专利名称：一种定点突变改造的基因工程腈水解酶的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种定点突变方法制备具有改善的腈水解酶活性及降低的酰胺生成能力的基因工程真菌腈水解酶。其关键是真菌腈水解酶的定点改造、克隆、表达及产物的发酵表达及分离纯化制备，以及定点突变的基因工程菌在烟酸合成中的应用。
背景技术：
自1964年哈佛大学学者Thimann等人首次在大麦叶中发现并分离到了一种植物蛋白，也就是所说的腈水解酶。它能有效地水解吲哚乙腈合成生长激素吲哚乙酸(Thimann等，Arch Biochem Biophys 1964, 105 (I): 133-141 )。至今为止已发现来源于细菌、丝状真菌、酵母及植物体中的腈水解酶产生机体上百种，他们能将苯甲腈、丙烯腈、乙腈、甘氨腈等腈类化合物转化为相应的有机酸及氨基酸，并且能应用于腈污染废水的生物除污以及纺织工业中聚合材料的表面修饰。其中一些高效的腈水解酶应用于工业规模的羧酸生产中也已经取得了良好效果，如广州龙沙的烟酸工业生产工艺及三菱化工的扁桃酸生产工艺都是非常成功的案例，这也充分体现了腈水解酶的应用潜力。相关的研究与开发使得腈水解酶在制药、食品、化工、环保等领域具有广阔的应用前景。烟酸是维生素B3的前体，作为维生素类药物，可用于防治糙皮病等烟酸缺乏症；可用作血管扩张药，治疗高脂血症；也可用于治疗头痛、肺栓赛、冻伤等病症；作为医药中间体，烟酸可用于异烟肼、烟酰胺、烟酸肌醇酯等的生产；另外，烟酸的一个重要用途是可用做饲料添加剂。因此，目前市场需求量非常大。烟酸生产的传统工艺主要采用氨氧化法、气相氧化法及喹啶羟基化法等化学方法来进行生产(CN201210089804.4)。但是这些方法需要采用昂贵的催化剂进行反应，使用强酸碱使设备腐蚀严重，而且产率较低，使得产品的分离纯化难度加大，此外生产工艺过程对环境存在比较严重的污染(CN101550432)。
采用绿色环保的生物催化工艺进行烟酸生产在近年来受到了极大的关注。生物催化法反应条件温和、催化剂特异性高、选择性强、能耗少、催化剂制作成本低廉、工艺环境友好。这是化学生产工艺所无法比拟的。自上世纪80年代后期以来，全球已有多家机构开展了腈水解酶催化法制备烟酸工艺的研究。至今已有来自不同单位的学者分别采用细菌归属的玫瑰红球菌rhodochrous Jl (Mathew 等，Appl Environ Microbiol 1988, 54 (4):1030-1032),苍白芽抱杆菌 ifeciJJiAs pallidus (Almatawah 等，Enzyme Microb Technoll999, 25(8-9): 718-724),小球诺卡氏菌 Abcart/ia globerula (Sharma 等，Process Biochem2006,41 (9): 2078-2081),以及红球菌 TPAot/ococci/s sp.NDB 1165 (Prasad 等，World JMicrobiol Biotechnol2007, 23 (3):345-353)产生的腈水解酶作为催化剂生物转化3-氰基吡啶制备得到烟酸。而进入21世纪以来，来自捷克的学者研究发现真菌腈水解酶在比酶活、选择性方面特征具有更明显的优势，表现出比细菌腈水解酶更大的催化潜力(Vejvoda等，Process Biochem 2010, 45 (7): 1115-1120),他们以爺病键刀菌solaniOl和黑曲霉菌As/76 r^777w5.niger KlO为研究目标,将其应用于3-, 4-氰基卩比唳制备烟酸和异烟酸的生物转化中，取得了良好的效果(Martinkovdi等，Biotechnol Adv 2009, 27(6):661-670)。但是这两株菌所产生的真菌腈水解酶均存在微弱的腈水合酶活性，转化过程中在生成羧酸的同时会产生一定量的酰胺类化合物。而且研究表明这一副反应几乎存在于所有真菌腈水解酶的生物转化反应中。定点突变技术近年来在酶的基因工程改造中应用日益广泛，在提高酶活性、改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在腈水解酶的改造中还应用较少，尤其对于真菌腈水解酶，鲜有定点突变改造的文献报道，而在国内，尚未见任何关于基因工程改造真菌腈水解酶的文献或专利报道。因此，定点突变改造真菌腈水解酶的研究具有极佳的理论和应用价值。
发明内容
本发明总的目的是通过定点突变的方法对真菌腈水解酶基因进行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活性方面有所提高，在酰胺生成能力方面有所减弱；进一步，使定点突变改造后的腈水解酶得到高效表达，最终能达到工业化生产的要求。本发明的首要目的是对赤霉菌{GibberellaCA3-1 (该菌株为赤霉菌{Gibberella intermedia) CA3-1,保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.4903，保藏日期为2011年5月24日。)提供一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶具有更好的酶活性和更低的酰胺生成能力。本发明提供了一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.1，该成熟蛋白是由SEQ ID N0.2的核苷酸序列所编码的。本发明所述的一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，它是由氨基酸序列为SEQID N0.3的来源于赤霉菌的真菌腈水解酶中制造氨基酸取代而产生的，其特征在于所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于未突变的天然真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位谷氨酸Glu突变为缺失。本发明所述的氨基酸取代产生氨基酸序列为SEQ ID N0.3的真菌腈水解酶。本发明同时提供了一种改善氨基酸序列为SEQ ID N0.1的基因工程腈水解酶的酶活性的方法，该方法是通过在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。