一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法。以持续、光-暗交替或间隔短中的一种或几种组合光照方式对木霉进行0.1—100μmol·m-2·s-1的光强进行光照诱导使其发酵，进而得到纤维素酶。本发明提供的利用光照诱导提高木霉菌产纤维素酶产量的方法，可操作性强，成本低廉，便于规模化生产应用。
【专利说明】一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法。
【背景技术】
[0002]纤维素(cellulose)是由光合作用生成的最丰富的植物材料，也是自然界中最具潜力的一种可再生资源，利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖，进一步发酵生产生物燃料或者生物基材料化学品等，对于解决当前人类面临的能源短缺、环境污染等问题，以及促进可持续发展等具有重要意义。
[0003]纤维素酶(cellulases)是水解纤维素生成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖的酶。纤维素酶是一种复合酶，主要由三种成分组成，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶，三种成分协同作用降解纤维素大分子。微生物特别是真菌具有产生这种复合酶的能力，其中产酶活力较强的有木霉、曲霉、根霉和青霉等，尤以木霉属菌种居多。随着能源需求的不断增加和环境问题的日益严重，纤维素原料作为一种储量丰富、价格低廉的可再生资源，在生物燃料及相关高附加值产品领域的应用已成为一个研发热点。纤维素酶水解是纤维素生物炼制的主要瓶颈之一。纤维素酶水解目前面临的主要问题是纤维素酶的用量大、成本较高。我国对于纤维素酶有着很高的市场需求，但迄今为止仍未解决规模生产纤维素酶的难题(Y Qu, M Zhu, K Liu, X Bao, J Lin, Studies on cellulosic ethanol product1n forsustainable supply of liquid fuel in China, B1technol.J., 2006, I, 1235 - 1240)。诺维信、杰能科等国外公司产品的垄断造成市场价格居高不下。因此提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的生产成本是高效利用纤维素可再生资源亟待解决的问题。简便、高效的纤维素酶生产过程是目前要实现纤维素酶工业化生产必备的前提条件。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，以持续、光-暗交替或间隔短中的一种或几种组合光照方式对木霉进行0.1-100 μ mol.m_2.s—1的光强进行光照诱导使其发酵，进而得到纤维素酶。
[0007]进一步的说，采用可见自然光、灯光或单色蓝光的一种或几种方式以持续、光-暗交替或间隔短中的一种或几种组合光照方式对木霉进行光照诱导。
[0008]光-暗交替指相同时间的光照-黑暗交替，例如6小时光照一6小时黑暗一6小时光照一6小时黑暗或者12小时光照一 12小时黑暗一 12小时光照一 12小时黑暗间隔的交替；短时光照指在黑暗的条件下给予短时间的光照，例如12小时黑暗一I小时光照一 12小时黑暗一I小时光照或者12小时黑暗一30分钟光照一 12小时黑暗一30分钟光照的交替。
[0009]具体的说，
[0010]将里氏木霉菌孢子液接种于pH值在3.5-5.5 (优选4.5)的液体种子培养基中，并给予0.1 μ mol.m_2.s—1 —100 μ mol.m_2.s—1的光照对孢子液进行光照诱导培养；
[0011]上述诱导培养后种子液接种于pH值在3.5—5.5 (优选4.5)发酵产酶培养基中，并给与0.1 μ mol.πΓ2.s_1一100 μ mol.πΓ2.s_1的光照对种子液进行光照诱导发酵培养，进而得到纤维素酶。
[0012]进一步的说，将环里氏木霉新鲜孢子液接种于液体种子培养基中，并给予
0.1 μ mol.πΓ2.s-1 —100 μ mol.πΓ2.s_1的光照对孢子液进行光照诱导培养18-48小时；
[0013]上述培养后种子液按5%接种量(体积比)接种于发酵产酶培养基中，进行光照诱导发酵培养7至15天，进而得到纤维素酶。
[0014]所述发酵产酶培养基中碳源为可溶性碳源或者微溶的微晶纤维素类或不溶性纤维素类碳源。
[0015]本发明所具有的优点:本发明提供的利用光照诱导提高木霉菌产纤维素酶产量的方法，可操作性强，成本低廉，便于规模化生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1A为本发明实施例提供的微晶纤维素为碳源时，光照对QM9414产纤维素酶滤纸酶活的诱导图。
