一种类辅脂酶2基因的干扰片段及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种类辅脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干扰片段及其应用，属于生物技术与医药领域。本发明检测了Clpsl2mRNA和蛋白在附睾中的表达定位，发现Clpsl2在附睾头部上皮细胞中合成，并分泌到管腔，与附睾管腔中的精子头部的顶体和精子尾部的主段特异结合。公开了Clpsl2的干扰片段，其核苷酸序列为：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睾中通过该干扰片段敲低Clpsl2表达后小鼠附睾尾部的精子数量减少、精子运动力减弱，且与雌鼠交配后孕鼠的胚胎数减少，且多个胚胎发育不正常，在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟相关药物制备中应用。
【专利说明】一种类辅脂酶2基因的干扰片段及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术与医药领域，特别涉及一种类辅脂酶2 (colipase-like2,Clpsl2)基因的干扰片段及其应用。
【背景技术】
[0002]近几年对人类的调查发现，男性精液质量和生殖力在逐步下降。据统计，在中国育龄夫妇中不孕不育的发病率为10-15%，其中男性因素占40%左右。临床发现很多不孕不育病例与精子数量、密度、成熟(运动、获能、顶体反应等)异常相关。另一方面，长期以来，避孕主要是针对育龄妇女，随着国际人权条约的签署，社会对男性避孕提出了倡导和要求，开发自主产权的男性避孕药有利于中国在避孕药市场上提高国际竞争力。
[0003]附睾是男性生殖器官中的重要环节之一，是精子储存、运输、成熟的关键场所。精子运动能力的形成、顶体功能的完善、代谢类型的转变、精卵的识别和融合等一系列程序化成熟功能的获得都是在附睾微环境中完成的。附睾中特异表达的蛋白将有助于解决精子成熟异常引起的不育、不孕症。同时由于附睾功能相对单一，干扰其功能的药物不至于引起严重的副反应；其次，精子进入附睾前，分化已经完全，DNA复制及转录均停止，在这个阶段药物作用不会引起DNA遗传病，因此附睾也是一个理想的避孕靶器官，而仅在附睾中表达的特异蛋白也成为男性避孕药开发的理想靶点。
[0004]本发明所涉及的Clpsl2为一个功能未知的附睾特异表达的基因，其mRNA主要在附睾头部组织表达，且具有雄激素依赖性和时间特异性。目前仅有两篇文章略略提及Clpsl2，其一为oh等(2006) 在对40个附睾特异表达基因的mRNA表达特性进行分析时包含这个基因(Mm.99400);中科院生化所张永莲院士(2008)通过建库分析人的附睾特异表达基因也发现了这个基因(con32)在附睾头部和体部表达。在前期我们通过原核表达制备了小鼠Clpsl2包涵体蛋白作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗血清，也通过融合表达系统制备了 Clpsl2的蛋白初步分析了其辅脂酶活性。但是目前对Clpsl2的表达定位及在附睾体内参与的生物学功能都不清楚，因此也限制了其开发使用。
[0005]虽然对附睾特异的Clpsl2的相关工作没有开展，但是已经有部分实验室已经开始探索附睾中特异表达的基因及蛋白的功能，在国际上享有盛名的就包括中科院生化所张永莲院士团队。他们对一系列的附睾特异表达基因的特性及功能进行了初步研究，如研究发现LCN6表达于附睾起始部位的大部分的主细胞，与精子的顶体及中段结合，参与了精子运动能力的获得(史毅，大鼠附睾特异性基因Lcn6的表达特性和功能研究，中国科学院研究生院上海生命科学研究院博士学位论文，2007)。同时也对部分附睾特异功能基因及蛋白申请了专利用于保护其所发现的附睾特异基因或者蛋白在精子成熟中的功能(CN1689640)或者保护制备调控雄性生育能力用的药物中、开发男性避孕药及制备诊断和治疗雄性不育症的药物中的用途(专利申请号201010129861)。但目前虽然已对附睾中特异表达的部分基因及蛋白的功能解析，但用于雄性精液原因引起的不孕不育的诊断和治疗，或者作为雄性避孕药物设计的靶点开发相应的药物都还处于设计阶段。
