一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤：制备连续梯度的蔗糖溶液，制备混合病毒液，制备病毒悬液，密度梯度离心。本发明分离方法能有效的获得单一纯化的病毒，为临床上混合感染多种病毒的临床样品的分离纯化提供了切实可行的分离方法，特别是对于新出现的毒株或者变异株在常规方法无法分离的情况下，蔗糖连续密度梯度离心能准确、快速的完成病毒分离的工作，为疫病的研究和防控打下基础。
【专利说明】一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒的分离方法，尤其涉及一种新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法。
【背景技术】
[0002]番鸭呼肠孤疫苗是目前番鸭群中应用最为广泛的弱毒疫苗之一，该病毒在番鸭体内带毒的情况很普遍。番鸭呼肠孤病毒作为RNA病毒变异非常快，难于防控。因此，分离纯化混合样品中的新型鸭呼肠孤病毒对番鸭呼肠孤病的监控至关重要。
[0003]目前常用分离纯化病毒的方法有血清中和实验与不同宿主细胞增殖实验，但是这两种实验方案均不能分离同源性高的病毒株。但由于新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的抗原决定簇的同源性为60%左右，现有的血清中和实验与不同宿主细胞增殖实验都不能单独分离出混合样品中的新型鸭呼肠孤病毒。
[0004]血清中和实验是利用血清中特定抗原的高抗体来中和混合样品中的此种抗原，从而达到分离出其他抗原的目的。该方法适用于不同抗原间无抗体交叉反应的情况，由于新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的抗原决定簇有60%左右的同源性，导致抗体交叉反应的概率较大，因此很难找到合适的阳性血清稀释度能单独中和番鸭呼肠孤疫苗株，而保留新型鸭呼肠孤病毒。
[0005]不同宿主细胞增殖实验是利用不同病毒对不同的宿主嗜性不一致而使其中一种病毒能顺利繁殖，其它病毒不能增殖，经过几轮传代后，可以将其它杂病毒过滤掉，得到纯化的单一病毒。新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤疫苗株都能在无特定病原菌的鸡胚、普通鸭胚、鸭胚成纤维细胞上繁殖，培养条件和生长特性无明显差异，因此无法用这种分离方法得到纯化的新型鸭呼肠孤病毒。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，有必要针对新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株难于分离的问题，提供一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法。
[0007]一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤:
[0008]I)制备连续密度梯度的蔗糖溶液:从上向下依次采用浓度为20%、30%、40%和50%的蔗糖溶液，4°C过夜得到连续密度梯度的蔗糖溶液；
[0009]2)制备混合病毒液:对病料中分离得到的新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的混合病毒，进行扩大培养，得到混合病毒液；
[0010]3)制备病毒悬液:在浓缩管中加入混合病毒液，然后在管底加入低浓度蔗糖溶液，冷冻离心，浓缩后将沉淀溶于少量PBS中制成病毒悬液；
[0011]4)密度梯度离心:将步骤3)制得的病毒悬液加入步骤I)中的连续密度梯度的蔗糖溶液中，冷冻离心后，将离心液等分成若干份，得到含有单一的新型鸭呼肠孤病毒的样品O[0012]优选地，步骤I)中浓度为20%、30%、40%和50%的蔗糖溶液的体积比为1:1:1:1。
[0013]优选地，步骤3)中低浓度蔗糖溶液为15-25%浓度的蔗糖溶液。
[0014]优选地,步骤3)中的冷冻离心为40，OOOrpm,4°C离心60min。
[0015]优选地,步骤4)中的冷冻离心为26，500rpm,4°C离心120min。
[0016]优选地，步骤4)中的加入病毒悬液的体积为加入连续密度梯度的蔗糖溶液体积的
10%-15%O
[0017]密度梯度离心，是利用一定的介质(如氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖)在离心管中形成连续或不连续的密度梯度，将病毒、蛋白、DNA悬液或其它匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使同一浮力密度的物质聚集在同一层，从而获得单一的某种成份。密度梯度离心又可分为不连续梯度密度和连续梯度密度2种。不连续梯度密度通常是将不同浓度的蔗糖依次缓慢加注到离心管中，各浓度之间形成明显的界面，具有密度梯度的陡坡；连续密度梯度是将配置好的不连续密度梯度蔗糖放在4°C冰箱中过夜，依靠分子扩散的作用，形成稳定连续的密度梯度，各浓度之间界面消失，介质密度梯度平缓。
[0018]密度梯度离心可用于病毒、DNA和蛋白质的纯化，但都是将一种成分与其他成分分离开。当密度梯度离心用于病毒纯化时，只能将病毒与其他非病毒杂质分开，不能将同源性闻的不同病毒株分开。
[0019]不同病毒由于核酸物质和蛋白质大小不同，会导致浮力密度之间有差异，在本发明分离方法中，它们会分散在不同的密度梯度中，通过分段收集超速离心后的样品可以得
到单一的病毒。
[0020]本发明从混合病 毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法能有效的获得单一纯化的病毒，为临床上混合感染多种病毒的临床样品的分离纯化提供了切实可行的分离方法，特别是对于新出现的毒株或者变异株在常规方法无法分离的情况下，蔗糖连续密度梯度离心能准确、快速的完成病毒分离的工作，为疫病的研究和防控打下基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是蔗糖密度梯度离心样品RT-PCR鉴定电泳图。
[0022]图1A是番鸭呼肠孤疫苗株特异性引物RT-PCR鉴定电泳图，M:DL2000DNA Marker,Y为番鸭呼肠孤疫苗株阳性对照，NI为番鸭呼肠孤疫苗株阴性对照，1-28号为样品。
[0023]图1B是新型鸭呼肠孤病毒特异性引物RT-PCR鉴定电泳图，M:DL2000DNA Marker,P为新型鸭呼肠孤病毒阳性对照，N2为新型鸭呼肠孤病毒阴性对照，1-28号为样品。
