一种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法
【专利摘要】本发明建立了一种从复杂的核酸文库中快速获得具有某种特性分子的方法。首先通过乳浊液核酸扩增技术，将文库的单个分子分别扩增到单个微珠A上，使得每个微珠A上只有一种特定序列的核酸分子。再在另一种不同性质的微珠B(如磁珠)上偶联靶标分子，将两种微珠混合在一起使其结合，然后洗去未结合的微珠A，分离带有靶分子的微珠B，此时与靶分子结合的微珠A会一并得以分离，与微珠B上的靶分子特异性结合的每个微珠A上的核酸分子即为所需的单一序列核酸分子。此方法快捷方便，无需经过克隆和测序即可得到高亲和力的单一核酸分子。该技术可以广泛用于启动子的筛选和核酸适配体的筛选与鉴定中。
【专利说明】—种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定分离方法，特别是从一个混合的核酸分子库中快速鉴定和分离出具有某种特性分子的方法。
【背景技术】
[0002]核酸分子包括DNA和RNA，在生命体中扮演着极为重要的角色。其中一部分核酸分子能够与其它分子相互作用，通过这种相互作用来传递信息并发挥特定的功能。这种能够与其它分子相互作用的核酸分子不仅在生命体中普遍存在，还可以通过体外筛选的方法，从而获得具有特定功能的核酸分子。这种体外筛选技术被称作SELEX(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术，于 1990 年由美国的三个实验室独立发明。
[0003]不管是寻找生物体内具有特定功能的核酸分子，或是体外通过SELEX技术获得具有特定功能的核酸分子，都是一项极其复杂、耗时费力的工作。常规的方法是先合成随机的文库分子，将靶分子与文库分子在一定条件下混合，通过某种分离方法将未与靶分子结合的部分洗掉，留下与靶分子结合的分子。由于分离技术的效率、污染、非特异结合、PCR的非特异扩增等原因，这种步骤往往需要重复很多轮才能得到与靶分子结合的富集文库分子。这些文库依然是一个多分子的复杂混合物。从富集的文库中鉴定出高亲和力的单个序列是整个过程的限速步骤。目前主要有以下几种方法:一是将富集后的文库序列构建克隆，转化大肠杆菌，然后挑取单个菌落，提取核酸并测序；通常要测试多个序列，然后比较分析得出可能性高的序列信息，进行化学合成，然后再进行亲和力验证。这是最普遍采用的方法。近年来由于高通量测序技术的进步，兴起的另一种方法是将文库分子全部进行测序，然后比较不同序列的丰度，通过生物信息学方法进行分析，得出优选的序列，再进行合成和验证。这种方法，成本高昂，而且需要高通量的测序仪器，只有少数实验室能够采用这种方法；这种方法虽然无需经过克隆，但只能获得序列信息，仍需要通过合成和亲和力验证，才能得到特定的分子。而且，由于不均等扩增，不同序列扩增效率不同等原因，导致高丰度的序列未必是高亲和力的序列。所以，以上现有方法都无法快速直接获得高亲和力的单一序列核酸分子。
[0004]本发明建立了一种快速鉴定和分离特定核酸分子的方法，可以在不经过测序的条件下，直接获得具有高亲和力的单一序列核酸分子。
【发明内容】
[0005]本发明首先将经过富集的核酸分子库，利用乳浊液核酸扩增(PCR)技术将复杂核酸分子库中的单个核酸分子在一种微珠A表面实现放大扩增，确保每个微珠A上只有一种序列；然后将获得的微珠A与偶联有靶分子的另一种微珠B混合，经过充分的混匀与结合后，将未结合的微珠A洗去,最后收集微珠B,部分含有特殊序列分子的微珠A,由于与微珠B表面偶联的靶分子结合，而被保留下来，这些微珠A上的特定核酸分子即为所需的单一序列分子。
[0006]上面中所述分离方法可以是磁力分离、重力分离或浮力分离中的一种；
[0007]上面中所述微珠A如果不是磁性微珠，B可以是磁性微珠，并利用磁性来分离微珠B ；
[0008]上面中所述微珠A如果密度小于水，B则可以使用密度大于水的微珠；反之亦然；
[0009]如果需要鉴定双链DNA分子与靶分子的结合，则PCR扩增完后无需解离双链；如果需要鉴定单链的DNA分子与靶标结合，则需要将微珠A上的扩增产物解离成单链分子，解离方法可以通过加热解离，也可以通过碱解离；
[0010]如果需要鉴定RNA分子与靶标的结合情况，首先要将RNA反转录成DNA分子，通过乳浊液PCR将DNA分子分散成单克隆，扩增到微珠A上；然后用液滴包裹微珠A并在液滴中完成RNA分子的转录过程；由于微珠A上偶联有与RNA配对的引物，通过加热变性可以将RNA通过与引物的杂交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再将微珠A与偶联有靶分子的微珠B进行孵育结合；按照选自磁力分离、重力分离或浮力分离的方法分离复合微珠A-B，所得A微珠上的RNA即为与靶分子结合的单克隆RNA分子。
[0011]本发明的方法既是一种快速鉴定技术，也是一种快速筛选技术。将一定库容的随机文库分子扩增到微珠上，解离成单链，用靶标分子结合，分离出与靶标分子结合的微珠，即相当于从原始的文库中筛选出所需的分子。
[0012]本发明中微珠的挑取方法，可以采用显微操作法，也可以利用分选流式进行筛选。如果靶分子是细胞表面的膜蛋白，微珠B可以直接用细胞代替。
