专利名称：一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病原体检测技术领域，尤其涉及的是ー种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。
背景技术：
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)属于黄病毒科,是慢性丙型肝炎的病原，迄今为止大约有2亿人感染HCV，感染人口约占全球人口的2 3%。据报道有些国家HCV感染率可高达10%以上例如在非洲和中东ー些国家。HCV病毒在遗传变异出表现出来的高变异的特性、以及高效率的细胞培养体系和合适的HCV感染小动物模型的缺乏是目前抑制对HCV深入研究的瓶颈，严重阻碍了科学家对HCV生活史、疫苗和特异性抗病毒药物的研究。随着科学技术的发展和不断的深入研究，HCV在病原学、分子生物学、流行病学等领域取得了很多备受关注的研究成果。HCV是一直径约为50nm的球状颗粒。颗粒外表有脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。HCV的基因组是ー单股正链RNA分子。不同个体来源或同一个体不同病程阶段的HCV颗粒可表现出显著不同的浮力密度，主要为1. 06g/ mL和1. 17g/mL两种密度。HCV在被感染宿主体内的主要寄生地是肝脏，其病毒的浓度是外周循环血中的120倍。HCV有严格的宿主限制性，迄今已证实的可感染宿主只有人类和黑猩猩。虽有利用连续传代的细胞系在体外培养条件下支持HCV复制的报道，但是目前尚不能形成 可供 进行分子生物学研究的体外模型。HCV仅有Huh7，Huh7. 5，Huh7. 5.1三种体外细胞培养系统，黒猩猩、恒河猴等灵长类动物可感染HCV，但症状较轻。
发明内容
提高丙型肝炎病人疗效的最佳途径是早发现、早诊断、早治疗，要实现这一目的最关键的是早期对HCV病原学的确诊，迄今为止广泛应用于临床的丙型肝炎的病原学确诊方法操作繁琐，费时费力，检测试剂和仪器昂贵，检测费用相对较高的缺点。本发明的目的为提供一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。本发明的技术方案如下一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 SEQ ID N0:4所示。所述丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法分别取5ML HCV RNA模板、取引物FIP和BIP各40 pmol/L，引物F3和B3各5pmol/L,混勻后置于冰上，加入1. 6 mol/L betaine, 16 mmol/L MgSO4,40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，20 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH4)2SO4, 0. 2% Tween 20，2.8 mmol/L dNTPs,Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶50U，补充DEPC处理水至25ML。轻轻混匀反应液，分别置恒温水槽60°C反应60min，最后80°C孵育5min以灭活酶终止反应。反应产物干2. 5%琼脂糖凝胶IOOV电泳40min, EB染色,全自动凝胶图象分析系统观察。结果判定方法如扩增产物条带呈LAMP特征性梯状条带为阳性，无任何条带为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，反应液变绿为阳性，反应液保持橙色为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，在紫外灯下观察反应液发出荧光为阳性而阴性对照管未见荧光为阴性。丙型肝炎疾病的早期快速确诊是治疗丙型肝炎的基础和首要条件，寻找敏感性高、特异性强、简便及能批量操作的方法具有重要意义。迄今为止广泛应用于临床的丙型肝炎的病原学确诊方法是实时定量RT-PCRJS操作繁琐，费时费力，检测试剂和仪器昂贵，检测费用相对较高。本发明通过BLAST比对GeneBank上已公布的27个HCV国际參考毒株的5’ -非编码区(5’ -UTR)的保守区域和部分核心保守区序列确定RT-LAMP目标序列，根据我国流行的HCV主要为Ib型这ー特性，以GenBank公布的HCV Ib型基因组全序列(登录号⑶451224)的5’_UTR和核心蛋白的保守区域为目标序列，设计出HCV特异的内引物FIP、BIP和外引物F3、B3，构建了 HCV逆转录环介导等温扩增检测法。该方法与临床常用的PCR·检测法相比具有很好的敏感性，其最低检测限度可达600 IU/mL。特异性试验中，以HAV，HBV和HEV为模板均扩增不出阳性結果，显示该方法有较好的特异性。在对临床样品的检测比较中我们发现，其检测率比巢式RT-PCR高，几乎和实时定量RT-PCR的检测率相同，并且没有发现HCV的基因型差异对敏感性有影响。该方法在急性HCV感染的早期诊断上有广阔的应用前景。本发明提供了一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的介导等温扩增检测试剂盒对丙型肝炎进行病原学诊断，为丙型肝炎的早期快速诊断提供新方法。
图1 RT-LAMP反应时间的优化结果图2 RT-LAMP扩增HCV RNA后加入SYBR Green I荧光染料肉眼观察3 RT-LAMP扩增HCV RNA后加入SYBR Green I荧光染料紫外灯下观察结果图4 RT-LAMP检测HCV的特异性分析图5 RT-LAMP和RT-PCR检测HCVRNA以及LAMP和PCR检测重建质粒的敏感性分析。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。2.1 RT-LAMP 引物设计通过BLAST比对GeneBank上已公布的27条代表7个基因型的HCV国际參考毒株的全基因组序列(基因型分类參考http //euhcvdb.1bcp. fr/euHCVdb.登录号见表I)以确定RT-LAMP目标序列，根据GenBank公布的HCVlb型基因组全序列(登录号⑶451224)的5-UTR和核心蛋白的保守序列，输入在线软件primer Explorer V4 (http://primerexplorer. jp/e/)设计 RT-LAMP 特异的内引物 FIP、BIP 和外引物 F3、B3。表127条代表7个基因型的HCV国际參考毒株登录号
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括外引物F3、B3和内引物 FIP、BIP，所述引物序列依次如 SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 SEQ IDNO -A所示。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO1 、SEQ ID NO2、 SEQ ID NO3 SEQ ID NO4所示。本发明提供了一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的介导等温扩增检测试剂盒对丙型肝炎进行病原学诊断，为丙型肝炎的早期快速诊断提供新方法。
文档编号C12Q1/70GK103060472SQ20131000613
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者刘学忠, 胡锦松, 李庆林, 刘骁 申请人:成都市学忠农业发展有限公司, 四川农业大学