选择性抗hla抗体去除装置及其生产方法和用途

选择性抗hla抗体去除装置及其生产方法和用途
【专利摘要】抗MHC去除装置包括与固相支持物共价偶联的具有血清学活性的可溶性MHC部分。生产方法包括将具有血清学活性的可溶性MHC部分共价偶联到固相支持物上。抗MHC去除装置的使用方法包括使生物学样品与装置接触以从生物学样品中去除MHC部分特异性抗体。随后回收生物学样品。
【专利说明】选择性抗HLA抗体去除装置及其生产方法和用途
[0001 ] 有关联邦资助的研究或开发的声明
[0002]不适用。
[0003]发明构思的【背景技术】
1.发明领域
[0004]本发明公开和要求的发明构思总体涉及从样品中去除抗HLA抗体的方法学以及其使用的设备。
[0005]2.【背景技术】描述
[0006]人细胞在其表面表达非常大量的膜结合蛋白，所有这些蛋白都显示各自的特性和生理功能。一些临床方法需要从这大批的表面细胞蛋白中描述人I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)膜结合分子的特征。人I类和II类MHC分子被称为人白细胞抗原或HLA。人I类和II类HLA分子负责将肽抗原呈递给位于T-淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)以及可能地其他免疫效应和调节细胞表面上的受体。MHC I和MHC II分子上肽抗原的展示是识别“自我与非我”的基础以及重要免疫应答如移植排异、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病和正常的抗病毒和抗细菌免疫应答的起始。
[0007]I类和II类HLA分子因人而异。每个人在其细胞表面表达不同的I类和II类补体。出于移植目的，确定细胞上表达的多种HLA中的哪些被另一个个体的抗体识别是很重要的。移植受者中抗HLA抗体的存在可以导致超急性器官排异。常常难以确定许多HLA中的哪些被抗体识别，因为血清可含有非HLA蛋白和多种HLA分子的抗体，而且血清可以在不同HLA分子之间交叉反应。由于存在许多人蛋白、许多HLA蛋白、多种人蛋白的抗体和与各种HLA蛋白交叉反应的抗体，难以·筛选器官移植的患者以确定群体中在待移植的器官上表达的众多HLA中的哪些被抗体识别。由于血液供者的血液中的抗体可能与血液制品受者的I类和II类HLA抗原反应，HLA蛋白的抗体还会在血液制品输血期间引起问题。血液制品中识别受者HLA的抗体会引起输血相关的急性肺损伤(TRALI)。
[0008]I类MHC分子在人类中被命名为I类HLA，其结合肽抗原配体并将之展示在细胞表面上。由I类MHC分子呈递的肽抗原配体源自正常内源蛋白(“自我”)或导入到细胞中的外来蛋白(“非我”)。非我蛋白可以是恶性转化或胞内病原体如病毒的产物。这样，I类MHC分子将有关细胞内部适合度的信息传递给免疫效应细胞，包括但不限于CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其与“非我”肽相互作用后被活化，从而裂解或杀死呈递这种“非我”肽的细胞。
[0009]II类MHC分子在人类中被命名为II类HLA，其也结合肽抗原配体并将之展示在细胞表面上。与在几乎所有有核细胞上表达的I类MHC分子不同，II类MHC分子一般局限于特化的细胞，如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和通过内吞途径从胞外液体中摄入外来抗原的其他抗原呈递细胞。由II类HLA结合并呈递的肽抗原源自胞外外来抗原，如在细胞外部繁殖的细菌的产物，其中此类产物包括由细菌分泌的蛋白毒素或人体免疫系统以保护方式对其产生应答的任何其他细菌蛋白。这样，II类分子将有关胞外易进入的空间中病原体存在的信息传递给展示II类分子的细胞。表达II类HLA的细胞随后将源自胞外抗原/细菌的肽抗原呈递给免疫效应细胞，包括但不限于CD4+辅助性T细胞，从而帮助消除这样的病原体。通过辅助B细胞产生抗微生物以及由这些微生物所产生毒素的抗体以及通过活化巨噬细胞以破坏所摄入的微生物，从而完成这样病原体的消除。
[0010]I类和II类HLA分子显示出由系统重组和点突变事件产生的广泛多态性；因此，在整个世界的人群中存在数百种不同的HLA类型，导致大量的免疫多样性。整个人群中这种广泛的HLA多样性导致个体间组织或器官的移植排异以及对感染性疾病的不同易感性和/或抗性。HLA分子还在自身免疫和癌症上起显著作用。因为，即使并非全部，HLA分子介导大多数适应性免疫应答，并且由于其巨大的多样性，需要大量的单独的HLA蛋白，以有效地研究移植、自身免疫性病症以及用于疫苗的开发。
[0011]识别I类和II类人白细胞抗原(HLA)的抗体目前在器官移植过程的多个阶段中均是不利的。在移植之前，已被致敏而产生HLA特异性抗体的患者通常等待更久以接受移植。移植后，识别供者器官HLA的抗体导致被移植器官的超急性、急性和慢性排异。然而，可能并非所有识别HLA的抗体都促进器官衰竭。因此对抗HLA抗体更透彻的理解将指示出真正对移植不利的那些免疫球蛋白。
[0012]一直以来难以评估任何给定HLA分子的抗体的表型和功能特性，因为抗HLA体液应答倾向于是多克隆抗体并且无法轻易分离这些抗体以进行个体表征。抗体浓度、同种型、表位特异性、交叉反应性和固定补体的能力都被暗示为导致抗HLA抗体致病性的因素(6)。最近，更先进的工具如基于珠的半定量测定已经提供了这些抗体的HLA特异性的更明确指示。然而，人血清的复杂性质和不能对与单独的HLA抗原反应的抗体进行研究使得抗体同种型、浓度和对移植排异的特异性继续不明朗。
[0013]目前的抗体去除方法仅去除广泛特异性的抗体。PROSORBA?(CypressBioscience, San Diego, CA)和后续的IMMUNOSORBA?1 (Fresenius Medical Care,Waltham, MA)产品(以 及其他与之类似的)使用A蛋白结合大范围的抗体。血浆通过IMMUNOSORBA?装置过滤，以从血清中除去大部分IgG抗体。然而，IgG3和IgM以及其他亚型并没有去除。这些现有装置没有提供在“想要的”和“不想要的”抗体之间选择的方法。
[0014]因此，本领域中存在对于从样品中选择性去除抗MHC / HLA抗体的改良的装置以及其生产方法和用途的需求，以克服现有技术的劣势和缺陷。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]本专利或申请文件包含至少一幅彩绘图。在提出请求并且支付必要的费用后，专利局将提供带有彩图的本专利或专利申请公开文本的拷贝。
[0016]图1是按照本发明公开和要求保护的发明构思而产生的可溶性II类HLA三分子复合物的示意性展示。
[0017]图2是按照本发明公开和要求的发明构思而产生(图1的)可溶性II类HLA(II类sHLA)三分子复合物的方法的示意图。
[0018]图3是在中空纤维生物反应器单元中产生II类sHLA三分子复合物的示意图。
[0019]图4图示了在已转染细胞中产生的II类sHLADRBl*0103的产生，表明由T175烧瓶扩大生产规模至中空纤维生物反应器单元(CELLPHARM? )的能力。
[0020]图5图示了市售单克隆抗体(mAb)和患者血清特异性检测图4中产生的sHLADRB1*0103 的能力。
[0021]图6图示了按照本发明公开和要求保护的发明方法从已转染细胞产生多种不同的II类sHLA复合物的能力。
[0022]图7图示了生物反应器中毫克量II类sHLA随时间的产生。
[0023]图8展示了利用电喷雾质谱对II类sHLA DRB*0103 / DRA*0101 (图7中产生的)
的定量。
[0024]图9图解利用电喷雾电离TOF质谱得到的图8的蛋白的分子量结果和分析。
[0025]图10图示了可溶性DRB1*1101ZP II类HLA分子与固相支持物的偶联以及其以ELISA形式辅助去除II类HLA特异性抗体的用途。A图:为了特异性抗体去除而进行的连续吸收基质ELISA的示意图。B图:加到连续吸收基质上的3种不同的II类HLA特异性mAb抗体:L243、0L(0ne Lambda)和2H11的吸收和保留值。
[0026]图11图示了可溶性DRB1*1101以ELISA形式识别DRB1*1101特异性人血清。
[0027]图12图示了可溶性DRB1*1101可以偶联到SEPHAROSE?上并用于吸收H类HLA特异性抗体9.3F10。A图:可溶性DRB1*1101与SEPHAROSE? Fast Flow偶联并被包装入重力柱中。将具有DR反应性的mAb9.3F10过柱并收集流过物作为流分。随后向柱中加入DEA(二乙醇胺)缓冲液(pHll.3)洗脱mAb，并收集流分。B图:还对小鼠总IgG和人总HLA的流过物和洗脱物分别·进行ELISA，以检测可能已经被洗脱下柱的HLA蛋白特异性抗体。
[0028]图13图示了人血清中所含的DRB1*1101特异性抗体可以通过DRB1*1101特异性柱去除。将供者#1血清通过DRB1*1101 SEPHAROSE?柱，并收集流过物的两份2ml流分。将DEA缓冲液(pHll.3)加入柱中洗脱，并收集两份2ml流分。A图:进行直接的DRB1*1101ELISA以检测流过物和洗脱物中残留的DRB1*1101特异性抗体的量。B图:还进行人总IgG夹心ELISA以评估人总IgG的通过情况。
[0029]图14图示了偶联DRB1*1101的SEPHAROSE?:对于DRB1101而非其他DR等位基因是特异的。以与图13相同的方式将供者#2血清通过DRB1*1101柱，并对两份流过物流分和一份洗脱物流分进行多等位基因DR反应性的评估。
[0030]图15描述了 DRA*0101 α链亮氨酸拉链构建体的核酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID Ν0:2)序列。高亮显示的序列编码将DRA1*0101等位基因的序列连接到亮氨酸拉链基序序列的连接子。下划线序列编码亮氨酸拉链基序。
[0031]图16描述了 DRA*0401 β链亮氨酸拉链构建体的核酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQ ID Ν0:4)序列。高亮显示的序列编码将DRA1*0401等位基因的序列连接到亮氨酸拉链基序序列的连接子。下划线序列编码亮氨酸拉链基序。
[0032]图17描述了 DRA*0103i3链亮氨酸拉链构建体的核酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID N0:6)序列。高亮显示的序列编码将DRA1*0103等位基因的序列连接到亮氨酸拉链基序序列的连接子。下划线序列编码亮氨酸拉链基序。
[0033]图18 图解了 sHLA-DRll 的结构。A) a (DRA1*01:01)和 β (DRB1*11:01)链的跨膜域被删除并被7个氨基酸的连接子取代，其后分别接有亮氨酸拉链ACIDpl (LZA)和亮氨酸拉链BASEpl (LZB)。B)成熟DRA1*01:01和DRB1*11:01构建体的氨基酸序列，红色字母表示MS分析所覆盖的序列。下划线字母显示亮氨酸拉链结构域的氨基酸序列。
[0034]图19图解了用sHLA-DRll柱去除和回收L243。A)从sHLA_DRll柱的流过和洗脱所获得流分的A280值。B)经洗脱的L243抗体的II类反应性。显示了每个单独的HLA复合物检测的原始(raw)MFI，该结果通过基因座聚集到一起。
