专利名称：海参硫酸多糖在制备抗ii型糖尿病药物或制品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于保健食品和药品领域，具体涉及海参硫酸多糖在预防、改善或治疗II型糖尿病方面的应用。
背景技术：
糖尿病是一种以长期高血糖为主要特征的慢性内分泌代谢性疾病，其主要诱因是胰岛素分泌绝对或相对不足以及(或)胰岛素生物作用缺陷而引起的糖、脂肪代谢紊乱，是继心脑血管疾病及癌症之后的第三大致残和致死性疾病。糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)。近年来，随着经济的发展、生活水平的提高和居民生活模式的改变，糖尿病的患病率呈现出全球性的上升趋势，其中II型糖尿病占整个糖尿病的93.7%以上。胰岛素抵抗(Insulin Resistance)是指胰岛素的革巴器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，是II型糖尿病的主要特征，在II型糖尿病的发生、发展中起着至关重要的作用。因此，提高胰岛素敏感性，改善患者的胰岛素抵抗状态，对II型糖尿病及其并发症的治疗具有重要意义。海参为棘皮动物门海参纲楣手目动物，是海洋中重要的食物和药物资源。海参硫酸多糖是海参体壁的重要功效成分之一，主要包括海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯两种组分。其中，海参硫酸软骨素是一类具有硫酸岩藻糖支链的类硫酸软骨素，其单糖组成主要含有葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和岩藻糖等三种单糖，硫酸根含量约为35%。海参岩藻聚糖硫酸酯是一类主要由岩藻糖组成的直链硫酸多糖，其硫酸根含量约为32%。与已报道的海藻岩藻聚糖硫酸酯相比较，其化学结构差异较大但相对简单，硫酸根含量较高。有关海参硫酸多糖的应用，国内外主要集中在抗凝血、抗血栓、抗肿瘤和免疫调节、防治高尿酸血症等方面(文章例如 J Biol Chem, 2007，282: 14984-14991 ;食品科学，2012，33 (7): 251-255 ;营养学报，2011，33(6): 597-601。专利例如 CN031123457、CN2003101127139、CN2006101554645、CN2008101987443、CN2011100788764、CN201110345962.7)。但还没有海参硫酸多糖在治疗糖尿病方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供海参硫酸多糖的一种新用途。海参硫酸多糖可显著降低患者的空腹血糖，显著改善胰岛素抵抗，对预防、改善或治疗II型糖尿病具有显著的效果，同时无任何毒副作用，从而弥补现有技术的不足。为了解决上述技术 问题，本发明提供了一种海参硫酸多糖在制备预防、改善或治疗II型糖尿病的药物、保健食品或功能食品中的应用。其特征在于:所述的海参硫酸多糖为海参硫酸软骨素、海参硫酸软骨素低聚糖、海参岩藻聚糖硫酸酯、海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一种或几种；其中海参硫酸软骨素低聚糖和海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的分子量大于20KD。
所述海参硫酸多糖根据制备不同的药物，加入常规的赋形剂、崩解剂、粘合剂、增溶剂等制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液。这些剂型是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备。本发明提供了一种含有上述海参硫酸多糖的药物，所述药物制备成的药剂可以是胶囊制剂、口服液制剂、片剂、颗粒剂或散剂。本发明提供了一种含有上述海参硫酸多糖的保健食品本发明提供了一种含有上述海参硫酸多糖的功能食品本发明提供了上述药物、保健食品、功能食品在预防、改善或治疗II型糖尿病中的应用。本发明有益的技术效果在于:本发明海参硫酸多糖在预防、改善或治疗II型糖尿病的食品或药品的应用中，动物实验结果表明，海参硫酸多糖能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高葡萄糖耐量，降低空腹胰岛素含量和胰岛素抵抗指数，显著上调和激活胰岛素介导的PI3K/PKB/Glut4信号转导通路。另外，海参硫酸多糖还能显著协同噻唑烷二酮类抗糖尿病药物的降血糖和改善胰岛素抵抗作用，同时消除该类降糖药物的副作用。对胰岛素抵抗和预防、治疗II型糖尿病具有显著的效果。本发明中海参硫酸多糖的制备方法成本低，工艺步骤简单，可开发成安全有效地预防、改善或治疗II型糖尿病的食品或药品。