[0024]图2是纯化的新型鸭呼肠孤病毒样品RT-PCR鉴定电泳图，M:DL2000DNAMarker, P为新型鸭呼肠孤病毒阳性对照，NI为新型鸭呼肠孤病毒阴性对照，Y为番鸭呼肠孤疫苗株阳性对照，N2为番鸭呼肠孤疫苗株阴性对照，X1、Zl为纯化样品用新型鸭呼肠孤病毒特异性引物检测，X2、Z2为纯化样品用番鸭呼肠孤病毒疫苗株特异性引物检测。
【具体实施方式】
[0025]为了更好的理解本发明，下面结合【具体实施方式】和附图作进一步说明。需要说明的是，为了使本发明更简洁，本领域的普通技术人员所熟知的实验方法、步骤和条件等可按常规操作，未在本发明中详细记载。[0026]本发明中使用的主要试剂与仪器有:鹿糖,Thermo PCR仪,AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat N0.:AP-MN-BF-VNA-250),TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR KitVer.2 (TaKaRa Code:DRR055A)。
[0027]本发明中的病料为2012年上半年采自广东省5-10日龄发病番鸭表现鸭出血性坏死性肝炎典型病变的肝、脾等组织，番鸭呼肠孤疫苗株为DRV弱毒苗购自青岛精灵生物科技研究所。
[0028]实施例1
[0029]一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤:
[0030]I)制备连续密度梯度的蔗糖溶液:从上向下依次采用等体积的浓度为20%、30%、40%和50%的蔗糖溶液，4°C过夜得到连续密度梯度的蔗糖溶液；
[0031]2)制备混合病毒液:采用常规方法从病料中分离得到新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的混合病毒，采用细胞培养方式对上述混合病毒进行扩大培养，得到混合病毒液；
[0032]3)制备病毒悬液:在浓缩管中加入混合病毒液然后在管底加入20%浓度的蔗糖溶液约4-5mL，以盖住管底为宜；在40，OOOrpm, 4°C的条件下超速冷冻离心60min，浓缩后将沉淀溶于少量PBS中制成病毒悬液；其中的蔗糖溶液可以对大分子杂质起到过滤的作用；
[0033]4)密度梯度离心:将步骤3)制得的病毒悬液加入步骤I)中的连续密度梯度的蔗糖溶液中，加入病毒悬液的体积为加入连续密度梯度的蔗糖溶液体积的10%-15% ；在26，500rpm, 4 °C条件下超速冷冻离心120min,将离心液从上到下等分成若干份，每份300 μ L，得到含有单一的新型鸭呼肠孤病毒的样品。
[0034]实施例2RT-PCR鉴定
[0035]将实施例1中密度梯度离心后得到的样品，从上到下依次编号为1-28号，进行RT-PCR，检测样品中是否为单一的新型鸭呼肠孤病毒。
[0036]2.1RNA模板制备
[0037]使用AxyPr印体液病毒 DNA/RNA 小量试剂盒(Cat N0.:AP-MN-BF-VNA-250)提取模板RNA，-70°C保存。
[0038]2.2PCR鉴别引物
[0039]新型鸭呼肠孤病毒特异性引物:
[0040]Fl (SEQ ID N0.1):5’-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3’
[0041]Rl (SEQ ID N0.2):5’-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3’
[0042]番鸭呼肠孤疫苗株特异性引物:
[0043]F2 (SEQ ID N0.3):5’-TCGGACCTCGATGTGTGGTGGT-3’
[0044]R2 (SEQ ID N0.4):5，-TTCGAGACCGACCGCACAGGTGAAT-3，
[0045]2.3PCR 反应
[0046]反应体系:使用TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRaCode:DRR055A)PCR试剂盒，反应体系为25 μ L体系，具体如表I所示。
[0047]表IPCR反应体系
[0048]
【权利要求】
1.一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备连续密度梯度的蔗糖溶液:从上向下依次采用浓度为20%、30%、40%和50%的蔗糖溶液，4°C过夜得到连续密度梯度的蔗糖溶液； 2)制备混合病毒液:对病料中分离得到的新型鸭呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤疫苗株的混合病毒，进行扩大培养，得到混合病毒液； 3)制备病毒悬液:在浓缩管中加入混合病毒液，然后在管底加入低浓度蔗糖溶液，冷冻离心，浓缩后将沉淀溶于少量PBS中制成病毒悬液； 4)密度梯度离心:将步骤3)制得的病毒悬液加入步骤I)中的连续密度梯度的蔗糖溶液中，冷冻离心后，将离心液等分成若干份，得到含有单一的新型鸭呼肠孤病毒的样品。
2.根据权利要求1所述的从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，步骤O中浓度为20%,30%,40%和50%的蔗糖溶液的体积比为1:1:1:1ο
3.根据权利要求1所述的从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，步骤3)中低浓度蔗糖溶液为15-25%浓度的蔗糖溶液。
4.根据权利要求1所述的从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠 孤病毒的方法，其特征在于，步骤3)中的冷冻离心为40，OOOrpm,4°C离心60min。
5.根据权利要求1所述的从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，步骤4)中的冷冻离心为26，500rpm,4°C离心120min。
6.根据权利要求1所述的从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，步骤4)中的加入病毒悬液的体积为加入连续密度梯度的蔗糖溶液体积的10%-15%。
【文档编号】C12R1/93GK103451157SQ201310294686
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】雷雯, 李海燕, 陈 峰, 张祥斌, 招丽婵, 操胜, 覃健萍 申请人:广东温氏食品集团股份有限公司