[0035]图20图解了利用sHLA-DRll柱特异性去除抗HLA-DRll抗体。A，B)从两个致敏供者获得的起始血清中的典型II类HLA的反应性(A:供者1，B:供者2)。HLA类型根据基因座以颜色编码(DR11:黑色，其他DR:蓝色阴影，DQ:红色阴影，DP:绿色)。数据以经背景校准的MFI (BCMFI)显示。C，D)对来自供者I(C)和供者2 (D)的柱流过物和洗脱物中流分的抗HLA反应性进行如A和B中的分析。每条曲线显示不同II类HLA类型的反应谱，如图例中所显示。HLA类型如A和B中以颜色编码。
[0036]图21图解了补体和非补体固定的抗体的去除。A)利用抗HLA-DRll抗体对HLA-DRll阳性细胞(C433、C418、C428、C423)进行补体依赖性细胞溶解。如材料和方法中所描述计算细胞死亡平均值。起始血清显示为蓝色，流过物为红色，洗脱物为绿色。误差条代表3次独立实验的标准差。利用Turkey posthoc测试通过单因素ANOVA (方差分析)显示并确定平均值的显著性差异(p〈0.05)。B)用于A中定量分析的代表性荧光显微镜图像。死亡细胞是红色(嗅化乙锭)，有活力的细胞是绿色(吖啶橙)。
[0037]图22图解了经纯化的抗HLA-DRll抗体的同种型谱。利用基于LUMINEX?的ELISA对起始血清、流过物和洗脱物中的抗体同种型谱进行定量并将其表示为抗体总量的百分比。
[0038]图23图解了抗HLA-DRll抗体从敏化血清中的去除。利用单抗原珠测定对来自两个敏化供者的起始血清的II类反·应性进行测试。血清通过sHLA-DRll柱后，利用相同的II类单抗原珠测定对柱的流过物和洗脱物进行测试。
[0039]图24图解了两种不同的SEPHAROSE?基质与I类可溶性HLA的偶联效率。将Img sHLA-B加入到Iml经CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基质中。偶联反应I小时后终止。利用以下等式计算偶联效率:偶联效率=起始sHLA (mg) /偶联后溶液中的sHLA(mg)。
[0040]图25图解了两种不同的SEPHAROSE?基质对于I类可溶性HLA的结合能力。饱和量的泛I类HLA单克隆抗体W6 / 32在Iml已偶联的基质(ImgOlmg / ml)上流过。基质是经CNfc活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基质。本实验中使用的sHLA是sHLA-B*07:02。通过测量洗脱中回收的抗体量确定结合能力。为了根据偶联效率的变化进行调整，数据显示为洗脱中每mg偶联到基质上的sHLA对应的W6 / 32的量(yg)。
[0041]图26图解了装载I类可溶性HLA的两种不同的SEPHAROSE?基质的再生能力。饱和量的泛I类HLA单克隆抗体W6 / 32在Iml已偶联的基质(lmg@lmg/ml)上流过。基质是经CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基质。随后如x轴所示使柱连续装载并洗脱5次。显示了每个循环的初始(循环I)抗体结合能力的百分比。
[0042]图27图解了两种不同的SEPHAROSE?基质与II类可溶性HLA的偶联效率。将Img sHLA-DRll 加入到 Iml 经 CNBr 活化的或 NHS 活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow 基质中。偶联反应I小时后终止。利用以下等式计算偶联效率:偶联效率=起始sHLA (mg) /偶联后溶液中的sHLA(mg)。
[0043]图28图解了两种不同的SEPHAROSE?基质对于II类可溶性HLA的结合能力。饱和量的泛HLA-DR单克隆抗体L243在Iml已偶联的基质(ImgOlmg / ml)上流过。基质是经CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基质。本实验中使用的sHLA是sHLA-DRll。通过测量洗脱中回收的抗体量确定结合能力。为了根据偶联效率的变化进行调整，数据显示为洗脱中每mg偶联到基质上的sHLA对应的L243的量(μ g)。
[0044]图29图解了装载有II类可溶性HLA的两种不同SEPHAROSE?基质的再生能力。饱和量的泛HLA-DR单克隆抗体L243在Iml已偶联的基质(ImgOlmg / ml)上流过。基质是经CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基质。随后如x轴所示使柱连续装载并洗脱5次。显示了每个循环的初始(循环I)抗体结合能力的百分比。
[0045]图30图解了利用I类HLA SHARC (可溶性HLA抗体去除柱)从PBS中清除单克隆抗HLA抗体。饱和量的泛I类HLA单克隆抗体W6 / 32在65ml已偶联的基质(以97 μ tg /ml的24.4mg)上流过。随后用PBS(pH7.4)清洗柱并用0.1M甘氨酸(pHll)洗脱。在装载和清洗期过程中，11.7mg通过柱子。在洗脱期过程中，回收了 8mg抗体。
[0046]图31图解了利用I类HLA-A2SHARC从患者血浆中清除抗HLA-A2多克隆抗体。`
2.5L含有抗HLA抗体的患者血浆在65ml sHLA_A2SHARC上流过。利用如生产商(LABScreenSingle Antigen, Onelambda, Inc., Canoga Park, CA)所描述的多重的基于LUMINEX?的检测方法对SHARC前和SHARC后的血浆进行分析。如图例中所示，该个体具有多种HLA特异性。如附图中所显示，抗HLA-A2抗体以及血清学相关抗体(B57、B58)从初始血浆中减少。血清学不相关的抗HLA抗体(B61、B81、B18、B60)通过SHARC，与SHARC前血浆中相比未改变。这表明HLA-A2SHARC的特异性。
[0047]图32图解了利用HLA-A2-SHARC从患者血清中清除多克隆抗HLA-A2抗体。2.5L含有抗HLA抗体的患者血浆在65ml sHLA_A2SHARC上流过。随着血浆通过SHARC，收集流分。利用如生产商所描述的多重的基于LUMINEX?的检测方法对所得流分进行分析。数据表示为BCMFI减少的百分比BCMFI减少=1_(流分的BCMFI /起始血清的BCMFI))。
[0048]图33图解了利用II类HLA SHARC (可溶性HLA抗体去除柱)从PBS中清除单克隆抗HLA抗体。饱和量的泛HLA-DR单克隆抗体L243在65ml已偶联的基质(30.0mgil20y g /ml)上流过。随后用PBS(pH7.4)清洗柱并用0.1M甘氨酸(pHll)洗脱。在装载和清洗期过程中，2mg通过柱。在洗脱期过程中，回收了 23.1mg抗体。
[0049]图34图解了利用HLA-DRl ISHARC从患者血浆中清除多克隆抗HLA-DRl I抗体。2.5L含有抗HLA抗体的患者血浆在65ml sHLA_DRllSHARC上流动。利用如生产商(LABScreen Single Antigen, Onelambda, Inc., Canoga Park, CA)所描述的多重的基于LUMINEX?的检测方法对SHARC前和SHARC后的血浆进行分析。如图例中所示，该个体具有多种HLA特异性。如附图中所显示，抗HLA-DRll抗体以及血清学相关抗体(DR13、DR4、DR17)从初始血浆中减少。血清学不相关的抗HLA抗体(DQ7、DQ8、DQ9)通过SHARC，与SHARC前血浆相比未改变。这表明HLA-DR11SHARC的特异性。[0050]图35图解了利有HLA-DRl ISHARC从患者血清中清除抗HLA-DRl I多克隆抗体。
2.5L含有抗HLA抗体的患者血浆在65ml sHLA-DRIISHARC上流过。随着血浆通过SHARC，收集流分。利用如生产商所描述的多重的基于LUMINEX?的检测方法对所得流分进行分析。数据表示为BCMFI减少的百分比BCMFI减少=1-(流分的BCMFI /起始血清的BCMFI))。
[0051 ] 图36图解了可溶性I类HLAA*0201与NHS活化的SEPHAROSE? Fast FlowMatrix柱的偶联效率。
[0052]图37图解了基于吸收单位(mAU)评估图36的柱图谱以检测蛋白质物质的可重复性研究。
[0053]图38图解了基于pH评估图36的柱图谱的可重复性研究。
[0054]图39图解了基于电导率评估图36的柱图谱以检测缓冲液相的变化的可重复性研究。
[0055]图40-42图解了图36的柱的稳定性评估，其中利用W6 / 32对柱进行了的多轮装载-洗脱-平衡的循环。
[0056]图43图解了利用不同量的W6 / 32评估图36的柱的容量。
[0057]图44图解了利用不同量的抗β 2m评估图36的柱的容量。
[0058]图45图解了利用不同量的抗VLDL (针对导入A*0201分子的人工尾部的抗体)评估图36的柱的容量。
[0059]图46图解了利用W6 / 32评估图36的柱的结合效率。
[0060]图47图解了利用抗β 2m评估图36的柱的结合效率。
[0061]图48图解了利用抗VLDL评估图36的柱的结合效率。
[0062]图49图解了根据本发明公开和要求保护的发明构思的一个【具体实施方式】所推荐的应用方案。
[0063]发明详述
[0064]在通过示例性附图、实验、结果和实验室方法的方式详细解释本发明构思的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明构思在其应用中不限于以下描述中所示或者附图、实验和/或结果中所阐述的构建详述和组分排列。本发明构思可以是其他实施方案或者能够以多种方式实践或实施。同样地，本文中所使用的语言意在给出可能的最广义的范围和意义；并且实施方案意在示例而非穷举。此外，要理解的是，本文中使用的措词和术语是出于描述的目的，其不应当被视为是限制性的。
[0065]除非本文中另有定义，与本发明公开和要求保护的发明构思关联使用的科学性和技术性术语具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。此外，除非上下文另有需要，单数术语包括复数形式，复数术语包括单数形式。一般来讲，本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡聚或多核苷酸化学以及杂交关联使用的专业名词和上述学科的技术是本领域熟知和普遍使用的。用标准技术进行重组DNA、寡聚核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)中。酶促反应和纯化技术依照生产商的说明书或如本领域普遍实现的或如本文中所描述而进行。上述技术和方法一般依照本领域熟知的常规方法以及如本说明书引用和讨论的多篇综合的且更具体的参考文献中所描述而进行。参见例如Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)和 Coligan 等人 Current Protocolsin Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994)),其通过引用并入本文。与本文中描述的分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学关联使用的专业名词以及上述学科的实验室方法和技术是本领域熟知和普遍使用的那些。用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗中。