图1:本发明的海参硫酸软骨素对II型糖尿病小鼠骨骼肌中Glut4蛋白表达的影响。其中，T-Glut4和M-Glut4分别代表总Glut4和细胞外膜Glut4。##P〈0.01与正常对照组比较；#P〈0.01与模型对照组比较；*P〈0.05,**P<0.01与阳性对照组比较。
图2:本发明的海参岩藻聚糖硫酸酯对II型糖尿病小鼠骨骼肌中葡萄糖转运体4蛋白表达的影响。
具体实施例方式下面结合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术技术手段达成技术效果的过程充分理解和据以实施。本发明所用到的海参硫酸软骨素、海参硫酸软骨素低聚糖、海参岩藻聚糖硫酸酯、海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖可以为市售的产品，其一种制备方法如下:实施例1海参硫酸多糖的制备方法:1、海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的制备:将干海参去泥沙、粉碎，于95%乙醇中中脱脂24h，室温下晾干。向IOOg干物中加入3L 0.1M乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)、IOg木瓜蛋白酶、2.92g EDTA溶液和1.21 g半胱氨酸溶液，于60°C水浴下搅拌反应24h之后，反应混合物离心(4000g，15min)。向上清液加入160mL 10%的CPC溶液，室温下放置24h后，离心(3000g，15min)，弃去上清液。沉淀溶解于1.5L 3mol/L NaCl:乙醇(100:15v/v)溶液中，再加入3L 95%乙醇溶液，4°C放置24h，离心(3000g，15min)，沉淀用3L 80%和95%乙醇洗两到三次。最后将沉淀于60°C干燥2h，蒸馏水溶解，用截流分子量为6000Da的中空纤维膜超滤并脱盐，浓缩，冻干，得海参粗多糖。海参取4g海参粗多糖溶于IOOmL 25mmol/L NaH2PO4-NaOH (pH6.3)缓冲盐溶液中，过DEAE-52阴离子交换柱，采用0-1.4mol/L NaCl缓冲盐溶液进行梯度洗脱，流速为
0.5mL/min，每IOmin收集一管，于280nm处测吸光值检测蛋白含量，采用改良的苯酚-硫酸法检测各管的多糖含量，并通过液相TSK4000柱子检测组分单一的管。收集后透析，真空冷冻干燥，得海参硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯的纯品。2、海参硫酸软骨素低聚糖的制备方法:将约50mg的海参硫酸软骨素溶于ImL
0.05mol/L硫酸溶液中，80°C水解l_3h。水解液采用Ba(OH)2中和、离心。上清液采用Sephadex G_10脱盐，真空冷冻干燥，得相对分子量为20KD以上的海参硫酸软骨素低聚糖。3、海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的制备方法:将约50mg的海参岩藻聚糖硫酸酯溶于2mL 0.1 mol/L硫酸溶液中，80°C水解3_5h。水解液采用Ba(OH)2中和、离心、透析、真空冷冻干燥，得相对分子量为20KD以上的海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖。实施例2:海参硫酸软骨素对II型糖尿病小鼠的预防和治疗作用一.材料和方法:采用高糖高脂饲喂法建立II型糖尿病小鼠模型。将体重为19 - 21g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为6组:正常对照组、模型对照组、阳性对照组、海参硫酸软骨素(SC-CHS)低、高剂量组，高剂量海参硫酸软骨素与罗格列酮复配组，每组10只。正常对照组饲喂正常饲料，其配方中蛋白含量为20%，脂肪含量为5%，淀粉为65%，矿物质及维生素复合物均参照AIN-93配方；其他组别小鼠饲喂高糖高脂饲料，其配方中蛋白含量为20%，脂肪含量为25%，蔗糖为30%，矿物质及维生素 复合物均参照AIN-93配方。阳性对照组在高糖高脂饲料基础上添加0.075g/kg罗格列酮(Rosiglitazon，RSG)，剂量组在高糖高脂饲料基础上分别添加