【发明内容】
[0006]为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种类辅脂酶2(colipase_like2, Clpsl2)基因的干扰片段。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述类辅脂酶2基因的干扰片段的用途。
[0008]本发明的目的通过下述的技术方案实现:一种类辅脂酶2 (Clpsl2)基因的干扰片段，其核苷酸序列为:RNA1-Nol:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。
[0009]所述的类辅脂酶2 (Clpsl2)基因的干扰片段，能够引起小鼠精子数量减少、精子的运动性能减弱和精子活性的降低，在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟相关药物制备中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为Clpsl2mRNA在附睾组织中的原位杂交表达定位分析图；Clpsl2蛋白在附睾头部特异的表达，在附睾体、附睾尾及睾丸中无表达；途中深黑色表示Clpsl2的阳性表达信号。
[0011]图2为Clpsl2蛋白在附睾组织区段性蛋白印迹检测分析图；Clpsl2蛋白在附睾头部特异的表达，在附睾体、附睾尾及睾丸中无表达。
[0012]图3为Clpsl2蛋白在附睾组织切片中的免疫组化分析图；上图为Clpsl2在整个附睾中的表达分布，且对应的A-D分别表示，A附睾头近侧端；B，附睾头远侧端；C附睾体，D附睾尾，E为附睾头部近侧端(A)局部放大图，F为阴性血清对照，箭头标示Clpsl2阳性表达部位。
[0013]图4为Clpsl2蛋白在附睾管腔区段浓度梯度分布的间接免疫荧光分析图；上图是附睾示意图，A-H标示所拍摄的附睾组织的部位，A'、E'、G'和H'表示对应部位的阴性血清对照，Clpsl2用Cy3红色荧光标记，图中管腔中高亮信号为Clpsl2表达信号；而细胞核用DAPI染色，图中管壁细胞可见DAPI信号。
[0014]图5为Clpsl2蛋白与附睾管腔精子结合的间接免疫荧光分析图；Clpsl2用Cy3红色荧光标记，而细胞核用DAPI染色，可见Clpsl2在附睾头和附睾体的精子的头部顶体和尾部主段结合，附睾尾的精子与Clpsl2较附睾头/体部位弱且少。
[0015]图6为慢病毒介导的RNAi敲低小鼠附睾中Clpsl2表达的蛋白印迹检测图；Clpsl2的表达用抗Clpsl2的抗血清进行检测，GAPDH为内参对照。
[0016]图7为慢病毒介导的RNAi敲低小鼠附睾中Clpsl2表达后的与雌鼠合笼后的胚胎检测图；敲低Clpsl2表达后，7天后与雌鼠交配，合笼后14天观察胚胎变化，RNA1-N0.1靶标包装的慢病毒敲低Clpsl2表达后,胚胎数量减少,有多个不正常的胚胎；RNA1-N0.2革巴标包装的慢病毒敲低Clpsl2表达后胚胎数量没有明显差别，但胚胎发育迟缓。
【具体实施方式】[0017]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0018]本发明所选择的KM小鼠购买于广东省实验动物中心，许可证号SCXK (粤)2008-0002。
[0019]上述本发明采用的慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司包装。
[0020]实施例1:原位杂交检测Clpsl2mRNA在附睾组织中的表达定位
[0021]用ApaI将含有Clpsl2基因的pGEM-T-Clpsl2载体(关艺青，禹艳红，黄丹，潘善培.小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备[J].暨南大学学报(自然科学与医学版)，2010，31 (2): 105-110.)质粒线性化，酚氯仿纯化后用Roche的地高辛探针标记试剂盒，通过SP6RNA聚合酶标记反义探针，以T7RNA聚合酶标记正义探针作为对照，乙醇沉淀，DEPC水溶解。
