一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用。磷酸转移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。以具有磷酸转移酶活性的菌为筛选库，设计引物，然后采用限制性内切酶EcoRI随机切基因组以筛选获得具有磷酸转移酶活性的磷酸转移酶基因PhoC(I)。本发明的磷酸转移酶基因PhoC(I)较PCR扩增到的磷酸转移酶基因序列(PhoC?II)多了一段基因序列。利用该基因PhoC(I)制备的重组菌的酶活比采用PCR扩增所得基因PhoC(II)的重组菌酶活大大提升。所得重组菌以整细胞高效催化肌苷、鸟苷合成呈味核苷酸二钠（I+G）。不仅底物转化率高、专一性强，后续提取工艺也简单方便，可以用于产业化生产。
【专利说明】一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说，涉及磷酸转移酶基因的筛选、克隆表达及应用。
【背景技术】
[0002]
【权利要求】
1.磷酸转移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.权利要求1所述的磷酸转移酶基因PhoC(I)的制备方法，其特征在于包括如下步骤:以具有磷酸转移酶活性的菌为筛选库，设计引物:
PhoC-upper:5’-CTGCGAATTCTTTGCGCTGGTTCCCGCCGGCAATGA-3’
phoC-lower:5’ -GGGM￡￡IICTAATTTCGCTGTTTCGCAAACTCGTC-3’ ； 然后采用限制性内切酶EcoRI随机切基因组以筛选获得具有磷酸转移酶活性的磷酸转移酶基因PhoC(I)。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有磷酸转移酶活性的菌为产气肠杆菌、蟑螂埃希氏菌或摩氏摩根菌。
4.含有权利要求1所述磷酸转移酶基因PhoC(I)的磷酸转移酶重组菌，其特征在于由如下步骤制备而成:将磷酸转移酶基因PhoC(I)分别以pUC19，pBluscript II SK(+)或PET28为表达载体，在BL21 (DE3)、ToplO或JM109宿主中进行表达。
5.权利要求4所述磷酸转移酶重组菌的表达方法，其特征在于:发酵的培养基每1000mL 包含以下成分:NaC125g，NaH2PO4.2H208g, MgSO4.7H205g, (NH4)2S048g,酵母抽提物15g，蛋白胨20g，葡萄糖35g ;发酵至OD为3-10时，需要添加0.2-0.5mM的诱导剂IPTG或质量浓度为0.2-0.5%的乳糖，诱导开始后葡萄糖的浓度控制在0.5-1.8% ;发酵温度在20-37°C，诱导温度在15-34°C之间。
6.利用权利要求4所述磷酸转移酶重组菌催化肌苷、鸟苷合成肌苷酸和鸟苷酸的方法，其特征在于，温度为20-35°C，pH值为3.5-6.0。
【文档编号】C12N15/10GK103642823SQ201310574198
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】蔡友华, 严杰能, 郑彩珠, 李红, 徐珍珍 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司