[0017]图1B为本发明实施例提供的微晶纤维素为碳源时，光照对QM9414产纤维素酶羧甲基纤维素CMC酶活的诱导图，
[0018]其中，DD持续黑暗；LL持续光照；D_L持续黑暗-转入光下I小时-持续黑暗；D-L-D-L黑暗培养中给予两次的间隔光照，间隔光照时间为I小时；D-L-D-L-D-L黑暗培养中给予三次的间隔光照，间隔光照时间为I小时。
[0019]图2为本发明实施例提供的乳糖为碳源及诱导物时，光照对QM9414产纤维素酶的诱导效果图。
[0020]图3为本发明实施例提供的不同强度光对QM9414产纤维素酶的诱导效果图，
[0021]其中，DD持续黑暗；LL (3 μ m)光强为3 μ mol.m_2.s-1下持续光照；LL (30 μ m)光强为30 μ mol.πΓ2.s_1下持续光照;D_L (3 μ m) -D持续黑暗转入强度为3 μ mol.πΓ2.s_1光下I小时，后转入持续黑暗A-L(SOym)-D持续黑暗转入强度为30 μ mol.m_2.s—1光下I小时，后转入持续黑暗。
【具体实施方式】
[0022]将通过参考下面的定义和实施例结合附图对本发明做进一步的详细说明，此处提及的所有的专利及出版物，都以引用方式并入。
[0023]除非本文另有定义，此处应用的所有技术术语和科学术语，皆具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的含义。
[0024]应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明不限于所描述的具体的方法学、方案和试剂。
[0025]本文提出的标题不是对本发明各个发明或者各种实施方案的限制，应将整个说明书作为一个整体来参考。
[0026]本文引用的所有出版物均通过引用方式并入本文，以用于描述和揭示可能与本发明联系使用的组合及方法。
[0027]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。以下实施例中的试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0028]里氏木霉(Trichodermareesei )QM9414菌株:美国模式培养物集存库(简称ATCC，网址 www.atcc.0rg), ATCC 编号为 26921。
[0029]羧甲基纤维素钠CMC-Na购自sigma公司。
[0030]实施例1
[0031]选用里氏木霉QM9414为生产菌种,微晶纤维素为碳源
[0032]取3环平板上活化好的菌种，接种在种子培养基中，30摄氏度，200rpm振荡培养24小时，在此期间给予光照。
[0033]将种子按5% (体积比)的接种量接种发酵培养基，共接5组，每组3个平行。32摄氏度，220rpm振荡培养24小时后，转入30摄氏度，220rpm振荡培养。
[0034]种子培养基的组成包括:
[0035]葡萄糖10g/L，玉米浆 10g/L，KH2P0415g/L，(NH4) 2S045g/L，MgSO4.7Η200.6g/L, CaCL20.5g/L, FeSO4.7H205mg/L, MnSO4.H2Ol.6mg/L, ZnSO4.7H201.4mg/L,CoCL2.6H200.37mg/L,调节 pH 值为 4.5。
[0036]发酵培养基的组成包括(w/v):
[0037]葡萄糖4.5g/L,微晶纤维素 30g/L,玉米衆 25g/L, KH2P042g/L, (NH4)2SO4L 4g/L,MgSO4.7Η200.3g/L, CaCL20.45g/L，FeSO4.7H205mg/L，MnSO4.H2Ol.6mg/L, ZnSO4 *7H201.4mg/L, CoCL2.6H200.37mg/L，调节 pH 值为 4.5。
[0038]第I组的12个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗，分别培养48小时、72小时、96小时及120小时时分别取出，离心取上清液得到粗酶液；分别记为DD48，DD72，DD96，DDI20 ；
[0039]第2组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续光照，光强为30 μ mol.m_2.s—1，培养48小时，72小时，96小时及120小时时分别取样，离心取上清液得到粗酶液；分别记为LL48, LL72, LL96, LL120 ；
[0040]第3组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入光照下I小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1;后继续转入持续黑暗，至71小时后，转入光下I小时，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1-D71-L1 ；