[0066]本说明书中提及的所有专利、已公开的专利申请和非专利出版物是指示本发明公开和要求保护的发明构思所属领域的技术人员的技术水平。本申请任何部分中引用的所有专利、已公开的专利申请和非专利出版物作为整体通过引用明确地并入本文，其程度与每个单独的专利或出版物特别地并且单独地通过引用而并入相同。
[0067]根据本文公开的内容，无需过度的实验，即可制备和实施本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法。虽然已经以优选实施方案的方式对本发明的组合物和方法进行了描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文中描述的组合物和/或方法以及在方法的步骤中或步骤顺序进行改变。所有这种类似的替代和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，其被视为属于由所附权利要求所限定的本发明构思的精神、范围和构思。
[0068]如根据本文公开的内容所使用，除非另有说明，以下术语应当被理解为具有以下含义:
[0069]当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”关联使用时，词语“一个(a) ”或“一个(an)”的使用可以意指“一个”，但是其还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。尽管本文公开的内容支持仅指替代物以及“和/或”的定义，但是权利要求中术语“或者”的使用是用于意指“和/或”，除非明确说明仅指替代物或者替代物是互斥的。贯穿本申请，术语“大约”用于表示数值包括设备、确定数值所使用方法的误差的内在差异或者研究对象之间存在的差异。例如·但是不以限制的方式，当使用术语“大约”时，所指的数值可以以加或减12%、或11%、或10%、或9%、或8%、或7%、或6%、或5%、或4<%、或3%、或2(%、或I %而变化。术语“至少一个”的使用理解为包括一个以及多于一个的任意数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等。术语“至少一个”可以扩展至100或1000或更多，这取决于其所附的术语；此外，100 / 1000的数量不被认为是限制性的，因为更高的限值也可以产生满意的结果。此外，术语“X、Y和Z的至少一个”理解为包括单独的X、单独的Y和单独的Z以及X、Y和Z的任意组合。序号术语(即“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅仅是出于区分两个或多个术语的目的，并不意味着暗示例如任何顺序或次序或者一个术语的重要性超过另一个或者加入的任何次序。
[0070]如本说明书和权利要求中所使用，词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，例如“comprise”和“comprises” )、“具有(having) ” (和具有的任何形式，例如“have”和“has”)、“包括(including) ” (和包括的任何形式,例如“includes”和“include”)、或者“含有(containing)”(和含有的任何形式,例如“contains”和“contain”)是包括性的或者开放式的，其不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。
[0071 ] 如本文中所使用，术语“或其组合”是指术语前面所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”是指包括以下至少一种:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及如果在特定上下文中次序是重要的，还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB, BAC或CAB。继续该示例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA,CABABB等。除非从上下文另外是清楚的，本领域技术人员会理解通常对于以任意组合的项目或术语的数量没有限制。
[0072]如本文中所使用，“基本上是纯的”意指目标种类是所存在的主要种类(即在分子基础上，其比组合物中任何其他的单独的种类丰富)。一般基本上是纯的组合物将包含多于50%百分比的存在于组合物中的所有大分子种类，例如多于大约55 %、60%、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、95%和99%。在一个实施方案中，目标种类被纯化至基本同质(通过常规检测方法不能检测出组合物中的污染物种类)，其中所述组合物基本上由单一的大分子种类组成。
[0073]如本文中所使用，术语“分离的多核苷酸”和“分离的核酸区段”意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其一些组合，其中根据其来源，“分离的多核苷酸”或“分离的核酸区段”:(1)与“分离的多核苷酸”或“分离的核酸区段”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分不相关，(2)与天然情况下不与其连接的多核苷酸可操作地连接，或者(3)不会作为较大序列的一部分天然出现。
[0074]术语“分离的蛋白质”在本文中意指基因组、cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白质或其一些组合，其中根据其来源或衍生来源，“分离的蛋白质”(1)与天然发现的蛋白质不相关联，⑵不含来自相同来源的其他蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，⑶由来自不同物种的细胞表达，或者(4)不会天然存在。
[0075]如本文中所使用，术语“多肽”是通用术语，是指天然蛋白、片段、或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白、片段和类似物是多肽类的种类。
[0076]如本文中所使用，对于客体所应用的术语“天然存在的”是指客体可以天然存在的事实。例如，生物体(包括病毒)中存在的、能够从天然来源中分离以及未在实验室中经人为或其他故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然发生的。
[0077]术语“抗体”以最广义使用`，并且特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(例如Fab、F(ab’)2和Fv)，只要其显示出期望的生物学活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特性的糖蛋白。抗体显示出对特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他类抗体分子。后一种类型的多肽由例如淋巴系统以低水平和由骨髓瘤以增加的水平产生。
[0078]“抗体”或“抗体肽”是指完整的抗体或者与完整抗体竞争特异性结合的其结合片段。结合片段通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割而产生。结合片段包括Fab、Fab’、F (ab’ )2, Fv和单链抗体。除了 “双特异性”或“双功能性”抗体之外，抗体理解为具有同一结合位点。抗体基本上抑制受体粘附到反受体(counterreceptor)上,其中过量的抗体使与反受体结合的受体的量减少至少大约或80%，并且通常多于大约85% (如体外竞争性结合试验中所测量)。
[0079]如本文中所使用，术语“MHC”理解为主要组织相容性复合物，其被定义为特异于主要组织相容性抗原的一组基因座位。如本文中所使用，术语“HLA”理解为人白细胞抗原，其被定义为人中发现的主要组织相容性抗原。如本文中所使用，“HLA”是人形式的“MHC”。
[0080]如本文中所使用，术语“ I类MHC轻链”和“ I类MHC重链”理解为I类MHC分子的一部分。从结构上来讲，I类分子是由两条非共价结合的多肽链组成的异源二聚体，一条较大的“重”链(α )和一条较小的“轻”链(β -2-微球蛋白或β 2m)。在第6号染色体上MHC内编码的多态性多基因重链(45kDa)被细分为3个胞外结构域(命名为1、2和3)、1个胞内结构域和I个跨膜结构域。两个最外侧的胞外结构域I和2共同形成结合抗原性肽的槽。因此，与TCR的相互作用发生在蛋白的这一区域。分子的第3胞外结构域含有CTL上⑶8蛋白的识别位点；这种相互作用用于稳定T细胞和APC之间的接触。在第15号染色体上MHC外部编码的保守的轻链(12kDa)包括单独的胞外多肽。术语“I类MHC轻链”、“β-2-微球蛋白”和“ β 2m”在本文中可以互换使用。I类重链和轻链的关联对于I类分子在细胞膜上表达是必需的。
[0081]同I类MHC分子一样，II类分子也是异源二聚体，但是其由两条接近同源的α和β链组成，二者均编码于MHC中。II类MHC分子是膜结合糖蛋白，α和β链均含有外部结构域、跨膜锚定区段和胞质区段。II类分子中的每条链含有2个外部结构域:33kDa的α链含有α:和α 2外部结构域，而28kDa的β链含有β i和β 2外部结构域。同I类重链分子邻近膜的第3胞外结构域一样，邻近膜的％和@2结构域与免疫球蛋白折叠结构域结构具有序列同源性。II类分子的远离膜的结构域由\和P1结构域组成，其形成经加工的肽抗原的抗原结合缝(cleft)。由II类分子呈递的肽衍生自胞外蛋白(不是如I类中细胞溶质的胞内肽抗原)；因此，II类MHC依赖性抗原呈递途径被称为内吞或外源途径。II类分子的装载仍然必须在细胞内部发生；胞外蛋白被内吞，在溶酶体中消化，与II类MHC分子结合，随后分子迁移至质膜。由于II类MHC分子的肽结合槽是两端开放的而I类分子上的相应槽在每个末端是封闭的，由II类MHC分子呈递的肽较长，一般长度在13和24个氨基酸残基之间。同I类HLA—样，与II类分子结合的肽通常具有内部保守的“基序”，但是与I类结合肽不同，其在羧基末端缺少保守基序，因为末端开放的结合缝使所结合的肽可以从两个末端延伸。
[0082]如本文中所使用，术语“三分子复合物”理解为与肽关联的MHC异源二聚体。“I类MHC三分子复合物”或“I类HLA三分子复合物”理解为包括相关联的I类重链和轻链并且具有其抗原结合槽中展示的肽 。术语“II类MHC三分子复合物”和“II类HLA三分子复合物”理解为包括相关联的II类α和β链并且具有其抗原结合槽中展示的肽。
[0083]如本文中所使用，术语“MHC基序”理解为包括I类MHC三分子复合物、II类MHC三分子复合物和I类/ II类MHC分子的任何部分或亚基。
[0084]如本文中所使用，术语“生物学样品”理解为包括但不限于血清、组织、血液、血浆、脑脊髓液、泪液、唾液、淋巴、透析液、器官或组织培养衍生液以及从生理组织中提取的液体。如本文中所使用，术语“生物学样品”还理解为包括这类液体的衍生物和流分以及其组合。例如，术语“生物学样品”还理解为包括复杂的混合物。
