一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株耐苦参碱根瘤菌株，并公开了其在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用，此作用是通过将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂来实现的。本发明的有益效果为：本发明提供的抗污染根瘤菌剂具有以下优点：对环境友好；可有效增强菌剂抗污染效果；可保持较高活菌数；施用后可抑制土著根瘤菌结瘤，提高目标根瘤菌占瘤率；抑制土壤环境中的病原菌，减少农药使用量；降低菌剂生产过程中对无菌环境的要求，降低制备成本；方法简便，易于推广。
CGMCC No.9296
20140612
【专利说明】一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤 菌剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业菌剂领域，具体涉及一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备 的抗污染根瘤菌剂。
【背景技术】
[0002] 根瘤菌与豆科植物间的共生固氮对农业生产至关重要，农业上常通过为豆科植物 接种优良根瘤菌来促进作物生长和增加种子产量，这也是环境友好型农业发展的主要趋 势，并具有重大经济意义。据统计，植物施用菌肥后，产量可增幅10-30%不等，对新垦或低 产田的增产效果更高达71. 2-241%。根瘤菌剂的施用可有效避免因氮肥施用过多而导致的 硝酸盐淋溶作用，并有效避免化学氮肥生产过程中的高能量消耗，在植物养分供给及环境 保护中的作用不可小觑。
[0003] 然而，商用根瘤菌剂在实际施用过程中常面临着贮藏期短、污染率高、有效活菌数 低以及施用后竞争结瘤效果不理想等诸多现实问题。贮藏时间是衡量菌剂质量的主要指 标之一，而污染率则是菌剂贮藏期限的主要影响因素之一。Olsen等对北美根瘤菌剂市场 的调查发现，超过25%的产品中含有病原菌或其它抑制根瘤菌生长的微生物，而在阿根廷， Gomes等（1997)在对根瘤菌剂的调查中也得到了同样的结论，为获得更好的根瘤菌接种 效果，抗污染菌剂的制备势在必行。
[0004] 即使是贮藏效果良好的根瘤菌剂，在施用到实际的田间环境中后，也并不一定可 以成功的与豆科作物共生结瘤。新施用的优良根瘤菌不仅需要面对来自土壤的各种环境条 件胁迫，如高土壤含氮量、土壤理化性状的限制以及气候因素等，还需与固氮效率低下、与 当地自然环境适应良好的土著根瘤菌进行结瘤竞争。此外，很多土壤微生物与根瘤菌间呈 拮抗关系，这其中包括掠食性的无脊椎原生动物类、粘细菌、弧菌和噬菌体，以及其它一些 可以产生次生代谢物质或通过改变环境因素而对根瘤菌起抑制作用的微生物。所有这些不 利因素都将影响根瘤菌与宿主植株的共生结瘤效果。因此，菌种间的竞争相当重要，这就要 求目标菌株具有相对持久的竞争能力。为获得出色的结瘤效果，所接种根瘤菌必须在高效 固氮的同时，竞争结瘤能力超过土著根瘤菌及其它阻碍性的微生物，形成更多根瘤。
[0005] Jung和Sessitsch等研宄发现通过向微生物菌剂中添加抑菌剂类物质可以减少 菌剂污染率并增加目标菌株的竞争效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，通过筛选耐植物源抑菌剂一苦参 碱的高效固氮根瘤菌株，提供了含有一定浓度苦参碱抑菌剂的高竞争型抗污染根瘤菌剂， 可有效解决根瘤菌剂在贮藏期间的高污染率以及施用后的低占瘤率问题，同时，还可有效 降低根瘤菌剂的贮藏及运输成本。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株耐苦参碱根瘤菌株，所述耐苦 参碱根瘤菌株为草木庫剑菌（Ensfer meliloti)LH3436,保藏单位为中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研宄所，保藏编号为CGMCC No. 9296,保藏日为2014年6月12日。
[0008] 耐苦参碱根瘤菌株的筛选方法为： 将紫花苜蓿根瘤中分离的高效固氮根瘤菌点接于含有600mg/L浓度苦参碱抑菌剂的 平板中，观察其生长情况，并结合含苦参碱平板培养基对空气和土壤源杂菌的抑制效果，筛 选对苦参碱具有较好抗性的耐药菌株，进行传代试验后，选择耐药特性稳定的菌株用作生 产菌株。
[0009] 本发明的第二个目的是提供了上述的一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污 染率及提高占瘤率中的应用。
[0010] 进一步的，上述的应用，是将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌 液混合制备得到抗污染根瘤菌剂。
[0011] 本发明的第三个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌 株发酵培养后的菌液与苦参碱抑菌液混合制备得到的。
[0012] 本发明的第四个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌 株发酵培养后的菌液加入至苦参碱抑菌液后，再与过筛灭菌基质混合后制备得到的。