[0022]取8周龄性成熟小鼠附睾，放入质量百分比4%多聚甲醛中，4°C固定2h，PBS洗3次，每次5min。然后加入质量百分比30%蔗糖溶液，4°C放置至组织块沉入底部。取出组织，加OCT包埋剂包埋，冰冻切片，切片厚度8 μ m，粘附于多聚L-赖氨酸处理过的载破片上。组织片经蛋白酶K及乙酸酐-三乙醇胺预处理后，预杂交2h后加入在沸水中煮2min，变性的探针杂交过夜，次日多次洗涤后，用体积百分比2%绵羊血清封闭30min，然后加入抗Dig抗体(美国Roche公司)处理2h后，NBT/BCIP溶液显色16h后在光学显微镜下拍照观察，结果如图1所示。结果发现Clpsl2mRNA主要在附睾头部上皮细胞表达，在附睾体和附睾尾无Clpsl2mRNA表达，在附睾的整个管腔也无Clpsl2mRNA表达。表明Clpsl2mRNA主要在附睾头部上皮细胞合成。[0023]实施例2:蛋白印迹检测Clpsl2在附睾组织各区段中的表达
[0024]取8周龄性成熟小鼠，断颈法迅速处死，立即分离附睾，剔除多余脂肪及结缔组织后在预冷的PBS中洗涤，然后将附睾按头、体、尾三部分分离。所取的各样品按照质量体积比1:10的比例加入终浓度为ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem,美国Merck Millipore公司)的Western及IP细胞裂解液(美津生物)，冰浴研磨。4°C 12，OOOrpm离心15min后取上清，用BAC蛋白定量试剂盒对各组织的总蛋白含量进行定量，然后进行按照浓缩胶浓度4%，分离胶浓度16%配制凝胶进行Tricine SDS-PAGE电泳。在无SDS的转膜缓冲液中300mA恒流中转膜35min后蛋白质转移到PVDF膜上，质量份数为5%脱脂奶粉溶液室温封闭60min后加入用抗体稀释液(Calbiochem，美国MerckMillipore公司)配置的体积百分比1:1000的兔源抗meClpsl多克隆抗血清(关艺青，禹艳红，黄丹，潘善培.小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备[J].暨南大学学报(自然科学与医学版)，2010，31 (2):105-110.)或者体积百分比1:2000鼠源GAPDH单克隆抗体(sigma)，4°C孵育过夜。次日，于室温复温60min。TBST洗膜3次，每次10_15min。用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (体积比1:2000,检测1116(:]81, sigma)或者辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM (体积比1:1000, sigma)孵育60min。TBST洗膜3次，每次10-15min。用ECL化学发光检测试剂盒(美国Thermo公司)检测发现,仅在附睾头部组织能够检测到Clpsl2的表达，而在附睾体部和尾部通过蛋白印迹基本上检测不到Clpsl2表达(图 2)。
[0025]实施例3:免疫组化检测Clpsl2蛋白在附睾中的表达定位
[0026]取附睾组织的冰冻切片，体积分数为3%过氧化氢孵育lOmin。于37°C湿盒内体积分数为10%山羊血清封闭2-3h后用质量份数为2%BSA配制的抗meClpsl多克隆抗血清(体积比1:500)4°C湿盒内孵育过夜。次日用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(体积比1:300)37°C湿盒内孵育lh。DAB显色，苏木素复染梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用倒置显微镜下观察发现在整个附睾头部的管壁细胞中都能检测到Clpsl2蛋白的表达，并且在头部近侧端(图3A，F)表达量明显高于远侧端(图3B)，附睾的近体部有少量Clps21蛋白的存在(图3C)，但附睾尾部基本不见Clpsl2蛋白的表达(图3D)。在附睾头部、体部的管腔中，可以发现部分精子簇也有Clpsl2蛋白的存在。