[0085]如本文中所使用，术语“HLA蛋白”将被理解为能够在非人类细胞表面上表达的任何HLA分子、其复合物或其片段。可以根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的HLA蛋白的示例包括但不限于I类HLA三分子复合物、II类HLA三分子复合物、II类HLA α链和II类HLAii链。可以根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的II类HLAa和/或β蛋白的特定示例包括但不限于以下基因座位处编码的=HLA-DRA ；HLA-DRBI ;HLA_DRB3、
4、5 ；HLA-DQA ；HLA-DQB ；HLA-DPA 和 HLA-DPB。[0086]如本文中所使用，术语“哺乳动物细胞”理解为能够表达重组HLA蛋白(如上文所定义)的任何细胞。因此，根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的任何“哺乳动物细胞”必须含有在这种细胞表面上表达MHC / HLA蛋白和/或MHC / HLA三分子复合物所需的必需的机构(machinery)和运输蛋白。根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的“哺乳动物细胞”必须具有㈧伴随和装载MHC / HLA蛋白例如I类和II类蛋白的机构；和(B)该机构必须能够与人HLA蛋白例如I类和II类蛋白相互作用且共同工作。并非所有细胞表达II类MHC蛋白；仅仅专职的免疫细胞例如但不限于树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞等表达II类蛋白。因此，要在非人类哺乳动物细胞中表达HLA II类蛋白时，这种非人类细胞必须表达该物种的II类MHC并且含有用于与那个物种的II类MHC以及人II类HLA相互作用且共同工作的适宜的机构。然而，本发明公开和要求保护的发明构思还包括已经被诱导表达II类MHC(例如但不限于细胞因子)的其他品系细胞和已经进行突变的细胞等的用途、。
[0087]如本文中使用的术语“哺乳动物细胞”是指永生化的哺乳动物细胞系并且不包括动物或原代细胞。可以根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的“哺乳动物细胞”的示例包括但不限于人和小鼠DC系、巨噬细胞系和B细胞系。
[0088]MHC (主要组织相容性复合物)或II类HLA (人白细胞抗原)分子仅在少数几种特化的细胞类型中发现，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，所有这些均是专职的抗原呈递细胞(APC)。由II类分子呈递的肽衍生自胞外蛋白(不是如I类中细胞溶质的)；因此II类MHC依赖性抗原呈递途径被称为内吞或外源途径。II类分子的装载仍然必须在细胞内部发生；胞外蛋白被内吞，在溶酶体中消化，与II类MHC分子结合，随后分子迁移至质膜。
[0089]同I类MHC分子一样，II类分子也是异源二聚体，但是其由两条同源肽α和β链组成，二者均编码于MHC中。II类分子由两条多肽链组成，均由D区域编码。这些多肽(α和β)长度分别大约为230和240个氨基酸并且是糖基化的，分子量大约为33kDa和28kDa。这些多肽折叠成两个分离的结构域，α多肽为α-l和α-2，β多肽为β-1和β_2。在α-l和β-1结构域之间存在非常·类似于见于I类分子上的区域。该区域在底部与β折叠片并且在侧面与2个α螺旋结合，其能够结合(经由非共价相互作用)小肽。由于II类MHC分子的抗原结合槽是两端开放的而I类分子上的相应槽在每个末端是封闭的，所以由II类MHC分子呈递的抗原较长，一般长度在15和24个氨基酸残基之间。这种小肽被“呈递”给T细胞并且限定T细胞识别的抗原“表位”。
[0090]现在转至本发明公开和要求保护的发明构思，本文中公开和要求保护抗MHC抗体去除装置以及含有其的试剂盒和其生产方法及用途。如本文下面更详细地描述，本文中描述的装置/试剂盒可以用于多种临床、诊断和治疗方法。抗MHC抗体去除装置包括与固相支持物共价偶联的可溶性MHC部分(moiety)。与固相支持物连接的可溶性MHC部分是具有血清学活性的，这使得可溶性MHC部分保持天然MHC三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。当生物学样品与抗MHC抗体去除装置相接触，MHC基序特异性抗MHC抗体附着到可溶性MHC部分上并且被检测和/或从生物学样品中去除。
[0091]可溶性MHC部分可以是通过本领域已知的任何方法或者本文中涉及的其他方法产生的I类或II类可溶性MHC部分。在某些实施方案中，可溶性MHC部分是I类或II类可溶性HLA部分。可以根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的I类可溶性HLA部分的非限定性示例(以及其生产和纯化方法)公开于1999年12月17日提交的美国系列案第09/465，321号、2011年12月18日提交的美国系列案第10/022，066号(2003年9月4日公开的美国公开案第2003/0166057号)和2011年I月2日提交的美国系列案第10/337，161号(2033年10月9日公开的美国公开案第2003/0191286号)中。上面引用的专利申请的全部内容在此通过引用明确地并入本文。可以根据本发明公开和要求保护的发明构思使用的II类可溶性HLA部分的非限定性示例(以及生产方法和其纯化)公开于2010年8月18日提交的专利申请美国系列案第12/859,002号中以及本文下面进一步详述中。
[0092]在某些实施方案中，MHC / HLA基本上从其他蛋白中纯化出来，这样单独的MHC /HLA三分子复合物保持天然MHC / HLA三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。具有功能活性的单独的MHC / HLA三分子复合物可以如本文中所描述或者通过本领域已知的任何其他方法纯化。连接到固相支持物上后，具有功能活性的单独的MHC / HLA三分子复合物维持构象。
[0093]可以使用能够共价连接MHC / HLA部分并且能够根据本发明公开和要求保护的发明构思另外发挥功能的任何固相支持物。在某些实施方案中，固相支持物可以选自由管(well)、珠(例如但不限于流式细胞术珠和/或磁珠)、膜(例如但不限于硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜和乙酸酯衍生物)、微量滴定板、基质(例如SEPHAROSE?基质)、孔、塑料、玻璃、聚合物、多糖、尼龙、硝酸纤维素、顺磁性化合物及其组合组成的组中。能够根据本发明公开和要求保护的发明构思发挥功能的固相支持物的非限定性示例包括具有入口、出口和置于其间的空腔的装置。空腔含有放置具有血清学活性的可溶性MHC部分的内表面，设置入口将生物学样品导入室中。随着生物学样品流过装置，具有血清学活性的MHC部分的特异性抗MHC抗体附着其上并从生物学样品中清除。从出口收集到的流过物基本上不含具有血清学活性的MHC部分的特异性抗MHC抗体。该类型装置的非限定性示例包括人用装置(human use devices, HUD),例如体外血衆置换HUD。
[0094]在某些实施方案中，经NHC活化的SEPHAROSE?基质用作固相支持物。该基质通过其伯胺基团共价连接到经NHS (N-羟基琥珀酰亚`胺)活化的基团上以形成非常稳定的酰胺键合而固定蛋白质。这是本文中描述的装置和方法用于治疗用途的重要性质，因为其防止治疗过程中已固定的MHC / HLA复合物从基底/固相支持物上分离(例如但不限于装置用作体外装置的用途)，分离这些分子(以及其片段区段和/或亚基)会对患者造成有害影响。除了稳定性增加之外，经NHC活化的SEPHAROSE?:基质还展现出结合能力增加，这是由于其中存在的14个原子的间隔臂而引起的，所述间隔臂使MHC / HLA在必要时可以重新定位，并且因而提供与抗体更好的接触。
[0095]在某些其他实施方案中，使用其他偶联连接。其他连接类型的非限定性示例包括糖化学、羧基连接、硫连接或本领域已知的任何其他连接化学类型或本领域普通技术人员可利用的可以使MHC基序偶联到固相支持物上的其他类型。
[0096]在某些实施方案中，本发明公开和要求保护的发明构思利用通过本文中上面引用的美国专利/专利申请中所描述的方法产生的可溶性I类HLA三分子复合物。在一个非限定性示例中，提供了基本上从其他蛋白质中纯化出来的可溶性I类HLA三分子复合物，其保持天然I类MHC三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。所述三分子复合物包含重组的单独的可溶性I类MHC重链分子、β -2-微球蛋白非共价连接的单独的可溶性I类MHC重链分子和单独的可溶性I类MHC重链分子的抗原结合槽中内源性装载的肽。这些分子通过提供编码所期望单独的I类MHC重链的核苷酸区段而产生，所述核苷酸区段中去除了编码所期望单独的I类MHC重链等位基因的胞质和跨膜结构域的编码区，这样所述核苷酸区段编码截短的可溶形式的所期望单独的I类MHC重链分子。该核苷酸区段可以合成产生，或者其可以通过截短的等位基因的座位特异性PCR扩增(或者从由分离自来源的mRNA反转录生成的cDNA中，或者直接从gDNA中)而产生。接着将核苷酸区段克隆到哺乳动物表达载体中，从而形成编码所期望单独的可溶性I类MHC重链分子的构建体。接着用构建体转染哺乳动物细胞系，以提供表达编码重组的单独的可溶性I类MHC重链分子的构建体的哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞系能够天然地将蛋白质加工成肽配体以装载到MHC分子的抗原结合槽中，并且其中所述哺乳动物细胞系表达β -2-微球蛋白。接着在允许表达来自所述构建体的重组的单独的可溶性I类MHC重链分子的条件下培养哺乳动物细胞系，这种条件还允许肽配体内源性装载到每个重组的单独的可溶性I类MHC重链分子的抗原结合槽中并与天然的内源性产生的β-2-微球蛋白的非共价连接，以形成单独的可溶性I类MHC三分子复合物并随后从细胞中分泌单独的可溶性I类MHC三分子复合物。接着从培养基中收获可溶性I类MHC三分子复合物，同时继续培养哺乳动物细胞系以产生更多的可溶性I类MHC三分子复合物，并将单独的可溶性I类MHC三分子复合物从其他蛋白质中基本上纯化出来，其中所述单独的可溶性I类MHC三分子复合物保持天然I类MHC三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性，并且其中经如此纯化的每个三分子复合物包含相同的重组的单独的可溶性I类MHC重链分子。
[0097]在其他实施方案中，本发明公开和要求保护的发明构思使用由本文中描述的方法产生的可溶性II类HLA三分子复合物，所述方法在纯化、定量和应用领域有超越现存方法的进步，这些方法以使哺乳动物宿主细胞分泌蛋白质的方式利用重组DNA方法改变蛋白质。天然地，II类HLA以内源性装载肽配体并且结合到膜上的三分子复合物形式产生。目前主要通过聚集膜结合形式获得这种经天然加工和装载的II类。膜结合II类的产生需要裂解细胞群以获得复合物。该方法被称为细胞裂解法，其代表了用于抗HLA抗体测定的天然哺乳细胞HLA产生的现有技术水平。II类的细胞裂解产物是大量细胞表面组分的混合物，包括膜锚定的II类HLA三·分子复合物以及散布于细胞膜中和与HLA共纯化的其他非HLA蛋白。从其他细胞碎片和膜蛋白中分离HLA减少了 II类HLA的产量。当从表面活性剂裂解物中产生II类HLA时，面临着会污染细胞表面蛋白和/或II类蛋白产量低的问题。作为替代，II类HLA可以从果蚬(Drosophila) Schneider S_2 (昆虫)细胞系(Novak等人，1999 ;和2006年8月22日颁给Kwok等人的美国专利第7，094, 555号)和毕赤酵母(P.pastoris)(酵母)(Kalandadze等人，1996)中获得，由此产生了 II类HLA分子的可溶形式。然而，昆虫细胞中产生的II类缺少内源性装载的肽，其是天然II类HLA三分子复合物基本组分。昆虫细胞中产生的HLA分子还缺少哺乳动物细胞的天然糖基化。由于昆虫细胞缺少哺乳动物蛋白质糖基化机制并且缺少装载天然肽配体所需的分子伴侣复合物，临床应用中使用来自昆虫的II类蛋白有些勉强。