[0013] 进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，所述抗污染根瘤菌剂中，苦参碱抑菌剂的 终浓度为600mg/L。苦参碱购自宝鸡方晟生物开发有限公司。
[0014] 进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株，培养至对 数期，即00_?为0. 5-0. 8时的根瘤菌液0. 2 mL接入至通用YMA液体培养基中，并于28°C 下120r/min发酵培养，待活菌数达到KTcfu/ml时，再加入经0.22ym滤膜过滤灭菌后的 苦参碱抑菌剂，搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到600mg/L。
[0015] 进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，所述过筛灭菌基质为泥炭和蛭石的混合 物，使用粉碎机将基质原料粉碎，过〇. 15_筛，泥炭使用前以磨细的CaC03将其pH值调至 7. 0,蛭石以HC1调节pH值至7. 0,再将泥炭、蛭石混合物基质置于烘箱中100°C烘干，之后 以聚丙烯袋双层密封后，121°C下高温灭菌3h，取出冷却并放置2-3d后，待基质内耐热芽孢 杆菌停止休眠时，重复进行灭菌，连续3次，将彻底灭菌的基质置于无菌条件下保存备用， 用量均为5g/袋。
[0016] 抗污染根瘤菌剂需置于4°C下冷藏保存。
[0017] 本发明的有益效果为： 1、 环境友好型抑菌剂： 将植物源类活性抑菌物质苦参碱添加到根瘤菌剂中，具有对病原菌及其它微生物较强 的特异性作用，不易引起抗药性，易降解，对人畜低毒，不污染环境等优点，可有效避免各种 化学类抑菌剂残留期长、不易降解的缺点，以及部分抗生素类药物所导致的微生物形态和 毒性变化以及基因突变能力的改变等问题； 2、 可有效增强菌剂抗污染效果： 在菌剂中添加对空气和土壤源杂菌具有广谱抑制效果的苦参碱抑菌剂，使得实际贮藏 过程中入侵的少量杂菌由于抑菌剂的存在而无法存活或难以大量繁殖，实际降低了菌剂的 污染几率。所制备的含抑菌剂的固体菌剂在贮藏150d后，其杂菌数为0. 20X 109 cfu/g，与 普通菌剂的杂菌数2. 65X 109 cfu/g相比，杂菌数降低了 13. 25倍，可有效抗污染； 根据各含苦参碱平板中培养136h时的数据显示，600mg/L的苦参碱抑菌剂可有效抑 制98. 97%的空气源杂菌及98. 69%的土壤源杂菌。将所制备的含苦参碱液体菌剂在进入 对数期时进行暴露空气和添加土壤溶液处理后，继续培养l-2d后观察其污染率，发现与对 照菌剂比，暴露空气处理的杂菌率由对照的30. 62%降至添加抑菌剂处理的17. 71% ;而添加 土壤溶液处理的杂菌率由对照的52. 84%降至添加抑菌剂处理的26. 93%。将含苦参碱液体 菌剂加入泥炭后制备固体菌剂，于室温下通风处贮藏，贮藏150d时，污染率降低至对照的 7. 16% ； 3、 可保持较高活菌数： 贮藏150d的固体菌剂活菌数为0.81 X109 cfu/g，为普通菌剂活菌数（0.76 X 109 cfu/ g)的 106. 58% ; 4、 施用后可抑制土著根瘤菌，提高目标根瘤菌占瘤率： 直接将含有相应浓度抑菌剂的YMA液体培养基接入耐苦参碱根瘤菌发酵至对数期后， 接种于寄主植株，由于耐药菌株在发酵过程中消耗了部分抑菌剂毒性，使得实际施用的抑 菌剂浓度低于最初的添加浓度，但仍可显著抑制环境中土著菌的活性，为目标根瘤菌的浸 染结瘤创造有利环境，进而增加目标根瘤菌的竞争结瘤效果。接种了添加液体抑菌剂植株 的占瘤率为79%，接种对照(普通菌剂）占瘤率为71%，占瘤率高于普通菌剂11. 3% ; 5、 抑制土壤环境中的病原菌，减少农药使用量： 苦参碱主要以其所含的生物碱类物质，通过毒杀、忌避、拒食、麻醉和抑制生长发育等 方式达到抑制病原菌的效果，并且具有毒力大、对病原菌有较强的特异性作用等优点，苦参 碱丙酮提取物对小麦赤霉病、苹果炭疽病、番茄灰霉病菌丝生长和病菌孢子萌发有明显抑 制作用，其活性杀菌性成分既能抑制菌体的生物合成，又能影响菌体的生物氧化过程，将其 添加到菌剂中拌种时，苦参碱中的活性抑菌成分与种子的萌发和幼苗生长达到同步，并在 完全降解前为植株的幼根提供保护，减少各种土传病害的发生，并减少农药使用量； 6、 降低菌剂生产过程中对无菌环境的要求，降低制备成本： 该方法本身的抗污染特性，使得菌剂制备过程中对于无菌环境的要求高度降低，可一 定程度上减少厂家在设备和厂房上的投入，制成品在贮藏期间菌株代谢速度慢，污染率低， 也同样降低了制成品在贮藏期间对环境的需求，降低了菌剂的生产成本； 7、 方法简便，易于推广： 该方法简便易行，各种耐苦参碱根瘤菌的筛选方法较为成熟，易于操作，且只需利用常 规的菌剂生产设备，抑菌剂及基质载体均属于易获得材料，降低了厂家用于技术改造的成 本，适于大规模推广使用。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1: 一株耐苦参碱根瘤菌株，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌Ensfer meliloti，保藏 单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9296,保藏 日为2014年6月12日。