0.4g/kg和1.2g/kg海参硫酸软骨素,复配组分别添加0.075g/kg罗格列酮和1.2g/kg海参硫酸软骨素。连续喂养60d，实验期间小鼠自由饮水和进食，每天记录食量，每三天记录小鼠体重。于末次喂食后，测定小鼠空腹血糖及口服葡萄糖耐受量、空腹血清胰岛素含量。剥离骨骼肌，测定骨骼肌中胰岛素介导的葡萄糖转运通路中相关基因的蛋白表达水平。1.空腹血糖测定:小鼠禁食不禁水8 h，尾静脉取血20 μ L，加入到0.4 mL蛋白沉淀剂中，混匀、离心、取上清液，参照试剂盒方法测定。2.口服糖耐量的测定小鼠禁食不禁水8 h，经口给予葡萄糖2 g/kg，分别测定给葡萄糖后0、0.5和2 h的血糖值，并按照公式计算曲线下面积(area under the curve, AUC) =0.25X (Oh血糖值+4 X 0.5h血糖值+3 X 2h血糖值)3.空腹血清胰岛素测定:小鼠禁食不禁水10h，摘眼球取血，常规分离血清，参照ELISA试剂盒方法测定血清胰岛素含量，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-1R) =HOMA-1R=空腹血糖浓度X空腹胰岛素含量/22.5。4.Western blotting 方法检测 PI3K、PKB 和 Glut4 的蛋白表达水平:用ImL Western及IP裂解液裂解骨骼肌或经胰岛素刺激的骨骼肌，提取总蛋白，蛋白含量采用双缩脲法测定。取50 μ g蛋白溶于5XSDS蛋白上样缓冲液中煮沸变性5min，行20%SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上，以5%牛血清白蛋白封闭2h。分别加入兔抗鼠 PI3K、pPI3K-p85、PKB、pPKBTyr3°8、pPKBSer473、Glut4 和 β -actin 等一抗，4°C孵育过夜，，4°C孵育过夜。BST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1: 5000)，室温孵育2h。TBST充分洗涤后，用化学发光试剂显影、曝光。用Image J图像分析软件对条带的灰度值进行分析，Glut4蛋白相对表达量用Glut4/ β -actin灰度比值表示。5.统计方法实验结果用表示。数据分析采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，并同时
进行LSD比较，以P〈0.05为具有统计学意义上的差异。二.实验结果:1.不同剂量海参硫酸软骨素均能显著降低II型糖尿病小鼠的空腹血糖含量，显著提高口服葡萄糖耐受量；显著降低II型糖尿病小鼠血清胰岛素含量，降低胰岛素抵抗指数，具有显著的降血糖和改善胰岛素抵抗的作用。高剂量海参硫酸软骨素的作用效果与罗格列酮的相当。当海参硫酸软·骨素与罗格列酮复配，能显著提高罗格列酮的疗效(见表I)。表I海参硫酸多糖对II型糖尿病小鼠空腹血糖值、糖耐量、空腹胰岛素含量的影响(n=10)
权利要求
1.海参硫酸多糖在制备抗II型糖尿病药物或制品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的海参硫酸多糖为海参硫酸软骨素、海参硫酸软骨素低聚糖、海参岩藻聚糖硫酸酯或海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一种或几种。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的海参硫酸多糖为海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的海参硫酸软骨素低聚糖和海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的分子量大于20KD。
5.海参硫酸多糖在制备治疗II型糖尿病药物佐剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的治疗II型糖尿病药物为噻唑烷二酮类抗糖尿病药物。
7.海参硫酸多糖 在制备治疗II型糖尿病食品中的应用。
8.如权利要求5或7所述的应用，其特征在于所述的海参硫酸多糖为海参硫酸软骨素、海参硫酸软骨素低聚糖、海参岩藻聚糖硫酸酯或海参岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的任一种或几种。
全文摘要
本发明公开了海参硫酸多糖在制备预防、改善或治疗II型糖尿病的药物、保健食品或功能食品中的应用。其特征是所述的海参硫酸多糖为海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯中的一种或2种。动物实验表明，所述海参硫酸多糖能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖含量，提高口服葡萄糖耐受量，降低胰岛素抵抗指数，显著上调和激活胰岛素介导的PI3K/PKB/Glut4信号转导通路。所述海参硫酸多糖还能显著协同噻唑烷二酮类抗糖尿病药物的作用，同时消除该类降糖药物的副作用。本发明所述海参硫酸多糖具有很好的降血糖和改善胰岛素抵抗的效果，可用于开发安全有效的预防、改善或治疗II型糖尿病的药物和制品。
文档编号A23L1/30GK103110659SQ20131006866
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者王静凤, 胡世伟, 常耀光, 龙腾腾, 石迪, 薛长湖, 王玉明 申请人:中国海洋大学