[0027]实施例4:间接免疫荧光检测Clpsl2蛋白在附睾管腔中的分布
[0028]将组织切片从_80°C冰箱取出；室温放置30-60min后，PBS洗3次，每次5min ;用2%BSA-PBS液室温封闭60min ;去除封闭液，滴加封闭液稀释的一抗(抗meClpsl的抗血清1:200)，于41:过夜;PBS洗3次，每次5min ;加入Cy3标记的羊抗兔IgG (1:100，武汉博士德)，室温孵育60min ;PBS洗3次，每次5min ;DAPI染核5min ;PBS洗3次，每次5min ;加入防突光淬灭剂，封片；于激光共聚焦扫描显微镜LSM700 (德国Zeiss公司)下镜检发现Clpsl2蛋白在管腔中的表达量随着精子在管腔中的转运逐渐降低，头部最高，尾部基本检测不到(图 4)。
[0029]实施例5:间接免疫荧光检测Clpsl2蛋白与精子的结合
[0030]取8周龄性成熟小鼠附睾，用预冷的PBS洗涤，将附睾分成头部、体部和尾部后放入盛有精子培养液(123mmol/L NaCl, 4mmol/L KCl, 2mmol/L CaCl2,0.4mmol/L MgSO4,25mmol/L NaHCO3,0.3mmol/L Na2HPO4, 5mmol/L葡萄糖，12.5mmol/L乳酸纳，0.5mmol/L丙丽酸钠，4mg/ml BSA ；pH7.4)，轻挤精子，于37°C、体积分数为5%C02培养箱中静置lOmin。小心吸出上层的精子，1，OOOrpm离心5min。弃去精子培养液,PBS洗3次,每次5min。加入预冷的质量分数为2%多聚甲醛固定液4°C中固定30min后制备精子涂片。然后采用组织切片间接免疫荧光相类似的方法及抗体稀释度进行间接免疫荧光检测。在激光共聚焦扫描显微镜LSM700 (德国Zeiss公司)下对与Clpsl2结合的单精子进行拍照，结果发现附睾头部和体部的精子都能够与Clpsl2结合，结合部位主要在精子头部顶体部位和尾部主段(图5)。精子头部顶体参与到精卵结合的顶体反应，尾部与精子运动相关。Clpsl2与精子的结合特性表明Clpsl2参与到了精子成熟调控。
[0031]实施例6:靶向干扰Clpsl2的慢病毒载体构建及病毒包装
[0032]针对小鼠Clpsl2的核苷酸序列，设计了两个RNAi靶位点(RNA1-Nol:ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT 和 RNAi_No2:GGGAGCCTGAACATCATGTGT)，合成互补的 siRNA 正义链和反义链，将退火后的寡核苷酸与pGLV-Hl-GFP+Pim)载体(上海吉玛制药有限公司)连接构建慢病毒RNAi表达载体，然后与包装质粒PG - P1-VSVG, PG-P2-REV和PG-P3-RRE共同转染HEK293FT细胞后制备并浓缩靶向干扰Clpsl2表达的慢病毒，病毒滴度均为5X 108TU/ml。
[0033]小鼠Clpsl2的核苷酸序列如下:
[0034]ATGGCATTCACTCAGGCCTTGGTCACCGTCCTGGCTTTGCTTGCTGGGACCCTGCCACACAGACACAGTGAAAACTCACCTCCCAAAAAGGCCAACGGAGACAAGTGTGTCCACCACACTCAGTGCTCCAGTGACTGTTGCCTCATAGACCTGGAGAGAAGCGGAGCCTTCTGCACCCCCAAGTCCCGCATAGGCATGGGGTGCTTGCCACAGACCAAGGGGAGCCTGAACATCATGTGTCCCTGTCGATCTGGCTTGAATTGTCATTCTAAGGACCCCACATGTCCCCGCCGATGTCAAATGATATAG
[0035]实施例7:小鼠附睾内RNAi敲低Clpsl2表达的小鼠模型建立