[0041]第4组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入光照下I小时，后继续转入持续黑暗，至71小时，转入光照下I小时后，继续转入持续黑暗至95小时，转如光下I小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1-D71-L1-D95-L1 ；
[0042]第5组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗71小时后，转入光照下I小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D71-L1;后继续转入持续黑暗，至95小时，转如光下I小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D71-L1-D95-L1 ;后继续转入暗培养，至119小时，转入光下I小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D71-L1-D95-L1-D119-L1 ；
[0043]将得到的各个粗酶液参照IUPAC标准方法进行纤维素滤纸酶活及羧甲基纤维素钠 CMC 酶活测定(参照 Ghose, Pure&App.Chem.，Vol.59，N0.2，pp.257-268，1987 及Laboratory Analytical Procedure (LAP)所述关于纤维素酶酶活测定方法)
[0044]滤纸酶活计算:根据葡萄糖标准曲线，计算待测酶液中释放2.0mg葡萄糖所需的稀释系数，则FPU=0.37/ (释放2.0mg葡萄糖的稀释系数)
[0045]羧甲基纤维素钠CMC酶活计算，在50°C，pH为4.80条件下，每分钟每毫升酶液从浓度为5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放I μ mol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(U)，还原糖以葡萄糖等量。
[0046]结果如图1所示，持续的光照以及间隔短时光照均大幅提高了纤维素酶的滤纸酶活及CMC酶活。
[0047]实施例2
[0048]选用里氏木霉QM9414为生产菌种，乳糖为碳源及诱导物
[0049]菌种活化及种子培养同实施例1。
[0050]将种子按5%的接种量接种发酵培养基，共接5组，每组3个平行。32摄氏度，220rpm振荡培养24小时后，转入30摄氏度，220rpm振荡培养。
[0051]发酵培养基的组成基本同实施例1，将实施例1中的碳源换为2.6%的乳糖
[0052]第I组的3个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗，分别培养48小时，72小时，96小时时取出，离心取上清液得到粗酶液；分别记为D48，D72，D96 ；
[0053]第2组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续光照，光强为30 μ mol.πΓ2 μ—1，培养48小时，72小时，96小时时分别取样，离心取上清液得到粗酶液；分别记为L48，L72，L96 ；
[0054]第3组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入光照下I小时(光照强度为3μπι01.πΓ2.s—1)，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1;后继续转入持续黑暗，至72小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1-D72 ；
[0055]第4组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入光照下I小时(光照强度为3μπι01.πΓ2.s—1)，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1;后继续转入持续黑暗，至71小时，转入光下I小时(光照强度为3 μ mol.m_2.s—1)，后继续转入持续黑暗，至96小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D47-L1-D71-L1-D96 ；
[0056]第5组的三个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗71小时后，转入光照下I小时(光照强度为3 μ mol.πΓ2.s—1)，取样，离心取上清液得到粗酶液，记为D71-L1 ;后继续转入持续黑暗，至96小时，取样，离心取上清液得到粗酶液；记为D71-L1-D96 ；
