食用植物油中转基因成分nos的恒温检测方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测食用植物油中NOS终止子的方法和试剂盒。该方法可稳定从植物油中提取核酸成分，并采用LAMP恒温扩增的方法在短时间内实现对转基因成分的检测，所述方法包括如下步骤：1）提取待检植物油样品的基因组DNA；2）待检样品DNA在BstDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在NOS终止子成分。本方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等特点，能快速检测植物油中的转基因成分NOS终止子。
【专利说明】食用植物油中转基因成分NOS的恒温检测方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分子检测【技术领域】，具体涉及一种快速检测食用植物油中NOS终止子的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]自20世纪70年代转基因生物和转基因产品被开发以来，转基因产品发展迅猛。转基因作物的种植面积得到了前所未有的增长，从1996年的170万公顷到2012年的1.7亿公顷，增加了 100倍。种植转基因作物的国家也达到了 28个，其中20个为发展中国家，8个为发达国家。到目前为止，已经有25种转基因作物被商业化种植，其中最广泛的是作为食用油加工原料的大豆、玉米、油菜。由于这些转基因油料作物出油率高、制油成本低，各发展中国家纷纷进口转基因大豆和油菜作为制油原料。但由于目前尚缺乏科学依据证明转基因食品的安全性，因而对转基因食品检测技术的需求也越来越紧迫。近年来，中国进口的制油原料中，有相当数量的转基因产品，尤其是转基因大豆，中国进口的大豆几乎100%为转基因大豆。由于世界上已经有很多国家规定了转基因食品是必须加贴标签或禁止进口，因此，对食用油脂进行转基因成分的检测，显得尤为重要。如何鉴别食用油脂是否为转基因食品，除了检测原料以外，更多的是需要从成品食用油中直接进行检测。转基因作物所转入的外源基因多种多样，为了成功表达这些外源基因，均需要插入如启动子、终止子等外源调控序列。NOS终止子作为最常使用的调控序列之一，被广泛用于转基因植株的构建，是转基因检测的最佳靶基因之一。
[0003]转基因成分的检测一直是食品卫生与食品安全检测的重点内容，尤其是转基因成分的快速检测已成为一个重要的研究方向。目前检测的外源基因包括35S启动子、NOS终止子和功能基因。检测方法主要有两类:一是建立在蛋白质水平上的Western印记、SDS-PAGE、ELISA等方法；二是基于核酸扩增的PCR方法(包括多重PCR、竞争PCR、实时荧光PCR等)。特别是实时荧光PCR检测方法，一直作为转基因成分检测的标准方法在使用。虽然其检测灵敏度较高，但需要昂贵的荧光定量PCR仪，检测成本也极高。因此，建立一种普适性好、简便易操作、低成本的快速检测方法对于实际检测工作意义极为重要。从食用油脂中提取出可用于核酸检测的DNA，是进行检验的关键。但是食用油的DNA提取仍是国内外的难题之一。由于食用油生产加工过程中经过高温和高压等处理过程，产品中的DNA遭到严重破坏，降解为长度较短，大小不一的片段，而且受到物理、化学和生物等因素的影响，DNA的质量也大大降低。目前，国内外仍没有一个比较稳定的食用油DNA提取方法或试剂盒。
[0004]环介导恒温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification, LAMP)是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一项新的DNA扩增技术，具有常规PCR技术无法具备的简单、快速、灵敏、特异性强的特点。该技术利用具有链置换活性Bst {Bacillusstearo thermophilus) DNA聚合酶和根据祀序列设计的两对特异性内引物及外引物，特异识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，同时还可引入环引物以缩短反应时间。该技术克服了传统PCR反应需要通过反复的热循环扩增的缺点，避免了反复升降温的耗时过程，可实现恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度(低于10个拷贝)和扩增效率。同时，由于两对引物针对靶基因的6个区域，这使LAMP也具有极高的扩增特异性。[0005]本研究建立了一种可从食用油中稳定提取核酸的方法，同时建立一种恒温检测NOS终止子的方法。该方法具有快速简便、操作简单、检测耗时少、灵敏度、数据准确可靠以及结果易判定的优点。目前尚未有采用LAMP技术对食用油转基因成分进行检测研究的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种用于稳定、快速提取植物油中基因组DNA的方法。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种用于快速提取植物油中基因组DNA的试剂盒。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种快速检测植物油中NOS终止子的方法。
[0009]本发明的另一个目的在于提供一种用于快速检测植物油中NOS终止子的LAMP试剂盒。
[0010]本发明的另一个目的在于提供一种用于快速检测植物油中NOS终止子的LAMP引物组。
[0011]本发明所采取的技术方案是:
一种提取植物油基因组DNA的方法，包括如下步骤:
1)取一定样品油，加入I~3倍体积的正己烷和0.1~0.3倍体积的TE，20~25°C环境条件下，混合均匀；
2)静置分层后，去除上层油相；
3)将下层的TE水相转移到离心管；依次加入I~2Pg鲑鱼精DNA，0.5~0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1~0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于一 20°C以下沉淀DNA ；
4)沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65~75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离
心；
5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
[0012]一种用于提取植物油基因组DNA的试剂盒，包括以下试剂:正己烷、TE试剂、鲑鱼精DNA、异丙醇、乙酸钠和乙醇。
[0013]一种快速检测植物油中NOS终止子的方法，包括如下步骤:
1)根据NOS终止子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；
2)提取待检植物油样品的基因组DNA；
3)待检样品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；
4)根据扩增结果判断待检样品中是否存在NOS终止子成分。
[0014]所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
