一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草及其应用，所述蛹虫草为蛹虫草(Cordyceps?militaris)YCC-RY-02，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC?NO.9350，保藏日期：2014年7月15日。本发明筛选出的蛹虫草YCC-RY-02，能够生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉。实验结果表明，本发明菌株生产的蛹虫草菌丝粉，其纤溶活性可达200IU/g，DPPH自由基清除率可达83.4％，Fe3+还原能力是豆粕粉的4.42倍。同时，本发明的方法具有操作简单，成本低，周期短、易于实现，原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜等优点，便于规模化生产。
【专利说明】一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草，同时还涉 及该蛹虫草的应用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活节奏的加快和饮食习惯的调整，血栓性疾病显著增加，严重威胁着 人类的健康与生命安全，每年死于脑梗塞、心肌梗死的病人多达几百万，居各种疾病之首。 溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法，因此，具有高纤溶活性的溶栓药物的研发日益受到 人们的关注，有着广阔的发展前景。目前，溶栓剂研究的焦点之一，是通过枯草芽孢杆菌发 酵生产具有高纤溶活性、口服有效的溶栓功能性食品和保健食品。
[0003] 另一方面，活性氧和自由基是人体新陈代谢过程的次生代谢产物，正常情况下总 是处于不断产生和消除的动态平衡中，但如果其含量过高，动态平衡被打破，就会引发癌 症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、神经系统失灵、免疫力降低、关节炎等疾病，其中动脉粥 样硬化又可引起心脑血管疾病，产生血栓，因此，活性氧和自由基是心脑血管疾病的病因之 一。目前有研究表明，食用功能性抗氧化食品补充抗氧化物质，是预防包括心脑血管疾病在 内的多种疾病的有效措施之一。
[0004] 综上所述，活性氧和自由基是包括心脑血管疾病在内的多种疾病的病因，有抗氧 化功能的食品和保健食品可以清除活性氧和自由基，因此也具有预防心脑血管疾病的作 用；而高纤溶活性的保健食品可有效溶解已经形成的血栓，从而治疗心脑血管疾病，如能研 发一种具有纤溶活性和抗氧化功能的功能性食品，则既具有从根源上预防心血管疾病发生 的功能，又能够在血栓产生后具有治疗效果，从而达到预防和治疗相结合的目的，但目前还 没有相关研究的报道。
[0005] 蛹虫草（Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，含有多种活性物质，具有抗肿 瘤、抗病毒、抗菌、降血压、降血糖等多种生物活性，是国家新近批准的新资源食品，具有良 好的安全可靠性。目前有一些关于蛹虫草纤溶酶功能方面的报道；也有研究指出，蛹虫草具 有一定的抗氧化作用，但还未见既有纤溶活性又有抗氧化作用的蛹虫草的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草 及其应用，采用本发明的蛹虫草生产得到的蛹虫草菌丝粉，既有较高纤溶活性又有显著的 抗氧化作用，且生产方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。本发明为防治 心脑血管疾病药物的研发提供了实验基础，为蛹虫草菌丝体的生产提供了一种新的途径， 并为蛹虫草作为功能性食品和保健食品的开发应用研究提供了新的思路。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种生产具有纤溶和抗氧化 功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草，所述蛹虫草为蛹虫草（Cordyceps militaris) YCC-RY-02， 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 9350,保藏日期：2014年7月15日。
[0008] 本发明筛选出的蛹虫草菌株YCC-RY-02,能够生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫 草菌丝粉。实验结果表明，本发明菌株生产的蛹虫草菌丝粉，其纤溶活性可达200IU/g，DPPH 自由基清除率可达83. 4%，Fe3+还原能力是豆柏粉的4. 42倍。
[0009] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种蛹虫草在生产具有纤溶和抗氧化功能 的蛹虫草菌丝粉方面的应用。
[0010] 本发明蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下步 骤：
[0011] (1)挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在22-25°C条件下，120-180rpm摇床 恒温培养4-8d，得到蛹虫草种子液；
[0012] (2)在豆柏中加入水，高压灭菌，冷却至室温后，按照1-8%的接种量接种蛹虫草 种子液，在22-28°C条件下发酵培养4-8d ;
[0013] (3)将步骤（2)的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80-120目筛即 得。