[0057]将得到的各个粗酶液进行纤维素酶活性测定，具体方法同实施例1，结果如图2所示，当以乳糖为碳源及诱导物时，持续光照及间隔短时光照均对纤维素酶有诱导作用。
[0058]实施例3
[0059]选用QM9414为生产菌种，微晶纤维素为碳源，不同强度光对产酶影响
[0060]菌种活化及种子培养同实施例1。发酵培养基组成及培养条件同实施例1。
[0061]第I组的3个平行，记为ck，在发酵产酶阶段维持持续黑暗，培养到48小时，72小时，120小时时取样，离心取上清液得到粗酶液；
[0062]第2组的3个平行，记为Light3 μ mol,在发酵产酶阶段维持持续光照，在暗摇床内安装一个22W的白炽灯，将摇瓶放置在合适的位置，以光度计测定光强为3 μ mol.πΓ2.s—1，培养到48小时，72小时，120小时时取样，离心取上清液得到粗酶液；
[0063]第3组的3个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入3 μ mol光照下I小时，后继续转入持续黑暗，至72小时，离心取上清液得到粗酶液，记为047-?(3μπιΟ1);
[0064]第4组的3个平行，记为Light30 μ mol，在发酵产酶阶段维持持续光照，光强为30 μ mol.m_2.s—1，培养到48小时，72小时，120小时时取样，离心取上清液得到粗酶液；
[0065]第5组的3个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗47小时后，转入30 μ mol光照下I小时，后继续转入持续黑暗，至72小时，记为047-?(30μπιΟ1);
[0066]第6组的3个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗72小时后，转入3 μ mol光照下I小时，后继续转入持续黑暗，至120小时，离心取上清液得到粗酶液，记为D72-L (3 μ mol);
[0067]第7组的3个平行，在发酵产酶阶段维持持续黑暗72小时后，转入30 μ mol光照下I小时，后继续转入持续黑暗，至120小时，记为072-?(30μπιΟ1);
[0068]将得到的各个粗酶液纤维素酶活性测定，检测不同强度光照对产酶的影响，酶活性测定具体方法同实施例1，结果如图3所示，光的强度对纤维素酶的诱导作用影响不大，即使微弱的光(本例中为3μπι01)也能大幅提高酶活。
[0069]上述参照实施例对利用光照诱导发酵生产纤维素酶的方法进行的详细描述，是说明性的而非限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:以持续、光-暗交替或间隔短中的一种或几种组合光照方式对木霉进行0.1 — ΙΟΟμπιοΙ.πΓ2.S-1的光强进行光照诱导使其发酵，进而得到纤维素酶。
2.按权利要求1所述的利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:采用可见自然光、灯光或单色蓝光的一种或几种方式以持续、光-暗交替或间隔短中的一种或几种组合光照方式对木霉进行光照诱导。
3.按权利要求1或2所述的利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，其特征在于: 将里氏木霉菌孢子液接种于pH值在3.5—5.5的液体种子培养基中，并给予0.1 μ mol.m_2.s—1—100 μ mo I.m_2.s-1的光照对孢子液进行光照诱导培养； 上述诱导培养后种子液接种于pH值在3.5 — 5.5发酵产酶培养基中，并给与0.1 μ mol.πΓ2.s_1一 100 μ mol.πΓ2.s_1的光照对种子液进行光照诱导发酵培养,进而得到纤维素酶。
4.按权利要求3所述的利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，其特征在于: 将里氏木霉新鲜孢子接种于液体种子培养基中，并给予0.Ιμπιο?.πΓ2.s-1-100 μ mol.m_2.s—1的光照对孢子液进行光照诱导培养18-48小时； 上述培养后种子液按5%接种量(体积比)接种于发酵产酶培养基中，进行光照诱导发酵培养7至15天，进而得到纤维素酶。
5.按权利要求4所述的利用光照诱导提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:所述发酵产酶培养基中碳源为可溶性碳源或者微溶的微晶纤维素类或不溶性纤维素类碳源。
【文档编号】C12R1/885GK104419692SQ201310383341
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】吕雪峰, 王敏, 李建军 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所