[0098]因此，本发明公开和要求保护的发明构思的某些实施方案使用从哺乳动物细胞中分泌产生的II类HLA的方法产生没有被膜蛋白污染的天然三分子复合物。通过从哺乳动物细胞中分泌II类HLA，产生了其中主要类型是所期望II类HLA三分子复合物的纯产物。纯的分泌分子简化下游纯化并且使其能够进行。可溶性HLA复合物有利于中空纤维生物反应器生产系统，例如但不限于CELL PHARM?系统(McMurtrey等人,2008 ;Hickman等人，2003和Prilliman等人，1999)以及设计用于从哺乳动物细胞中分泌重组天然蛋白质的其他系统。高度浓缩的收获物比细胞裂解物“干净”得多，因而由于简化了纯化步骤而使产物损失最小化。
[0099]本发明公开和要求保护的发明构思的其他实施方案可以利用已通过细胞裂解方法产生和纯化的天然形式的II类HLA三分子复合物；然而，由这些现有技术方法所生产的复合物会有不同量的细胞膜紧缚在纯化的HLA产物上，从而会对产生同质HLA产物带来一些挑战以及出现一些与其应用相关的问题。
[0100]本发明公开和要求保护的发明构思包括可溶性II类HLA三分子复合物的用途，其通过以独特和新颖的方式解决当使用细胞裂解和昆虫细胞技术时的局限性的方法在哺乳动物细胞中产生(图2阐述了生产方法，而图1表示由所述方法产生的sHLA三分子复合物)。该生产方法通过使用以下要素的组合克服了现有技术的劣势和缺陷:第一，II类HLA复合物的每条α和β链均被截短，通过重组DNA技术去除正常情况下将复合物锚定在细胞表面的结构域。天然形式的II类HLA三分子复合物α和β链依赖跨膜结构域保持天然构象。尽管该跨膜结构域的去除有利于分泌，然而这种去除妨碍三分子复合物的形成。该sHLA生产方法去除了跨膜结构域，并用超二级结构基序(例如但不限于亮氨酸拉链蛋白质序列)将其替换，所述基序用作II类α和β链的系带部分(tethering moiety)。该超二级结构基序(例如但不限于亮氨酸拉链)由此在蛋白质之间产生粘附或融合力。
[0101]该SHLA生产方法可以进一步包括在哺乳动物细胞系中重组生产所期望II类HLA的可溶性α和β链。重组哺乳动物细胞系的使用具有超越现有技术的两个明显的优势:第一，在哺乳动物细胞系中进行生产使得II类HLA分子的α和β链以与天然II类HLAa和β链中所见的相同方式被糖基化。第二，哺乳动物细胞系含有用于天然内吞作用和溶酶体消化的适当的机构以产生与由天然细胞所产生的(在本文中被称为“内源性产生的肽配体”)相同的肽配体，以及用于将内源性产生的肽配体运输和装载至II类HLA分子α和β链之间形成的抗原结合槽中 的适当的分子伴侣机构。
[0102]因此，(a)经糖基化的可溶性II类HLAa和β链、(b)在非人类哺乳动物细胞系中(或不表达内源性II类分子的人类细胞系中)的生产以及(C)非共价连接的内源性产生的肽配体的性质带来了明显的进步，这些进步克服现有细胞裂解和非哺乳动物细胞生产方法中的劣势和缺陷。
[0103]内源性装载的II类是区别于现有技术的关键因素。内源性肽使II类三分子复合物可以用于多种应用中，此前，以现有技术的可溶形式(美国专利第7094555号，先前通过引用并入本文；Novak等人，1999以及Kalandadze等人，1996)是不可能的。对于本发明要求保护的应用方法，只有以其天然三分子复合物形式存在的II类HLA能够恰当地结合II类HLA特异性抗体。类似地，当用于HLA特异性抗体检测或T细胞征集时，非糖基化HLA分子对II类抗体表位构象的作用是未知的，但是有不恰当的糖基化干扰抗原呈递的一些证据(Guerra等人，1998)。因此，产生II类HLA的最有利形式是使所有组分保持天然形式。据显示，属于I类复合物一部分的肽会间接影响HLA特异性抗体的识别(Wilson，1981)。当在HLA抗体血清筛查/移除测定中使用本文中所描述和要求保护的sHLA作为抗原时，HLA特异性抗体的天然结合是本发明公开和要求保护的发明构思的关键因素。
[0104]在某些实施方式中，本发明公开和要求保护的发明构思利用了由下文所述方法产生的sMHC / sHLA。在该方法中，提供了第一分离的核酸区段，其中所述第一分离的核酸区段编码至少一个II类HLA分子的α链的可溶形式，并且提供了第二分离的核酸区段，其中所述第二分离的核酸区段编码至少一个II类HLA分子的β链的可溶形式。分离的核酸区段可以存在于单独的重组载体中，或者两个独立的重组载体中。编码α链和β链的跨膜结构域的编码区域已经去除，并用使α链和β链(先前是通过其跨膜结构域相互作用)能够相互作用的超二级结构基序替换。
[0105]可以通过本领域已知的任意方法提供分离的核酸区段，包括商业生产合成的区段。在一个实施方式中，可以通过一种方法提供分离的核酸区段，该方法包括从基因组DNA或cDNA中对α链和β链等位基因进行PCR扩增的步骤。获取用于MHC PCR扩增的gDNA或cDNA的方法详细描述于发明人早期的申请中:2001年12月18日提交的美国系列申请第10/022066号，并于2003年9月4日以US2003/0166057A1公开以及2009年4月21日发行的美国专利第7，521，202号，其全部内容在此通过引用明确地并入本文。因此，尽管下面的非限制性实施例以gDNA起始并利用PCR扩增，本发明公开和要求保护的发明构思的范围不应当被视为局限于任何特定的起始材料或生产方法，而是包括本领域中已知的提供分离的核酸区段的任何方法。
[0106]在一个具体的实施方式中，从样品中获得gDNA，其中所述gDNA的部分编码所期望单独的II类HLA分子的α链和β链。然后产生两种PCR产物:编码所期望II类HLAa链的可溶形式的第一 PCR产物以及编码所期望II类HLA`分子β链的可溶形式的第二 PCR产物。每种PCR产物均通过gDNA的PCR扩增产生，其中所述扩增利用至少一条基因座特异性引物，该引物具有掺入3’引物中的亮氨酸序列，从而产生不编码所期望II类HLAa链或β链的胞质和跨膜结构域的PCR产物，这样产生编码可溶性II类HLA α链或β链的PCR产物。用于II类HLA α链的PCR扩增的3’引物可以掺入与亮氨酸拉链二聚体的酸性序列一致的亮氨酸序列，而用于II类HLAP链的PCR扩增的3’引物可以掺入与亮氨酸拉链二聚体的碱性序列一致的亮氨酸序列。然而，对于亮氨酸拉链基团的描述仅出于示例的目的，本发明公开和要求保护的发明构思包括使用能够使α链和β链(先前通过其跨膜结构域相互作用)相互作用的任何超二级结构基序。
[0107]提供了分离的核酸区段后，接着将其插入到至少一种哺乳动物表达载体中以形成至少一种含有编码可溶性II类HLA α链和可溶性II类HLA β链的PCR产物的质粒。两个核酸区段可以插入到相同的载体或不同的载体中。
[0108]接着将含有两种PCR产物的质粒插入到至少一种合适的永生化的哺乳动物宿主细胞系中，其中所述细胞系含有HLA蛋白表达所需的必要机构和转运蛋白，和/或能够将蛋白质天然地加工成能够装载到II类HLA分子的抗原结合槽中的肽配体。
[0109]随后，在允许单独的可溶性II类HLA分子α链和β链表达以及具有功能学活性的单独的可溶性II类HLA三分子复合物产生的条件下培养细胞系，其中所述可溶性II类HLA三分子复合物包含可溶性α链、可溶性β链和在由α和β链形成的抗原结合槽中展示的内源性装载的肽。具有功能学活性的单独的可溶性II类HLA三分子复合物保持天然HLA三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。[0110]本文中描述的分泌的II类产物的主要应用是对等待移植的患者进行抗HLA抗体筛查。抗HLA抗体筛查试验的需要是基于观察到特定事件(例如但不限于输血、细菌感染以及怀孕)引发一个个体产生定向针对于他人HLA的抗体(Bohmig等人,2000 ;Emonds等人，2000以及Howden等人，2000)。在患者接受移植前，必须对此类抗HLA抗体进行检测，否则所移植的器官最终将被排斥。因此，对抗II类HLA抗体的筛查是器官移植的先决条件。
[0111]所有移植患者(在美国每年约20000人)以及所有等待移植的患者(在美国每年约60000人)必须定期(优选每月)对靶向他人HLA的抗体进行筛查。因此，这些分泌的或可溶的II类HLA(sHLA)产物提供天然的蛋白质以快速和准确地鉴定那些等待移植的患者中的抗HLA抗体。这种移植前的诊断测试将防止器官迅速衰竭。
[0112]本发明公开和要求保护的发明构思进一步涉及生产如上文所述的或本文另外涉及的抗MHC去除装置的方法。在该方法中，具有血清学活性的可溶性MHC部分(如上文所述)共价偶联到固相支持物(如上文所述)上。可溶性MHC部分以保持天然MHC三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性的方式附着到固相支持物上。此外，构建抗MHC去除装置，使生物学样品与所述装置接触，同时使该生物学样品可以与其可溶性MHC部分相互作用，由此MHC部分特异性抗MHC抗体附着到可溶性MHC部分上并被检测和/或从生物学样品中去除。生产抗MHC去除装置的方法可以包括本文涉及或另外描述的或者其他本领域已知的任何步骤。
[0113]本发明公开和要求保护的发明构思进一步涉及从生物学样品中去除抗MHC抗体的方法。这种抗体去除是有用的，例如，当患者的抗HLA抗体对其移植器官进行攻击时。抗HLA抗体还可以在移植之前去除，以达到更好的效果。去除特定HLA特异性抗体缓解了对于免疫抑制药物的需求。在从生物学样品中去除抗MHC抗体的方法中，提供了如上文所述的抗MHC去除装置。随后使生物学样品与抗MHC去除装置接触，由此从生物学样品中去除至少一部分存在于生物学样品中具有血清学活性的可溶性MHC部分(其暴露在抗MHC去除装置的表面)的特异性抗体。该方法·可以进一步包括在与抗MHC去除装置接触之后回收生物学样品的步骤，这样，回收的生物学样品中MHC基序的特异性抗体大大减少。该方法可以进一步包括重复使生物学样品与抗MHC去除装置接触以及在所述接触之后回收生物学样品的步骤。使用多轮次处理使得抗体滴度充分减少。在某些实施方式中，回收的生物学样品可以基本上不含抗MHC抗体，该抗体对抗MHC去除装置中具有血清学活性的可溶性MHC部分的有特异性。
[0114]当抗MHC去除装置包括具有入口、出口和置于其间的空腔(其内表面上置有血清学活性的可溶性MHC部分)的装置时，生物学样品经由入口导入到空腔中。随后生物学样品流过该装置，至少一部分具有血清学活性的可溶性MHC部分特异性抗MHC抗体与其吸附，并从生物学样品中去除。从出口收集流过物，这样具有血清学活性的MHC基序特异性抗MHC抗体大大减少。
[0115]当抗MHC去除装置包括人用装置时，该方法可进一步包括将回收的生物学样品放回入患者中的步骤，该生物学样品最初取自该患者。
[0116]在某些另外的实施方式中，该方法可进一步包括从抗MHC去除装置中洗脱抗MHC抗体的步骤。可以实施此步骤以使抗MHC去除装置可以再生和再次使用。或者，可以回收洗脱下的抗MHC抗体并将其用作临床试剂。例如但不是以限制的方式，经洗脱、回收的抗MHC抗体可以用于诊断和/或临床效力测试的质量控制试剂。因此，包含经洗脱、回收的抗MHC抗体的组合物也属于本发明公开和要求保护的发明构思的范围。