本发明同时提供了一种降低氨基酸序列为SEQ ID N0.1的基因工程腈水解酶的酰胺生成能力的方法，该方法是通过在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。本发明还提供了一种DNA分子，其编码如前所述的基因工程腈水解酶。本发明还提供了一种重组质粒，`其含有如前所述的DNA分子。本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的DNA分子，或含有如前所述的重组质粒。将定点突变获得的基因工程腈水解酶重组质粒转入大肠杆菌疋coliRosetta-gami (DE3)宿主中，实现高效表达。本发明所述的具有生物活性的基因工程腈水解酶可以通过IPTG诱导的方式大量产生获得。通过亲和层析方法，对定点突变的基因工程腈水解酶进行了分离纯化，得到了高活性的基因工程腈水解酶。结果表明，以3-氰基吡啶为底物，定点突变的基因工程腈水解酶较未突变的天然腈水解酶比酶活提高了 80%以上，比酶活达到5.1 U/mg ;酰胺生成量降低了 30%，仅为 1.75%。本发明还提供了一种基因工程腈水解酶用于烟酸合成的方法，该方法包括:在适合的条件下收集如前所述的基因工具腈水解酶产生的宿主细胞，添加底物3-氰基吡啶在一定温度下进行生物转化反应。本发明所提供的基因工程腈水解酶具有更高的催化活力和更低的酰胺生成能力，具备一定的工业应用潜力，为真菌腈水解酶在烟酸合成中的大规模、低成本应用奠定了基础。本发明的优点和有益效果:
通过定点突变，对真菌腈水解酶的氨基酸序列第144位Glu进行了敲除，构建了一种基因工程腈水解酶，大大提高了真菌腈水解酶的催化活力，并且使真菌腈水解酶的酰胺生成能力显著降低，减少了转化过程中的酰胺生成量。目前，这是国内对真菌腈水解酶进行定点改造的首次研究报道。
具体实施例方式实施例1
本发明以赤霉菌来源的真 菌腈水解酶基因序列为参考，设计并合成两条寡聚核苷酸引物，采用未突变的重组质粒，通过反向PCR的方法扩增突变质粒。两条寡聚核苷酸引物如下:
Forward primer:TACGGTGACGGACAGGGCTCTCTGAReverse primer:ATTGGTCAGAGAGCCCTGTCCGTCACPCR反应体系为:__
Pfuenzyme0.5 μ L
IOXbuffer5 μ L
TemplateDNAIuL
ddH2Q■ 38.5 μ L
dNTP~3μ L Forwardprimer IuL Reverseprimer IuL Total 50 μ L
PCR程序条件设定为:94°C预变性4 min;94°C变性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸8
min，35个循环；72°C终延伸60 min。对扩增获得的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，采用DNA胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收。实施例2
割胶回收获得的PCR产物采用/I限制性内切酶进行酶切消化，酶切条件:37°C温浴0.5 h。酶切反应体系如下
权利要求
1.一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.1 ο
2.权利要求1所述的基因工程腈水解酶的生产方法，其特征在于:它是由氨基酸序列为SEQ ID N0.3的来源于赤霉菌的真菌腈水解酶中制造氨基酸取代而产生的，所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于未突变的天然真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位谷氨酸Glu突变为缺失。
3.一种改善权利要求1所述的基因工程腈水解酶的酶活性的方法，该方法是通过在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。
4.一种降低权利要求1所述的基因工程腈水解酶的酰胺生成能力的方法，该方法是通过在SEQ ID N0.3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。
5.一种DNA分子，其编码如权利要求1所述的基因工程腈水解酶。
6.根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于:其核苷酸序列为SEQID N0.2。
7.—种重组质粒，其特征在于:其含有权利要求6所述的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于:其含有权利要求6所述的核苷酸序列，或者含有权利要求7所述的重组质粒。
9.一种基因工程腈水解酶用于烟酸合成的方法，其特征在于，该方法包括:在适合的条件下收集如前所述的基因工具腈水解酶产生的宿主细胞，添加底物3-氰基吡啶在一定温度下进行生物转化反应 。
全文摘要
本发明涉及通过基因工程改造得到的真菌腈水解酶。本发明所述的一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，其特征在于所述定点突变的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于天然的真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位Glu被敲除。本发明还公开了所述的基因工程腈水解酶的生产方法及其在烟酸合成中的应用。本发明所述的基因工程腈水解酶在催化活力方面更加优良，副产物酰胺的生成能力明显降低，为其在烟酸合成中的大规模、低成本的工业应用奠定了基础。
文档编号C12P17/12GK103184210SQ201310069190
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者龚劲松, 熊雷, 许正宏, 史劲松, 李恒, 孙文敬, 周强 申请人:江南大学, 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司