[0036]实验分为3组，分别为实验组(RNA1-Nol、实验组RNA1-No2和对照组RNA1-GFP。每组3只雄鼠,双侧注射相应病毒。病毒注射量为ΙΟμΙ。
[0037]选用5周龄的雄性小鼠，按照每公斤体重注射63mg的量腹腔注射质量体积比为
1.4%的戊巴比妥钠进行麻醉。待小鼠麻醉后(l_3min)，将其腹部的毛剪掉，并用酒精棉消毒。用眼科剪于腹部偏下剪开表层皮肤，找出睾丸，暴露出附睾头部，用改造的镊子固定住附睾头部，将改造后的注射器的针头插入到头部，缓慢将病毒液注射到附睾头部。分别缝合肌肉层和皮肤层，并用安而碘消毒。病毒注射7天后通过蛋白印迹检测慢病毒介导的RNA干扰片敲低Clpsl2的表达效果(图6)。结果表明两个实验组都能够降低Clpsl2的蛋白表达，但以RNA1-Nol对Clpsl2的干扰效果最明显。
[0038]实施例8:敲低Clpsl2表达后对小鼠精子成熟的影响
[0039]病毒注射7天后将雄鼠与雌鼠合笼，观察雌鼠阴栓。合笼成功后分离雄鼠附睾，取附睾头部和部分体部组织进行蛋白印迹检测，附睾尾部分离精子观察精子的形态变化、检测精子运动性能和统计精子数量；合笼后14d，检测孕雌鼠胚胎数。分离附睾尾部的精子于Iml精子培养液中，370C，体积分数为5%C02孵育lOmin，分别取10 μ I实验组RNA1-Nol、实验组RNA1-No2和对照组RNA1-GFP的精子，将其稀释100倍，进行精子计数。实验组RNA1-Nol精子数为0.87 X IO7个/ ml ;实验组RNAi_No2精子数为1.0X IO7个/ml ;对照组RNA1-GFP的精子数1.6X IO7个/ml。表明经Clpsl的干扰片段RNA1-Nol敲低Clpsl2后小鼠精子数量减少。
[0040]分别取实验组RNA1-No1、实验组RNAi_No2和对照组RNA1-GFP的精子液10 μ I涂于载玻片上(37°C预热)，在光学显微镜观察发现，与对照组RNA1-GFP组相比，实验组RNA1-Nol组和RNA1-No2组的精子前向性运动明显减弱，多数精子处在尾部摆动状态，且实验中RNA1-Nol组的精子尾部摆动稍微弱一些，且大部分精子头部处于静息状态。表明经Clpsl的干扰片段RNA1-Nol敲低Clpsl2表达后精子的运动性能减弱。
[0041]雌鼠交配成功后，待受精卵发育为中期胚胎时，将雌鼠脱白处死，观察胚胎有无异形并进行计数。敲低Clps2表达后，实验组RNA1-Nol和实验组RNAi_No2组均出现不正常胚胎，而对照组RNA1-GFP胚胎均正常(图7)。且实验组RNA1-Nol出现不正常胚胎的数量及畸形度明显高于实验组RNA1-No2.。表明经Clpsl的干扰片段RNA1-Nol敲低Clpsl2表达后精子的活性有了明显的降低。
[0042]从以上结果可以发现Clpsl2在精子成熟中发挥重要的作用。Clpsl2特异结合精子顶体部位和尾部主段，参与了顶体结构功能完善和精子运动性能的获得。Clpsl2表达不正常可能会出现弱精症，同时也影响精子活动影响，会导致雄性的不育症。因此一方面可以针对Clpsl2参与精子成熟调控的特点，可用于制备诊断和治疗雄性不育症的药物，同时也可制备用于调控雄性生育能力用的药物；同时经Clpsl的干扰片段RNA1-Nol靶向敲低Clpsl2表达后孕鼠胚胎发育不正常，数量减少，运动性能减弱，针对这个发现可用于开发雄性小鼠的节育药。
[0043]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种类辅脂酶2基因的干扰片段，其特征在于核苷酸序列为:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。
2.权利要求1所述的类辅脂酶2基因的干扰片段在雄性小鼠避孕药制备及在小鼠精子成熟的药物制备中 应用。
【文档编号】C12N15/113GK103451186SQ201310382879
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】禹艳红, 陈雷, 曹佐武, 蔡冬青, 廉滋珍, 秦俊文, 齐绪峰, 武征 申请人:暨南大学