[0117]本发明公开和要求保护的发明构思进一步包括用于从生物学样品中去除抗MHC抗体的试剂盒。所述试剂盒可以含有本文中所述的任意装置，还可以进一步含有用于进行本文中所述或另外涉及的任意特定方法的其他试剂。这些额外试剂的种类将取决于具体的测定方式，并且确定这些试剂在本领域普通技术人员的技术范围内。此外，试剂盒中也可包括阳性和/或阴性对照，并且试剂盒可以进一步包括一套解释如何使用试剂盒的书面说明。试剂盒可以进一步包括用于从装置中洗脱抗MHC抗体的试剂(例如竞争性结合试剂)，从而使其可以再生和再次使用。这种类型的试剂盒可以用于本文中所述的或另外涉及的任意方法中。
[0118]下文提供了实施例。然而，不应将本发明公开和要求保护的发明构思理解为其应用限制于特定的实验、结果和实验室方法。相反，实施例仅仅是作为多种实施方式之一，其意在进行示例而非穷举。
[0119]实施例1:用于抗MHC去除装置中的II类sHLA三分子复合物的产生
[0120]本实施例涉及人单独的可溶性II类HLA三分子复合物在哺乳动物永生细胞系中的表达。该方法包括使用以改变内源性膜结合复合物的方式来破坏膜结合锚定的修饰，从而使细胞可以分泌II类HLA三分子复合物。在本实施例中，截短编码II类HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的α和β链的基因，删除跨膜和胞质结构域。在截短位点处，用亮氨酸拉链(一种系带部分)替换将HLA内源性锚定到膜上的跨膜和胞质结构域。亮氨酸拉链使HLA可以从细胞中分泌出来，同时维持II类三分子复合物的天然构象(图1和2)。亮氨酸拉链由位于II类α链尾部的酸性区段和位于II类β链尾部的互补性碱性结构域组成。酸性和碱性区段通过位于每7个氨基酸七肽重复区的d位点的氨基酸亮氨酸而融合。Chang于1994年利用该策略将可溶性T细胞受体的α和β链以相同的方式结合在一起。
[0121]II类HLA复合物·由命名为α和β的两条不同的多肽链构成。在一种方法中，α和β构建体是商业购买的，其直接连接到哺乳动物表达载体中。在另一种方法中，通过如下面段落所描述PCR扩增，再进行纯化并连接到哺乳动物表达载体中而产生构建体。
[0122]使用位于HLA-DBa (HLA-DRA)，DRP (HLA-DRB) ; DQa (DQA)，DQP (DQB)或DPa (DPA)和DPP (DPB)基因座上的等位基因的PCR寡核苷酸引物，从基因组DNA或cDNA中扩增特异性II类HLA基因。β链3’ PCR引物掺入与亮氨酸拉链二聚体的碱性序列一致的亮氨酸序列。α链3’PCR引物掺入与亮氨酸拉链二聚体的酸性序列一致的亮氨酸序列。通过布置PCR引物而截短II类基因，消除了胞质和跨膜结构域，从而产生具有亮氨酸拉链基团的II类HLA三分子复合物的可溶形式。
[0123]图15-17表示在本发明公开和要求保护的发明构思的sHLA生产方法中所使用的构建体。图15图解了 DRAl*0101a链-亮氨酸拉链构建体的核酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。图16图解了 DRA1*0401 β链-亮氨酸拉链构建体的核酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。图17图解了 DRB1*0103 β链-亮氨酸拉链构建体的核酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO: 5和6)。
[0124]随后将该构建体插入到哺乳动物表达载体中。在一个例子中，用一组限制性酶切割α链，而用另外一组限制性酶切割β链。将经纯化和切割的α链扩增产物连接到哺乳动物表达载体pcDNA3.1中。接着，将含有II类sHLAa基因的该连接后的载体转化进大肠杆菌(E.coli)菌株JM109中。细菌在含有抗生素的固体培养基生长以挑选阳性克隆。从该平板上挑取菌落，使其生长并检验是否含有插入区段。从经鉴定为阳性的克隆中分离质粒DNA，随后进行DNA测序以确保经克隆的α基因的保真性。
[0125]用第二组限制性酶再次切割α载体，所述限制性酶辅助经纯化的PPCR产物的定向克隆。最终的连接产物由α克隆和β克隆二者组成。然后从阳性克隆中分离质粒DNA，对这些克隆中的β基因进行DNA测序。
[0126]制备II类α和β等位基因的质粒DNA，并进行DNA测序以确认所扩增II类基因的保真性。在塑料电穿孔杯(electrocuvette)中将处于对数生长期的哺乳动物细胞与质粒DNA混合。对该混合物进行电穿孔，置于冰上，并重悬于培养基中。需要对于电穿孔步骤进行特殊优化，以使得本发明公开和要求保护的发明构思能够成功实现。在发明人进行的大量实验中以及如其他实验室在出版物中所报道，标准的电穿孔方法均不成功。
[0127]在CO2孵育器中于37°C孵育2天之后，用抗生素对细胞进行选择。首先进行细胞计数并确定活力。然后在条件完全培养基中重悬细胞。接着，将细胞置于24孔板的每个孔中并进行选择。从每个孔中采集上清液，并进行ELISA测定以确定II类sHLA的产生。扩增和冻存产量高的细胞以进行大规模生产。
[0128]在CELL PHARM?生物反应器中进行培养之前，优化每种细胞系的细胞生长参数(pH、葡萄糖和血清供应)以在生物反应器中生长。用补充了青霉素/链霉素和血清或ITS (胰岛素转铁蛋白硒)添加物的培养基在转瓶中培养大约8升天然的或被病原体感染的sHLA-分泌型II类转染子。调节细胞培养物的总体积，从而获得约5 X IO9个细胞。离心沉淀细胞，并在CELL PHARM?进料瓶中将细胞重悬于300ml条件培养基中。通过UnisynCP2500CELL PHARM?的ECS进料泵将细胞和条件培养基接种至预先用补充了青霉素/链霉素和血清或ITS的培养基填装的30kDa分子量截断值的中空纤维生物反应器中。继续在CELL PHARM?中培养细胞，持续监测葡萄糖、PH和感染。监测并调节培养基进料速率，以维持70-110mg/dL的葡萄糖 水平。图3提供了 CELL PHARM?生物反应器系统的概述；sHLA分泌型细胞及其sHLA产物包含在中空纤维生物反应器的毛细管外空间(ECS)之中。细胞所需的养分和空气由再循环培养基提供。
[0129]图4A阐述了当扩大规模至生物反应器生产时，由转染细胞所产生的II类sHLADRB1*0103的产量增加。利用偶联到经CNBr-活化的SEPHAROSE? 4B上的特异性抗II类HLA抗体L243从细胞上清液中纯化出sHLA，并通过micro-BCA蛋白质分析、UV吸收和ELISA确定蛋白质浓度。II类sHLA典型的生产运行效价为约4_5mg/升生长培养基。图4B阐述了利用单克隆抗体L243，这些三分子复合物在多种缓冲液和宽范围的pH浓度中是非常稳定的，所述单克隆抗体L243可与几乎所有的DR HLA蛋白反应。L243是先前由Lampson&Levy (1980)所描述的鼠源IgG2a抗HLA-DR单克隆抗体,所述单克隆抗体已保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville, Md,保藏号为 ATCC HB55。
[0130]在图5中，经纯化的II类sHLA三分子复合物的血清学完整性是通过直接将复合物涂覆在平板上并将涂覆的复合物暴露于限定的市售HlAbs和患者血清证实的。此外，将sHLA与全长分子进行比较，显示其在抗原性上没有差别。
[0131]图6阐述了利用本发明公开和要求保护的发明构思的方法生产多种不同的II类sHLA 三分子复合物的能力。而 DRB1*0101、DRB1*0103、DRB1*1101、DRB1*1301 和 DRB1*1501仅出于示例目的而展示，根据本发明公开和要求保护的发明构思还生产了毫克量的多种其他II类sHLA三分子复合物。利用L243ELISA测定检测和定量了每种sHLA DR蛋白质的三分子复合物。
[0132]图7-9阐述了根据本发明公开和要求保护的发明构思的II类sHLA生产的另一个示例。在该示例中，用可溶性HLA-DRB*0103 / DRA*0101构建体(具有亮氨酸拉链的DRB1*0101可溶性α链和具有亮氨酸拉链的DRB1*0103可溶性β链)转染的永生化细胞在转瓶中生长直至获得总共11°个细胞。然后将细胞接种到2个中空纤维生物反应器单元的ECS部分中。细胞在ECS内的DMEM+10% FBS中生长，而在ICS中则没有FBS。每天收集ECS收获物直至细胞死亡并不再产生可溶性HLA。利用捕获ELISA对蛋白质进行定量。对于此ELISA，用亮氨酸拉链的特异性抗体(2H11)作为捕获抗体，II类HLA的特异性抗体(L243)用作检测抗体。将约8mg可溶性HLA装载到亲和抗体(L243)柱中，并在碱性缓冲液(0.1M甘氨酸，pHll)中洗脱。收集含有可溶性HLA的流分并将其冻干。将冻干物重悬于水/ 20%乙腈中，并装载到C18RP-HPLC柱中。然后使用20%至80%乙腈梯度洗脱可溶性HLA，并利用电喷雾离子化TOF质谱进行检测。
[0133]如在图7中所见，以生物反应器方式产生了毫克量的可溶形式的单一 II类HLA异源二聚体。此外，纯化出了无其他污染性蛋白质的如LCMS所确定的完整异源二聚体(图9)。与天然II类HLA —致，该可溶性II类含有单糖基化的β链和二糖基化的α链(图8)。此外，各种糖型(glycoform)与蛋白质运送至细胞表面时所发生的糖类中天然变化相一致。对于II类分子的一个亚群，胞内蛋白质水解事件将亮氨酸拉链结构域中除两个氨基酸之外的全部氨基酸从α和β链两者中去除。然而，同全长构建体一样，无亮氨酸拉链结构域的II类分子由于α和β链两者的共洗脱而保持为异源二聚体。这些可溶性I类和II类HLA蛋白可以利用质谱进行分析，而这些`蛋白质的纯度和鉴定可以通过分子量TOF分析确认(图9)。
[0134]实施例2:11类sHLA用于抗体去除的用途
[0135]本文还显示了本发明公开和要求保护保护的发明构思的可溶性II类HLA三分子复合物能够成功地用于抗体去除技术之中，如图10-14所示。
[0136]图10图示了将II类可溶性DRB1*1101ZP HLA三分子复合物偶联到固相支持物上及其以ELISA方式辅助去除II类HLA特异性抗体的用途。A图包含为了特异性抗体去除所实施的连续吸收基质ELISA的图表。简言之，将可溶性II类HLA DRB1*1101 /DRA1*0101ZP(标记为DRB1*1101)涂覆在标准ELISA平板上，并用BSA封闭。然后制备生物素标记的II类HLA特异性抗体，根据预先确定的最佳结合效价进行稀释，并加入到10个孔中作为SI。保留该原始稀释液的一小部分(200μ I)作为S(O)。使抗体在室温下结合30分钟，此后将各个孔中的全部内容物(<200μ I)移至相应的新孔中(S2)，并将BSA缓冲液加至SI孔中。重复此整个过程总计9个样品轮次(S1-S9)。对于每个轮次，保留一个孔中的样品，置于离心管中，以用于评估残留在滞留物溶液中的抗体量。这些被标记为S(n)。在吸收过程完成之后，用HRP / (PD过氧化物酶底物使平板显影，并以“吸光度”绘制曲线。也可以以同样的方式在一块单独的ELISA板上读取保留物样品。将这些以“保留物”绘制曲线。B图描述了来自于3个不同的II类HLA特异性mAb抗体的吸光度和保留物数值:使L243、OL(One Lambda)和以及2H11经过连续吸收基质。重组地添加到可溶性II类HLA分子中的II类HLA分子特异性的L243和OL mAb和拉链尾部区段特异性的2HllmAb显示，通过每个轮次的ELISA II类HLA抗体的吸光度和保留物降低。包括了一种对照mAb抗体，W6 / 32，其具有I类HLA分子特异性，未吸附在平板上，仅在保留物中找到。
