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该重组酵母不包括功能性的内源性AGTl基因。
45.如权利要求35-44中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该重组酵母细胞是来自于一种菌株的，该菌株选自下组，该组由以下各项组成:酵母菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、Arxula、假丝酵母属、克勒克酵母属以及亚罗酵母属。
46.如权利要求35-45中的任一项所述的重组酵母细胞，其中该重组酵母细胞是酿酒酵母。
【文档编号】C12P7/06GK103814134SQ201280031043
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2011年6月21日
【发明者】P.E.波蒂里, R.J.哈尔 申请人:先正达参股股份有限公司