[0014] 步骤⑴中PDA液体种子培养基制备方法为：马铃薯去皮，秤取200g，加1000mL水 煮沸30min，冷却后四层纱布过滤，滤液中加入10g葡萄糖、5g蛋白胨、lg ΚΗ2Ρ04 ·7Η20、0. 5g MgS04 · 7H20,调pH6. 0,定容至1000mL，121°C灭菌20min，用前加入0. 02g过滤除菌的VBlt)
[0015] 步骤（1)中摇床恒温培养时间为5-7d。
[0016] 步骤（2)中加水的重量为豆柏重量的0· 8-1. 2倍。
[0017] 步骤（3)中低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度20-100Pa，冻干 温度45°C，冻干时间24-48h。本发明中冷冻干燥选择低温真空冷冻干燥，而不采用喷 雾干燥，目的是为了更好地保持所得发酵产物的纤溶活性和抗氧化活性。
[0018] 本发明利用筛选得到的蛹虫草发酵生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉， 该方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明原料来源丰富易取， 成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0020] 图1为本发明蛹虫草菌丝粉浸提液纤溶酶活性测定结果；
[0021] 图2为本发明蛹虫草菌丝粉浸提液DPPH自由基清除率测定结果；其中，
[0022] a 为 GSH，b、c、d、e、f 分别为蛹虫草菌株 YCC-RY-02 发酵 4d、5d、6d、7d、8d 的样品 浸提物，g为豆柏粉浸提物；
[0023] 图3为本发明蛹虫草菌丝粉浸提液Fe3+还原能力测定结果；其中，
[0024] a 为 GSH，b、c、d、e、f 分别为蛹虫草菌株 YCC-RY-02 发酵 4d、5d、6d、7d、8d 的样品 浸提物，g为豆柏粉浸提物。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0026] 实施例1
[0027] 1、菌株的分离筛选
[0028] 将2011年8月在河南省汝阳县王坪乡采集的野生新鲜蛹虫草菌株，用清水洗去表 面浮土，于75%乙醇中表面消毒2min，在无菌水中反复冲洗，置于无菌滤纸上晾干。用无菌 解剖刀将消毒后的蛹虫草子座切成长度约〇. 5-1. 0cm的小段，接种于PDA培养基平板上，于 25°C的培养箱中倒置培养。菌丝萌发生长后，选择无污染的菌丝，转接到新的PDA培养基平 板上进一步培养，最终得到纯化的蛹虫草菌株。将分离得到的蛹虫草菌株，接入液体PDA培 养基，25°C，160prm摇床发酵培养7d，取发酵液，在纤维蛋白平板上测定其纳豆激酶活性， 重复3次，最后选择纳豆激酶活性较高的菌株，命名为YCC-RY-02。
[0029] 菌株YCC-RY-02的特征如下：
[0030] 形态特征：
[0031] 于25°C PDA平板上培养5-7d后，YCC-RY-02菌株生长成直径15-30mm的白色菌 落，菌丝洁白、粗壮、致密、有光泽，显微镜下可以看到，菌丝细胞多核、纤细；子囊孢子为线 形、多细胞，169. 78-364. 57 X 1. 72-2. 04 μ m，在大米培养基上25°C培养2-3个月，菌丝体发 育进入一个新的阶段，形成橘黄色顶部略膨大、呈棒状、少分枝、可见纵沟、高l-4cm、直径 5-7mm的子座（子实体）。
[0032] ITS序列测定：
[0033] 提取菌株YCC-RY-02的基因组DNA，后用ITS序列通用引物PCR扩增，得到的PCR 产物用1 %凝胶电泳检测后，送北京华大基因公司测序，其测定结果如下：
[0034] αΛ(^? TCACr C'CACX'C' rrm IGAC'AI ACC' I ATCGT IOC r GCCCAGCGCC TGGACGCGGG CCTGGGCC?GC GGCCGTCGGG GGCCCCAAAC ACTGTATCTA CC'AGTTTTTC TGAATCC'GCC GCAAGGC'AAA AC A A AT G A AT C'AAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCT'C TGG CATC GAT GAAGAACGCA
[0035] GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGC'AG AATTCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGCATT CTGGCGGGC'A TGCCTGTTCG AGCGTCATTT CAACCCTCGA CGTCCCCTGG GGGATGTCGG C'GTTGGGGAC CGGCAGCACA CCGCCGCCCC CGAAATGAAG TGGCGGCCCG TCCGCGGCGA CCTCTGCGTA GTACTCCAAC TCGCACCGGG AACCCGAC'GT GGCCACGCCG TAAAACGCCC AACTCTGAAC GTTGACCTCG GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAAAA GCCCGGAGGA A
[0036] 经 ITS 序列分析表明，YCC-RY-02 为蛹虫草（Cordyceps militaris)菌株。
[0037] 实施例2
[0038] 本实施例用蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下 步骤：
[0039] ⑴挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在25°C条件下，120rpm摇床恒温培养 4d，得到蛹虫草种子液；