[0137]图11图示了 ELISA方式中，DRB1*1101特异性人血清被可溶性DRB1*1101所识别。利用可溶性 II 类 HLADRB1*1101 / DRA1*0101ZP (标记为 DRB1*1101)，用可溶性 II 类 HLA等位基因直接涂覆ELISA平板。将来自于先前已知具有DRB1*1101反应性的两名人类供者的血清样品以1X(未稀释)至5000X范围的稀释度加入到平板中。洗涤平板，加入生物素化的山羊抗人IgG第二抗体。用HRP / OPD过氧化物酶底物使平板显影并读取490nm处的吸光度。可以看到两名供者的血清抗体反应性稀释曲线，其相当于DRB1*1101的特异性亲和力。
[0138]图12图示了可溶性DRB1*1101可被偶联到SEPHAROSE?上并用于吸附II类HLA特异性抗体9.3F10。在A图中，将4mg可溶性DRB1*1101偶联到Iml SEPHAROSE?Fast Flow上并包装进重力柱中。使具有DR反应性的100 μ g / ml mAb9.3F10 (在I XPBS中)的已知混合物流经柱,并用IXPBS洗涤。收集共计23种200μ I流过物流分，称重并测量其0D280nm。将数值转换成蛋白质总量。为了洗脱柱，将大约4ml DEA(二乙醇胺，pHll.3)缓冲液加入到柱子中，以200 μ I的量收集流分。也对洗脱液进行称重，测量280nm的光密度，并将其转换为蛋白质总量。
[0139]在图12的B图中，还对流过物和洗脱物实施对于小鼠总IgG和人HLA的两个独立的ELISA，以检测可能已经从柱中洗脱下来的特异性抗体(针对HLA蛋白)。由于ELISA敏感性的增加，在流过物中所看到的微量蛋白质在抗体ELISA中显示出小峰。然而，重要的是，在流过物中并没有看到HL·A，但是当加入DEA时HLA确实从柱中洗脱了下来。
[0140]图13图示了人血清中含有的DRB1*1101特异性抗体可以被DRB1*1101特异性柱去除。使供者#1的血清流过DRB1*1101 SEPHAROSE?柱，并收集两份2ml流过物流分。为了进行洗脱，将DEA(pHl1.3)缓冲液加入柱中，并收集两份2ml流分。在A图中，实施直接的DRB1*1101ELISA以检测流过物和洗脱物中残留的DRB1*1101特异性抗体的量。流过物和洗脱物组分以1X(没有稀释)至5000X进行稀释，并使用生物素化的山羊抗人第二抗体以及随后的HRP / OPD过氧化物酶底物进行显影。读取平板的490nm光密度。在B图中，还实施了人总IgG夹心ELISA,以评估总人IgG的流过。可以看到总人IgG的流过；然而，仅DRB1*1101抗体被柱保留，并且只有当柱被洗脱时才能看到。
[0141]图14图示了偶联可溶性DRB1*1101的SEPHAROSE?具有DRB1*1101而非其他DR等位基因的特异性。使供者#2的血清以与图13相同的方式流过相同的DR1*1101柱，对两份流过物流分和一份洗脱物组分进行多等位基因DR反应性的评估。简言之，将经膜去污剂纯化的多个DR等位基因以及可溶性产生的两个DR等位基因以先前所确定的最佳反应性的量涂覆在96孔ELISA平板上。将两份流过物流分和一份洗脱物流分与原血清样品进行反应性的比较。考虑到大部分特异性反应性包含在洗脱物#1(图14)中，因此没有对第二份洗脱物流分进行评估。除可溶性DRB1*1101(DRB1*1101ZP)等位基因外，普遍看到了低反应性，其仅对血清样品而且仅对洗脱物而非流过物显示出高反应性(第一个带框区域)。血清中还包含针对第二个等位基因DRB1*1601具有强反应性的抗体(第二个带框区域)，其通过流过物而非洗脱物。
[0142]因此，本实施例显示，基于与已结合的II类HLA蛋白的亲和力，以柱方式固定的II类sHLA三分子复合物能够在单次流过中选择性地并且有效地去除绝大多数抗HLA特异性抗体，而不会去除与抗原性不相似的HLA分子相结合的抗体。这些数据显示，可以使用根据本发明公开和要求保护的发明构思所产生的II类sHLA蛋白构建高特异性和高效的抗体去
除装置。
[0143]实施例3:从敏化的人血清中分离HLA-DRll抗体
[0144]为了检验以下假设，即基于抗原对天然存在的多克隆抗HLA抗体进行分离将有助于表征同种异体的抗HLA抗体应答，以其天然构象形式产生了数量可观的可溶性II类HLA分子。接着，用这一 HLA试剂构建首次报道的HLA免疫亲和柱。然后使含有抗HLA抗体复杂混合物的供者血清流过该柱。特定II类HLA的特异性抗体保留在柱上，随后通过洗脱回收这些免疫球蛋白并进行表征。抗原特异性抗体的表型和功能谱使得理解抗HLA抗体如何促进器官排斥的能力而言大大提高。这项技术的有力的应用将能够区分补体固定化抗体(complement-fixing antibodies),所述补体固定化抗体代表较少关注的来自顽固体液应答的移植禁忌症。这些用天然可溶性HLA构建的免疫亲和柱还为对同种异源HLA具有强抗体反应性的患者提供了新一代的治疗手段。
[0145]实施例3的材料和方法
[0146]患者血清样本:购买供者I的血清作为HLA-DRll抗血清(Gen-Probe, Inc., SanDiego, CA)。从DRll敏化的肾脏受者中收集供者2血清，此过程依照德克萨斯州大学西南伦理评审委员会批准的方法，并使用知情同意书。供者2是一名50岁的男性，曾接受6 /6不匹配(移植HLA:A2、A3、B62、B51、DR4、DR11)的肾脏移植。在移植之后，供者2排斥移植物并产生抗HLA抗体。收集约5ml全血`并使其凝固。然后将血液离心，将血清与沉淀分离。将血清储存于4°C直至检测。
[0147]sHLA-DRll蛋白的产生。为了产生分泌性HLA-DRB11 (sHLA)分子，通过PCR突变对HLA-DRA1*01:01和HLA_DRB1*11:01的α链cDNA进行修饰，以删除编码跨膜和胞质结构域的密码子并加入亮氨酸拉链结构域。对于DRA*01:01，加入7氨基酸的接头(DVGGGGG ；SEQ ID NO:7)，随后是亮氨酸拉链ACIDpl。对于DRB*11:01，使用相同的接头，随后是亮氨酸拉链 BASEpl 序列(Busch 等人，2002)。分别将 sHLA_DRAl*01:01 和 sHLA_DRBl*ll:01克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)遗传霉素和博来霉素中(Invitrogen，LifeTechnologies, Grand Island, NY)。通过电穿孔将 sHLA_DRAl*ll:01 和 sHLA_DRBl*01:01转染II类HLA缺陷型B-LCL细胞系NS1(ATCC#TIB-18)中。在电穿孔后两天，将细胞转移至含有G418(0.8mg / ml)和博来霉素(lmg/ml)的选择性培养基中。通过夹心ELISA，用作为捕获抗体的L243 (Leinco Technologies I nc.，St.Louis, MO)和II类特异性商业检测抗体(One Lambda Class II, One Lambda Inc.，Canoga Park, CA),对耐药性稳定转染子进行II类sHLA分子产生的测定。通过ELISA对具有克隆细胞群的各个孔进行II类sHLA产生的测定，并将具有最高产量的克隆在ACUSYST-MAXIMIZER?中空纤维生物反应器(Biovest International, Inc.,Minneapolis,MN)中扩大培养。从每个生物反应器中收集约25mg sHLA-DRll0将含有sHLA-DRll的上清液装载到L243免疫亲和柱上，并用40倍柱体积的20mM磷酸缓冲液(pH为7.4)洗涤。用50mMDEA(pHll.3)将sHLA-DRll分子从亲和柱上洗脱下来，用IM TRIS(pH7.0)中和，于无菌PBS中进行缓冲液替换并以lmg/ml储存。
[0148]质谱:用二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich D0632)使10 μ g经纯化的sHLA-DRll还原和变性，并于95°C C孵育5分钟。然后用碘乙酰胺(Thermo Scientific89671F)使样品烷基化，于室温下I小时。利用标准的两步消化方法(Thermo Scientific90055)用胰蛋白酶对变性的蛋白质进行消化。将胰蛋白酶肽于30%乙酸/ 70%超纯水中复原，并装载到带有PEPMAP?100C1875 μ mX 15cm, 3 μ mlOOA 反相柱的ULTIMATE? 3000HPLC系统上(Dionex，Thermo Fisher Scientific, Inc., Sunnyvale, CA)。将妝洗脱下来，并用 Mascot 软件在QTOF QSTAR? Elite 质谱仪上进行分析(ABI, Thermo Fisher Scientific, MDS Sciex)。
[0149]用DRB1*11:01偶联的SEPHAROSE?亲和柱去除抗体。对于Iml的sHLA-DRll亲和柱，使 SEPHAROSE ? 4Fast Flow (GE Healthcare)膨胀并用冰冷的 ImM 的HCl (pH3.0)洗涤4次。将膨胀的基质与sHLA-DRll (4mg)以1.6mg / ml的终反应浓度在碳酸氢盐偶联溶液中混合。反应之后，在偶联溶液中洗涤基质3次，并用0.1M的TRIS (pH8.0)封闭。然后将经偶联的基质装载进小的2ml柱中。
[0150]将lml200 μ g / ml的L243抗体溶液或Iml的人总血清施加到基质上，并使其在重力作用下被吸附。加样后，加入4ml PBS(pH7.4)。在该装载步骤期间，人工收集25份流分，每个流分包含~200μ I。最后，用5ml50mM的DEA(pHll.3)对柱进行洗脱。在洗脱过程中收集20份流分，并立即用35 μ IlM的TRIS中和。对于L243，通过OD28tl测量所收集流分中的抗体含量。每个上述过程后，用DEA (pHl1.3)，随后再用50ml洗涤缓冲液(PBS pH7.4)对柱子进行模拟洗脱。
[0151]II类HLA单个抗原微珠测定和Ig分型。利用基于:Luminex?的II类HLA单个抗原测定(Gen-Probe GTI Diagnostics),根据制造商的操作手册确定上柱前的血清、流过物和洗脱物中抗HLA抗体的特异性。简言之，将40 μ I微珠悬浮液与10 μ I待测样品在室温下孵育30分钟。洗涤微珠，并将其与检测抗体在室温下孵育30分钟，然后洗涤并在LUMINEX? 100 分析仪上进行分析。使用MATCHIT? (Gen-Probe GTI Diagnostics,San Diego, CA)和EXCEL? (Microsoft)软件进行数据分析。基于公司所定义的背景水平，将起始血清和流过物的数据显示为经背景校正的中间荧光强度(BCMFI)数值，所述背景水平是批次特异性的并通过标准阴性血清而确定。洗脱物的背景要小得多，因此其背景被定义为最小微珠MFI。对于流过物，用起始血清中的平均DQ BCMFI对其BCMFI数值进行标准化(表1和表2)。用起始血清中的DRB1*11:01BCMFI对洗脱物BCMFI数值进行标准化(表1和2)。