NOS- F3:CTCGTTCAAACATTTGGCA (SEQ ID NO:1),
NOS- B3:GCGCTATATTTTGTTTTCTATCG (SEQ ID NO:2)，
NOS-FIP:ACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTG (SEQ ID NO:3)
NOS-BIP:TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGA (SEQ ID NO:4)。[0015]步骤2)采取权利要求1的方法提取待检植物油样品的基因组DNA。
[0016]步骤3)所述恒温扩增反应的体系为:25 μ L LAMP反应体系含有1.6 μ mol/LNOS-FIPU.6 μ mol/L NOS-BIP,0.2 μ mol/L N0S_F3、0.2 μ mol/L N0S_B3、1 mol/L 甜菜喊、8 mmol/L MgSO4>8 U Bst DNA 聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μ L 10 X Thermo polBuffer及DNA模板2 μ L ;恒温扩增反应的程序为:60~65 °C恒温反应45~60min。
[0017]步骤4)可根据浊度法或染色法判断检测结果，其中，实时浊度法:利用实时浊度仪进行检测，根据浊度曲线判断结果，有扩增峰出现为阳性，无扩增峰出现为阴性；染色法:往反应液中加入荧光染料SYBR Green I，如果颜色变绿则为阳性，即待检样品中含有NOS终止子，如果颜色为橙色则为阴性。
[0018]一种用于快速检测植物油中NOS终止子的LAMP试剂盒，其包括4条根据NOS终止子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
【权利要求】
1.一种提取植物油基因组DNA的方法，包括如下步骤: 1)取一定样品油，加入I~3倍体积的正己烷和0.1~0.3倍体积的TE，20~25°C环境条件下，混合均匀； 2)静置分层后，去除上层油相； 3)将下层的TE水相转移到离心管；依次加入I~2Pg鲑鱼精DNA，0.5~0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1~0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于_20°C以下沉淀DNA ； 4)沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65~75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离心； 5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
2.一种用于提取植物油基因组DNA的试剂盒，包括以下试剂:正己烷、TE试剂、鲑鱼精DNA、异丙醇、乙酸钠和乙醇。
3.一种快速检测植物油中NOS终止子的方法，包括如下步骤: 1)根据NOS终止子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物； 2)提取待检植物油样品的基因组DNA； 3)待检样品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应； 4)根据扩增结果判断待检样品中是否存在NOS终止子成分。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
NOS- F3:CTCGTTCAAACATTTGGCA (SEQ ID NO:1),
NOS- B3:GCGCTATATTTTGTTTTCTATCG (SEQ ID NO:2)，
NOS-FIP:ACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTG (SEQ ID NO:3)
NOS-BIP:TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGA (SEQ ID N0:4)。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)采取权利要求1的方法提取待检植物油样品的基因组DNA。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)所述恒温扩增反应的体系为:25 μ L LAMP 反应体系含有 1.6 μ mol/L NOS-FIPU.6 μ mol/L N0S_BIP、0.2 μ mol/LN0S-F3、0.2 μ mol/L N0S_B3、1 mol/L 甜菜碱、8 mmol/L MgSO4,8 U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol/L dNTP、2.5 μ L 10 X Thermo pol Buffer 及 DNA 模板 2 μ L ;恒温扩增反应的程序为:60~65 °C恒温反应45~60 min。
7.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)可根据浊度法或染色法判断检测结果，其中，实时浊度法:利用实时浊度仪进行检测，根据浊度曲线判断结果，有扩增峰出现为阳性，无扩增峰出现为阴性；染色法:往反应液中加入荧光染料SYBR GreenI，如果颜色变绿则为阳性，即待检样品中含有NOS终止子，如果颜色为橙色则为阴性。
8.一种用于快速检测植物油中NOS终止子的LAMP试剂盒，其包括4条根据NOS终止子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
NOS- F3:CTCGTTCAAACATTTGGCA (SEQ ID NO:1),
NOS- B3:GCGCTATATTTTGTTTTCTATCG (SEQ ID NO:2)，
NOS-FIP:ACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTG (SEQ ID NO:3)NOS-BIP:
TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGA (SEQ ID NO:4)。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括以下组分:1feiDNA 聚合酶、MgS04、甜菜碱、dNTP、10XThermo pol Buffer、SYBR Green 1、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有NOS终止子基因序列的重组质粒，所述阴性对照品为ddH20。
10.一种用于快速检测植物油中NOS终止子的LAMP引物组，其序列分别如下所示:
【文档编号】C12Q1/68GK103642796SQ201310603898
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】谭贵良, 李向丽, 刘垚, 袁秀金, 陈亚波 申请人:谭贵良