[0040] (2)在豆柏中加入0. 8倍豆柏重量的水，121°C高压灭菌25min，冷却至室温后，按 照8%的接种量接种蛹虫草种子液，在25°C条件下发酵培养4d ;
[0041] (3)将步骤（2)的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过120目筛即得； 低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度20Pa，冻干温度-45°C，冻干时间 24h。
[0042] 实施例3
[0043] 本实施例用蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下 步骤：
[0044] ⑴挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在24°C条件下，150rpm摇床恒温培养 6d，得到蛹虫草种子液；
[0045] (2)在豆柏中加入1倍豆柏重量的水，121°C高压灭菌25min，冷却至室温后，按照 7%的接种量接种蛹虫草种子液，在24°C条件下发酵培养5d ;
[0046] (3)将步骤（2)的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过100目筛即得； 低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度60Pa，冻干温度-50°C，冻干时间 36h。
[0047] 实施例4
[0048] 本实施例用蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下 步骤：
[0049] ⑴挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在23°C条件下，180rpm摇床恒温培养 8d，得到蛹虫草种子液；
[0050] (2)在豆柏中加入1. 2倍豆柏重量的水，121°C高压灭菌25min，冷却至室温后，按 照5%的接种量接种蛹虫草种子液，在22°C条件下发酵培养6d ;
[0051] (3)将步骤⑵的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80目筛即得； 低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度lOOPa，冻干温度-45°C，冻干时间 48h。
[0052] 实施例5
[0053] 本实施例用蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下 步骤：
[0054] (1)挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在24°C条件下，140rpm摇床恒温培养 5d，得到蛹虫草种子液；
[0055] (2)在豆柏中加入0. 9倍豆柏重量的水，121°C高压灭菌25min，冷却至室温后，按 照3%的接种量接种蛹虫草种子液，在24°C条件下发酵培养7d ;
[0056] (3)将步骤⑵的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过90目筛即得；低 温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度40Pa，冻干温度-45°C，冻干时间40h。
[0057] 实施例6
[0058] 本实施例用蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法，包括以下 步骤：
[0059] ⑴挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在22°C条件下，170rpm摇床恒温培养 7d，得到蛹虫草种子液；
[0060] (2)在豆柏中加入1. 1倍豆柏重量的水，121°C高压灭菌25min，冷却至室温后，按 照1%的接种量接种蛹虫草种子液，在28°C条件下发酵培养8d ;
[0061] (3)将步骤⑵的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过110目筛即得； 低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度80Pa，冻干温度-50°C，冻干时间 30h。
[0062] 实验例、本发明蛹虫草菌丝粉纤溶活性和抗氧化功能的测定
[0063] 样品的制备：配制质量分数2 %的蛹虫草菌丝粉生理盐水悬液，4°C浸提4h， 5000 X g离心lOmin后，取上清液，15000 X g重复离心lOmin，上清液用于纤溶活性和抗氧化 功能的测定。
[0064] 1、纤维平板法测定蛹虫草菌丝粉的纤溶活性
[0065] 纤维蛋白平板的制备：秤取琼脂糖lg，加热溶解于0. 01M pH7. 4的磷酸钠盐缓冲 液lOOmL中，取该琼脂糖溶液7. 5mL，50°C水浴保温5min，加入溶于生理盐水的100BP/mL 凝血酶溶液225 μ L，混匀，再次50°C恒温水浴5min，取7. 5mL 3. 6mg/mL牛纤维蛋白原溶液 (溶于0. 1M pH7. 4的磷酸钠盐缓冲液），加入保温的凝血酶一琼脂糖溶液中，迅速混匀，倒 入直径9cm的培养皿中，待凝。
[0066] 标准曲线的绘制：取尿激酶标准品，用灭菌生理盐水分别配成浓度为20、40、60、 80和100IU/mL的溶液。各取10μ L点样于纤维蛋白平板上，37°C保温18h，测定纤维蛋白 平板上溶解圈的直径，计算溶解圈面积；以尿激酶活性（IU/mL)为横坐标，溶解圈面积为纵 坐标，绘制尿激酶标准曲线。