[0019] 耐苦参碱根瘤菌株的筛选方法为： 将紫花苜蓿根瘤中分离的高效固氮根瘤菌点接于含有600mg/L浓度苦参碱抑菌剂的 平板中，观察其生长情况，并结合含苦参碱平板培养基对空气和土壤源杂菌的抑制效果，筛 选对苦参碱具有较好抗性的耐药菌株，进行传代试验后，选择耐药特性稳定的菌株用作生 产菌株。
[0020] 上述一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用，其是 通过以下的抗污染根瘤菌剂来实现的，抗污染根瘤菌剂是将耐苦参碱根瘤菌株，接入至YMA 液体培养基中发酵培养，待活菌数达到l〇 1(lcfu/ml时，再加入过滤灭菌后的苦参碱抑菌剂， 搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到600mg/L，抗污染根瘤菌剂需置于4°C下冷藏保 存。
[0021] 实施例2:
【具体实施方式】与实施例1相同，所不同之处在于，抗污染根瘤菌剂是将耐苦参碱根瘤 菌株，接入至YMA液体培养基中发酵培养，待活菌数达到101(lCfu/ml时，再加入过滤灭菌后 的苦参碱抑菌剂，搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到600mg/L，再与过筛灭菌基质混 合后制备得到的，过筛灭菌基质为泥炭、蛭石或二者的混合物。
[0022] 本发明所提供的抗污染根瘤菌剂，其制备方法的特殊性在于： 目前根瘤菌剂的生产主要通过提高生产和贮藏环境净度、提高菌剂封装质量，菌剂低 营养化或采用冻干剂型等方法来降低菌剂的污染率，虽有效降低了菌剂污染率，但由于对 生产环境、生产设备及制造工艺的要求较高，使得菌剂的制备成本较高，超出了部分中小型 厂家的承受范围，进而限制了根瘤菌剂的大范围推广和应用。而本方法通过植物源类抑菌 剂苦参碱的添加，可有效降低菌剂生产过程中对环境净度以及生产设备和制造工艺的要 求，且原料易得，无需昂贵的高精仪器，易于推广。所添加的苦参碱抑菌剂，为广谱抑菌的植 物源抑菌剂，对病原菌微生物的作用特异性强，而对人畜低毒，并易于降解，不污染环境，可 有效避免各种化学类抑菌剂施用后残留期长和环境污染等不利影响，是一种环保型的抗污 染根瘤剂。
[0023] 如表1所示为根瘤菌及抑菌剂回接对苜蓿植株结瘤的影响。
[0024] 表 1
【权利要求】
1. 一株耐苦参碱根瘤菌株，其特征在于，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌Ensfer meliloti，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9296,保藏日为2014年6月12日。
2. 如权利要求1所述的一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率 中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌 液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂。
4. 一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，是将如权利要求1所述的耐苦参碱根瘤菌株发 酵培养后的菌液与苦参碱抑菌液混合制备得到的。
5. -种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，是将如权利要求1所述的耐苦参碱根瘤菌株发 酵培养后的菌液加入至苦参碱抑菌液后，再与过筛灭菌基质混合后制备得到的。
6. 根据权利要求4或5所述的一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，所述抗污染根瘤菌剂 中，苦参碱抑菌剂的终浓度为600mg/L。
7. 根据权利要求6所述的一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，是将如权利要求1所述 的耐苦参碱根瘤菌株，培养至对数期，即0. 5-0. 8时的根瘤菌液0. 2 mL接入至通 用YMA液体培养基中，并于28°C下120r/min发酵培养，待活菌数达到101(lcfu/ml时，再加 入经0. 22 ym滤膜过滤灭菌后的苦参碱抑菌剂，搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到 600mg/L〇
8. 根据权利要求5所述的一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，所述过筛灭菌基质为泥 炭和蛭石的混合物，使用粉碎机将基质原料粉碎，过0. 15_筛，泥炭使用前以磨细的CaC03将其pH值调至7. 0,蛭石以HC1调节pH值至7. 0,再将泥炭、蛭石混合物基质置于烘箱中 100 C供干，之后以聚丙如袋双层1?、封后，121 C下尚温灭囷3h，取出冷却并放置2_3d后，待 基质内耐热芽孢杆菌停止休眠时，重复进行灭菌，连续3次，将彻底灭菌的基质置于无菌条 件下保存备用，用量均为5g/袋。
【文档编号】C12R1/01GK104450549SQ201410314002
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】师尚礼, 霍平慧, 李剑峰, 曹文侠, 祁娟, 苗阳阳 申请人:甘肃农业大学