[0013]综上所述，本发明提供下述各项实施方案:
[0014]1.一种快速鉴定和分离核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤:
[0015](I)将待鉴定和分离的核酸分子的特异性引物之一偶联到微珠A上，然后通过乳浊液PCR的方法，将文库分子分散成单模板并且扩增到微珠A上；
[0016](2)将扩增有单模板的微珠A与另一种偶联有祀分子的微珠B混合,并移除未与微珠B结合的微珠A，回收微珠B，得到与微珠B上的靶分子特异性结合的微珠A，与微珠B上的靶分子特异性结合的每个微珠A上即结合有待鉴定和分离的单克隆的核酸分子。
[0017]2.第I项所述的方法， 其中步骤(1)中引物与微珠A表面的偶联为共价偶联或非共价偶联。
[0018]3.第I项所述的方法，其中步骤(1)中的引物预先用氨基修饰或用生物素修饰。
[0019]4.第I项所述的方法，其中步骤(2)中分离微珠A和A-B复合微珠的方法是磁力分离、重力分离或浮力分离中的任一种。
[0020]5.第I项所述的方法，其中微珠A为非磁性微珠，微珠B为磁性微珠，并利用磁力来分离微珠A与A-B复合物。
[0021]6.第I项所述的方法，其中微珠A的密度小于水，微珠B的密度大于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍大于水，利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，离心沉淀物中即包含A-B复合物。
[0022]7.第I项所述的方法，其中微珠A的密度大于水，微珠B的密度小于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍小于水，并利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，上清表面即包含A-B复合物。[0023]8.第I项所述的方法，其中鉴定双链DNA分子与靶分子的结合时，PCR扩增完后无需解离双链；当鉴定单链DNA分子与靶分子结合时，需要将微珠A上的扩增产物解离成单链DNA分子。
[0024]9.第I项所述的方法，当鉴定RNA分子与靶分子的结合情况时，所述方法包括下述步骤:
[0025](1)在微珠A上偶联用于扩增DNA模板的引物序列和用于捕获RNA分子的配对序列，其中用于捕获RNA分子的配对序列末端进行封闭修饰，使其无法用于延伸扩增；
[0026](2)将RNA分子反转录成DNA分子，通过乳浊液PCR将所述DNA分子分散成单克隆，扩增到步骤(1)得到的微珠A上；
[0027](3)用液滴包裹步骤(2)得到的微珠A并在液滴中完成RNA分子的转录过程；由于所述微珠A上偶联有用于捕获RNA分子的配对序列，通过加热变性可以将RNA通过与配对序列的杂交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再将微珠A与偶联有靶分子的微珠B进行孵育结合；分离复合微珠A-B，即可获得与靶分子结合的单克隆RNA分子。
[0028]10.第I一9项中任一项所述的方法，所述方法还包括对分离的单克隆分子进行测序的步骤。
[0029]本发明的方法将分子间结合转变成了两个珠子之间的结合，从而将不可直接操作的分子变成可以直接操作的微珠。因此，与现有鉴定技术相比，本发明的方法具有多方面的优势:
[0030]1.相比于现有技术，无需经过测序等步骤，可以快速获得高亲和力的单一序列核酸分子；
[0031]2.本发明的方法既可以作为单克隆鉴定的方法，也是一种筛选方法；直接可以获得高亲和力的单克隆，无需合成多种序列后再进行测定和筛选；
[0032]3.本发明避免了气溶胶污染等导致的假阳性；
[0033]4.本发明无需对靶分子或核酸分子进行荧光标记，避免了修饰可能带来的各种问题；
[0034]5.本发明可以满足应对突发事件时，快速开发试剂盒的需求。在应急监测技术开发、启动子研究、核酸适配体筛选等方面具有重要而且广泛的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0036]图1为两种微珠结合后的显微图片，可以明显看到部分聚苯乙烯微珠A(尺寸较大)与磁珠B (尺寸较小)结合在一起。
【具体实施方式】
[0037]下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
[0038]本发明的技术解决方案可以通过以下步骤来完成:
[0039]1.微珠表面引物的偶联:可以通过共价方法偶联，或是通过非共价的方法将引物偶联到微珠上；[0040]2.文库分子的乳浊液PCR扩增以及微珠收集；
[0041]3.微珠的表面核酸分子的处理:如果筛选的是双链核酸分子，则扩增后的产物无需解离成单链，如果筛选的是单链核酸适配体，则需要对PCR产物解离为单链；
[0042]4.与靶标微珠的孵育和结合；复合微珠的富集；
[0043]5.挑取微珠，扩增放大，制备特定分子，验证测试。
[0044]实施例1:单链DNA核酸适配体的快速鉴定
[0045]本实施例是优选实施例，具体如下:
[0046]1.微珠表面引物的偶联；可以通过共价方法偶联，或是通过非共价的方法将引物偶联到微珠上；
[0047]取50uL带有羧基的聚苯乙烯(PS)微珠(作为微珠A)，用0.01M NaOH溶液清洗两遍(具体方法为:将样品于8000rpm离心12min,弃掉上清,加入0.01M NaOH溶液,混匀后静置5min，再次离心)，再用去离子水清洗3遍，弃掉上清；将氨基修饰的引物用去离子水溶解，终浓度IOOuM,取出20uL，加入装有聚苯乙烯微珠的离心管里，对照组加入等量的去离子水；向管内加入50uL MES缓冲液(0.4M MES, pH5.0);摇床300转/分钟，摇晃混匀30min ；向管内加入30uL含有3mg EDC的MES缓冲液；摇床混匀5h ;用TE缓冲液清洗4次，重悬在IOOuL的IXTE中，4°C保存备用。
[0048]引物在微珠表面的偶联也可以通过生物素-链霉亲和素(biotin-SA)相互作用来完成。在这种情形中，微珠A使用偶联有链霉亲和素(SA)分子的微珠(即SA-微珠)，引物用双生物素修饰的引物；取约10E9个SA-微珠，悬浮于IOOmM磷酸盐，2M NaCl,pH8.0的缓冲液中，加入2ull00uM的双生物素修饰的引物，振荡孵育30min，洗去未结合的上清即可；将微珠重悬在IOOuL的IXTE中，4°C保存备用。
[0049]2.文库分子的乳浊液PCR扩增；
[0050]该步骤中所需的样品及试剂包括:经过富集的文库，乳浊液PCR需要的油相，PCR扩增试剂，以及上述偶联有引物的微珠；试剂具体配方如下:
[0051]不对称PCR mix,配方如下表
【权利要求】
1.一种快速鉴定和分离核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤: (1)将待鉴定和分离的核酸分子的特异性引物之一偶联到微珠A上，然后通过乳浊液PCR的方法，将文库分子分散成单模板并且扩增到微珠A上； (2)将扩增有单模板的微珠A与另一种偶联有祀分子的微珠B混合,并移除未与微珠B结合的微珠A，回收微珠B，得到与微珠B上的靶分子特异性结合的微珠A，与微珠B上的靶分子特异性结合的每 个微珠A上即结合有待鉴定和分离的单克隆的核酸分子。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中引物与微珠A表面的偶联为共价偶联或非共价偶联。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的引物预先用氨基修饰或用生物素修饰。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中分离微珠A和A-B复合微珠的方法是磁力分离、重力分离或浮力分离中的任一种。
5.权利要求1所述的方法，其中微珠A为非磁性微珠,微珠B为磁性微珠,并利用磁力来分离微珠A与A-B复合物。
6.权利要求1所述的方法，其中微珠A的密度小于水，微珠B的密度大于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍大于水，利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，离心沉淀物中即包含A-B复合物。
7.权利要求1所述的方法，其中微珠A的密度大于水，微珠B的密度小于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍小于水，并利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，上清表面即包含A-B复合物。
8.权利要求1所述的方法，其中鉴定双链DNA分子与靶分子的结合时，PCR扩增完后无需解离双链；当鉴定单链DNA分子与靶分子结合时，需要将微珠A上的扩增产物解离成单链DNA分子。
9.权利要求1所述的方法，当鉴定RNA分子与靶分子的结合情况时，所述方法包括下述步骤: (1)在微珠A上偶联用于扩增DNA模板的引物序列和用于捕获RNA分子的配对序列，其中用于捕获RNA分子的配对序列末端进行封闭修饰，使其无法用于延伸扩增； (2)将RNA分子反转录成DNA分子，通过乳浊液PCR将所述DNA分子分散成单克隆，扩增到步骤(1)得到的微珠A上； (3)用液滴包裹步骤(2)得到的微珠A并在液滴中完成RNA分子的转录过程；由于所述微珠A上偶联有用于捕获RNA分子的配对序列，通过加热变性可以将RNA通过与配对序列的杂交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再将微珠A与偶联有靶分子的微珠B进行孵育结合；分离复合微珠A-B，即可获得与靶分子结合的单克隆RNA分子。
10.权利要求1一9中任一项所述的方法，所述方法还包括对分离的单克隆分子进行测序的步骤。
【文档编号】C12N15/10GK103540672SQ201310521776
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】罗昭锋, 罗炎, 欧惠超, 周宏敏, 张海燕 申请人:中国科学技术大学