[0152]对于抗体分型和定量，根据制造商的操作说明使用BIO-PLEX PRO?免疫球蛋白分型试剂盒(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)。简言之,制备10倍系列稀释的样品，将50μ I样品与50μ I微珠悬浮液在室温下孵育30分钟。洗涤微珠，将其与检测抗体在室温下孵育30分钟。最后，洗涤微珠并在LUMINEX? 100 (One Lambda, Inc.)上进行分析。使用Ig特异性标准曲线将样品MFI值转换为Ig浓度。
[0153]补体依赖性细胞溶解。使用Lambda Cell Tray确定补体依赖性细胞溶解(OTC):所分析的30B细胞板(One Lambda, Inc.)细胞系是DRll阳性的。细胞系II类HLA单倍型如下。C433:DR4、DR11、DR52、DR53、DQ7。C418:DR4、DR11、DR52、DR53、DQ7。C423:DR11、DR13、DR52、DQ6、DQ7。C428:DR11、DR17、DR52、DQ2、DQ7 (One Lambda，Inc.)。根据制造商的操作手册对所示样品进行裂解。使用兔的补体作为补体来源。裂解之后，使用FL0R0QUENCH?染料(One Lambda, Inc.)区分活细胞和裂解细胞。然后使用Nikon TE200-E荧光显微镜对活细胞和裂解细胞进行分析。对于绿色滤光片(激发:490nm bp20，发射:520nm bp38)和红色滤光片(激发:555nm bp28，发射:617nm bp73)都使用4X物镜生成每个孔的全孔图像。利用MetaMorph v7.5.5.0来确定两个通道中的总荧光，并以红色荧光/红色荧光+绿色荧光计算细胞死亡的百分比。
[0154]实施例3的结果
[0155]可溶性II类HLA的产生和纯化。抗II类HLA抗体的特异性分离需要有丰富的天然II类HLA的来源。尽管存在多种用于获得HLA蛋白的技术，但是在本实施例中，在哺乳动物细胞中产生可溶性分子，因为这些HLA是糖基化的、天然装载的配体，并且具有与抗体的完全反应性。II类HLA以α/β异源二聚体形式存在而这些蛋白质必须特异性配对以行使功能是一个挑战。先前的研究通过用互补的亮氨酸拉链结构域同时替换α和β链上的跨膜和胞质结构域已经使得II类可溶性HLA异二聚体稳定(Busch等人，2002和Kalandadze等人，1996)，但是这些研究仅仅使用非哺乳动物细胞获得成功。在此，使用该方法生成HLA-DRA1*01:01和HLA_DRB1*11:01构建体，其中跨膜结构域被7氨基酸的接头，随后分别是ACIDpl或BASEpl亮氨酸结构域所替换(图18A)。
[0156]选择鼠类细胞系进行产生sHLA-DRll，因为发明人假定，内源性小鼠II类MHCa和β蛋白(H2-Ad，H2-Ed)不会与可溶性人类II类HLA的α和β蛋白配对，也不会干扰可溶性α和β HLA蛋白的预期配对。为了证实经纯化的sHLA-DRll不含小鼠的α和β链，用胰蛋白酶对经纯化的蛋白质进行消化，将对得到的肽进行液相色谱-质谱(LCMS)分析。在BLAST分析中，肽的序列显示与内源性小鼠II类MHC(H2-Ad，H2_Ed)不匹配，尽管检测到了来自染到细胞中的sHLA-DRll·构建体α和β链中的肽序列(图18Β)。因此，可以得出结论，产生并纯化出了所期望sDRll的α和β链而没有受到其他II类MHC亚基的污染。
[0157]抗II类HLA抗体的柱去除。为了以免疫亲和柱方式测试II类sHLA，纯化sHLA-DRll并将其偶联到经CNBr活化的S印harose_4Fast Flow固相支持基质上。使抗HLA-DR单克隆抗体L243流过亲和柱，以测试在偶联过程中sHLA-DRll复合物是否保持完整以及测量柱的结合能力。在装载过程中收集200 μ I—份的流分(流过物)，所结合的L243被完整地洗脱下来。在流过物和洗脱物之间，装载到柱上的抗体回收了 78% (170.6 yg),其中28% (47.8 μ g)在流过物中，72% (122.9 μ g)在洗脱物中(图19A)。此外，被捕获并洗脱的L243抗体保持其HLA-DR结合活性和特异性(图19B)。这些结果表明，当偶联到亲和柱基质上时，HLA-DRlI保持其天然构象，sHLA-DRll柱能够用于去除和回收完整的抗HLA抗体。
[0158]清除和回收来自患者血清的抗HLA-DRlI抗体。接着，测试柱子能否用于从患者血清中清除抗HLA-DRl I抗体。对来自于两名DRll敏化的患者的血清进行分析，分析其对于起始血清(装载到柱中之前)、流过物和洗脱物中的多种II类HLA类型的反应性。两者的起始血清均含有与多种DR和DQ特性均具有反应性的多克隆抗HLA抗体复杂混合物(图20A和B)。在流过DRll柱之后，来自于每名供者的流过物和洗脱物的HLA反应性模式差异很大(图20C和D)。在供者I的血清中，HLA-DQ (红色)和DP (绿色)特异性抗体流过柱，而DR11、13、8和4的大部分抗体从血清中清除出去，并随后回收于洗脱物中。同样，在供者2的血清中，HLA-DQ和-DP特异性抗体流过柱。然而，和供者I的血清不同的是，来自于供者2血清中的大部分DR9和DR7特异性抗体流过柱，而DRll和DR13的抗体被保留并随后被洗脱。在洗脱物中仅回收到少量的DR9和DR7特异性抗体。起始血清、收集的流过物(流分2-11)以及收集的洗脱物(流分2-6)中所有II类HLA反应性概括于图23中。
[0159]在流过柱之前，这些血清识别大量的DR特异性(供者I中11种HLA-DR，供者2中17种HLA-DR)。显著的是，DRll柱清除了供者I中100% (11 / 11)以及供者2中的88%(15 / 17)的DR反应性抗体(图23，表1和2)，而没有回收到HLA-DQ或DP反应性抗体。因此，DRll柱去除了针对多种血清学相关HLA-DR特异性的抗体，而与HLA-DQ和-DP具有反应性的抗体却没有结合。这些结果显示，DRll特异性抗体可从患者血清中清除和回收，而与其他抗原具有反应性的抗体并不会被保留。
[0160]表1
【权利要求】
1.抗MHC去除装置，其包括: 固相支持物； 共价偶联到固相支持物上并且置于抗MHC去除装置表面的具有血清学活性的可溶性MHC部分，所述MHC部分能够与接触到所述装置表面的样品相互作用，所述装置表面具有置于其上的具有血清学活性的可溶性MHC部分，其中样品中存在的MHC部分特异性抗体将与其结合，使得所述抗体从样品中去除。
2.权利要求1的抗MHC去除装置，其中进一步限定所述MHC部分为可溶性I类HLA三分子复合物。
3.权利要求2的抗MHC去除装置，其中可溶性I类HLA三分子复合物由包括以下步骤的方法产生: 提供编码所期望的单独的I类MHC重链的核苷酸区段，所述核苷酸区段中去除了编码所期望的单独的I类MHC重链等位基因的胞质和跨膜结构域的编码区，这样所述核苷酸区段编码截短的可溶形式的所期望的单独的I类MHC重链分子； 将所述核苷酸区段克隆到哺乳动物表达载体中，从而形成编码所期望的单独的可溶性I类MHC重链分子的构建体； 用所述构建体转染哺乳动物细胞系，以提供表达编码重组的单独的可溶性I类MHC重链分子的构建体的哺乳动物细胞系，其中所述哺乳动物细胞系能够天然地将蛋白质加工成装载到MHC分子的抗原结合槽中的肽配体，并且其中所述哺乳动物细胞系表达β -2-微球蛋白； 在允许重组的单独的可溶性I类MHC重链分子从构建体中表达的条件下培养所述哺乳动物细胞系，此类条件还 允许肽配体内源性装载到每个重组的单独的可溶性I类MHC重链分子的抗原结合槽中并与天然的内源性产生的β-2-微球蛋白的非共价关联，以形成单独的可溶性I类MHC三分子复合物，随后从细胞中分泌单独的可溶性I类MHC三分子复合物；从培养物中收集可溶性I类MHC三分子复合物，同时将哺乳动物细胞系保留在培养物中以生产更多的可溶性I类MHC三分子复合物；和 将单独的可溶I类MHC三分子复合物从其他蛋白中基本上纯化出来，其中所述单独的可溶I类MHC三分子复合物保持天然I类MHC三分子复合物的物理的、功能的和抗原性的完整性,并且其中如此纯化的每个三分子复合物包含一致的重组的单独的可溶性I类MHC重链分子。
4.权利要求1的抗MHC去除装置，其中进一步限定所述MHC部分为可溶性II类HLA三分子复合物。
5.权利要求4的抗MHC去除装置，其中所述可溶性II类HLA三分子复合物由包括以下步骤的方法产生: 提供编码可溶形式的II类HLA分子α链的第一分离的核酸区段，所述α链具有连接于其上的超二级结构基序的第一结构域； 提供编码可溶形式的II类HLA分子β链的第二分离的核酸区段，所述β链具有连接于其上的所述超二级结构基序的第二结构域； 将第一和第二分离的核酸区段插入到哺乳动物细胞系中，其中所述哺乳动物细胞系不表达内源性II类HLA，并且其中所述哺乳动物细胞系包含其产生的蛋白质发生糖基化所需的糖基化机制和肽配体装载到II类HLA分子中所需的分子伴侣复合物； 在这样的条件下培养所述重组的哺乳动物细胞系，所述条件允许可溶性II类α和β链表达、可溶性II类α和β链通过所述超二级结构基序的第一和第二结构域关联、可溶性II类α和β链糖基化以及将内源性产生的非共价关联的肽配体装载到由可溶性II类α和β链形成的抗原结合槽中，从而产生可溶性II类三分子复合物； 分离从所述重组的哺乳动物细胞系中分泌的可溶性II类三分子复合物；和 将可溶性II类三分子复合物从其他蛋白质中基本上纯化出来。
6.权利要求1-5任一项的抗MHC去除装置，其中所述固相支持物选自由管(well)、珠、膜、微量滴定板、基质、孔、塑料、玻璃、聚合物、多糖、尼龙、硝酸纤维素、顺磁性化合物及其组合组成的组。
7.权利要求6的抗MHC去除装置，其中所述固相支持物被进一步限定为固相基质。
8.权利要求7的抗MHC去除装置，其中所述固相支持物被进一步限定为经N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的SEPHAROSE?基质。
9.权利要求1-8任一项的抗MHC去除装置，其中所述可溶性MHC部分通过HLA部分内所含伯胺基与固相支持物中所含酯基之间形成的共价酰胺键偶联到固相支持物上。
10.权利要求1-9任一项的抗MHC去除装置，其中所述固相支持物进一步包含间隔臂。
11.权利要求1-10任一项的抗MHC去除装置，其被进一步限定为人用装置。
12.权利要求11的抗MHC·去除装置，其被进一步限定为体外血浆置换人用装置。
13.含有权利要求1-12任一项的抗MHC去除装置的试剂盒。
14.权利要求13的试剂盒，其进一步包括至少一种用于从抗MHC去除装置中洗脱抗体的试剂。
15.从生物学样品去除抗HLA抗体的方法，所述方法包括步骤: (a)使生物学样品与权利要求1-12任一项的抗MHC去除装置接触，将抗MHC去除装置表面上存在的MHC部分特异性抗体从生物学样品中去除；和 (b)回收生物学样品，其中回收的生物学样品中MHC部分特异性抗体显著减少。
16.权利要求15的方法，其中所述生物学样品选自由血清、组织、血液、血浆、脑脊液、泪液、唾液、淋巴、透析液、器官或组织培养物衍生液、从生理组织中提取的液体及其组合组成的组。
17.权利要求15或16的方法，其进一步包括重复步骤(a)和(b)的步骤。
18.权利要求15-17任一项的方法，其进一步包括从抗MHC去除装置中洗脱抗体的步骤。
19.权利要求15-18任一项的方法，其进一步包括将回收的生物学样品输回患者的步骤。
【文档编号】C12N15/13GK103857691SQ201280032403
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年4月30日 优先权日:2011年4月29日
【发明者】W·H·希尔德布兰德, R·布克利, C·麦克默特里, S·凯特 申请人:俄克拉何马大学董事会