[0067] 纤溶活性的测定：用微量加样器移取10 μ L蛹虫草菌丝粉浸提液，点样于纤维蛋 白平板上，37°C保温18h，测量纤维蛋白平板上溶解圈的直径，计算溶解圈面积（见附图1)。 根据标准曲线，计算纤溶活性。
[0068] 结果发现，蛹虫草菌丝粉的纤溶活性在发酵第6d时最高，达到200IU/g，其后随发 酵时间的延长变化不大。
[0069] 2、96孔板测定蛹虫草菌丝粉清除DPPH自由基的能力
[0070] 取100yL样品加入96孔板中，再加入100yL 0. ImM DPPH(溶于甲醇），混匀， 25°C避光静置30min，测定其517nm处的吸光度，此为As(Asample) ;Ac(Acontrol)为 100 μ L 水 +100 μ L DPPH 的 0D 值；Ab (Ablank)为 100 μ L 甲醇 +100 μ L 样品的吸光度。如 下公式计算样品对DPPH的清除率：DPPH自由基清除率（％ ) = [l-(As-Ab)/Ac] Χ100%。 用lmg/mL的谷胱甘肽（GSH)生理盐水溶液做阳性对照。
[0071] 结果发现，发酵6-8d的蛹虫草菌丝粉浸提液的DPPH自由基清除率达到83. 4%，是 豆柏粉浸提液DPPH自由基清除率（29. 4% )的2. 87倍，与阳性对照GSH清除DPPH自由基 的能力（91%)相差不大（测定结果见附图2)，说明固体发酵得到的蛹虫草菌丝粉具有非 常强的DPPH自由基清除能力。
[0072] 3、96孔板测定蛹虫草菌丝粉还原Fe3+的能力：
[0073] 取250 μ L样品，与250 μ L质量分数1 %的铁氰化钾水溶液混合（对照中不含 样品）。5〇1：水浴保温2〇1^11，随后加入25(^1^质量分数10%三氯乙酸水溶液，混匀后 5000Xg离心10min，取100yL上清液，加入96孔板中，与20yL质量分数0· 1% FeClyjC 溶液混合，并加入80 μ L蒸馏水，混匀，25°C静置lOmin，体系由黄色变为蓝色，测定上清液 700nm处的吸光度。
[0074] 测定结果表明，蛹虫草菌丝粉Fe3+还原能力随其发酵时间的延长而增加，发酵8d 时最强，〇D7(l(lmi值达到0. 53,虽与GSH 0D7(l(lmi值（1. 57)差别较大，但却是豆柏粉浸提物Fe3+ 还原能力（007(|(|11111值为0.12)的4.42倍，说明蛹虫草酵菌丝粉具有较强的？#+还原能力（测 定结果见附图3)。
[0075] 实验结果表明，本发明发酵的蛹虫草菌丝粉具有显著的纤溶活性和较强的抗氧化 功能。因此，本发明提为蛹虫草菌丝体的规模化生产提供了一种新的途径，并为其作为功能 性食品和保健食品的开发应用研究提供了新的思路。
【权利要求】
1. 一种生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的蛹虫草，其特征在于，所述蛹虫 草为蛹虫草（Cordyceps militaris)YCC-RY-〇2,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 9350， 保藏日期：2014年7月15日。
2. -种如权利要求1所述的蛹虫草在生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉方 面的应用。
3. -种如权利要求1所述的蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方 法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 挑取蛹虫草接种于PDA液体种子培养基，在22-25°C条件下，120-180rpm摇床恒温 培养4-8d，得到蛹虫草种子液； (2) 在豆柏中加入水，高压灭菌，冷却至室温后，按照1-8%的接种量接种蛹虫草种子 液，在22-28°C条件下发酵培养4-8d ; (3) 将步骤（2)的蛹虫草豆柏培养物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80-120目筛即得。
4. 根据权利要求3所述的蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方 法，其特征在于，步骤（1)中PDA液体种子培养基制备方法为：马铃薯去皮，秤取200g， 加1000mL水煮沸30min，冷却后四层纱布过滤，滤液中加入10g葡萄糖、5g蛋白胨、lg ΚΗ 2Ρ04 ·7Η20、0· 5g MgS04 ·7Η20,调 ρΗ6· 0,定容至 1000mL，121°C灭菌 20min，用前加入 0· 02g 过滤除菌的VBlt)
5. 根据权利要求3所述的蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法， 其特征在于，步骤（1)中摇床恒温培养时间为5-7d。
6. 根据权利要求3所述的蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法， 其特征在于，步骤（2)中加水的重量为豆柏重量的0.8-1. 2倍。
7. 根据权利要求3所述的蛹虫草生产具有纤溶和抗氧化功能的蛹虫草菌丝粉的方法， 其特征在于，步骤（3)中低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度20-100Pa， 冻干温度彡-45°C，冻干时间24-48h。
【文档编号】C12N1/14GK104152360SQ201410407513
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】周伏忠, 陈晓飞, 孙玉飞, 慕琦, 陈国参, 王雪妍, 冯菲 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司