一种高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，包括：溶胶形成步骤：在常温下以稀酸为催化剂将正硅酸乙酯(TEOS)水解至形成透明溶胶，并将溶胶中乙醇抽离至质量含量≤5％；凝胶形成步骤：在搅拌下向溶胶中依次加入模板溶液和纤维二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，放置生成凝胶。根据本发明另一方面公开了根据上述方法制备得到的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料。根据本发明方法制备得到的纳米介孔材料孔径约2～7nm，因此具有很高的比表面积；所述纳米介孔材料的生物活性高且能重复利用。
【专利说明】一种高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纳米介孔材料及其制备方法，尤其涉及一种高活性固定化纤维二 糖酶纳米介孔材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 受世界石油供应、价格、环保和全球气候变化等因素的影响，可再生洁净能源一生 物燃料的发展受到了许多国家的重视，尤其是美国、巴西和中国。生物燃料以燃料乙醇为 主，生物技术酶法是利用地球上数量最大的可再生性碳源物质纤维素获得燃料乙醇的重要 步骤之一。然而纤维素的高聚合度使得其难降解，与淀粉相比纤维素的酶解速率要差2个 数量级以上，使纤维素酶的成本过高，从而严重制约该技术的工业应用，为此国内外研宄者 采取许多措施解决此问题，如对纤维素酶进行固定，提高其稳定性，使其能重复使用。
[0003] 越来越多的研宄表明，可操作性与可重复性固定化纤维素酶能够极大降低纤维素 酶解工艺成本，这使其成为国内外研宄热点。载体被认为是决定固定化酶效果的关键因素 之一。根据载体水溶性，可将其分为可溶性载体和不溶性载体两大类。天然纤维素都是不溶 性载体，许多研宄者最初认为只能设计可溶性载体固定化纤维素酶才具有活性。但随着近 年来不溶性载体的快速发展，可溶性载体固定纤维素酶的优异性不再明显。将纤维素酶固 定在可溶性载体上，其动力学性质没有变化，操作稳定性提高也不显著，反而由于存在不易 回收的致命缺陷，在20世纪90年代后很快脱离研宄者的视野。不溶性载体主要包括廉价淀 粉接枝丙烯腈、丙烯酰胺两亲性高分子化合物形成多孔颗粒状载体和改性的壳聚糖等。不 溶性载体固定化纤维素酶回收极其方便，酶稳定性提高也十分明显，但与底物，尤其是不溶 性底物之间的传质阻力大，因此需要对不溶性载体进行改造使其具有大的比表面积。
[0004] 其中，燃料乙醇主要包括粮食乙醇和纤维素乙醇。在世界粮食短缺的大背景下， "不与人争粮，不与粮争地"，以秸杆、锯末、蔗渣、生活垃圾等物质生产可再生能源（如：纤 维素乙醇）是世界各国未来能源发展的重要战略，因此纤维素乙醇产业得到了大力发展。 我国每年纤维素乙醇产量400万吨，我国"十二五"国家战略性规划实现低成本纤维素酶突 破。按照目前纤维素乙醇的生产规模，仅美国纤维素乙醇产业市场所需要的纤维素酶即可 达到30万吨以上，我国纤维素酶的需求量也将近在10万吨左右。但在纤维素乙醇生产过 程中存在纤维素酶不能回收并重复使用，生产成本高且无法大规模生产等问题。固定化纤 维素酶主要用于生产纤维素乙醇。用固定化纤维素酶代替自由纤维素酶，可以重复使用从 而降低纤维素乙醇的生产成本，可以大大促进可再生生物能源产业发展。
[0005] 目前，固定化纤维素酶技术大多采用聚合物凝胶材料为载体，或者采用表面活性 剂的凝胶化方法。采用聚合物凝胶材料为载体的固定化酶使用周期短、成本高、抗毒性差、 活性低且重复使用次数少；采用表面活性剂凝胶化方法制备固定化酶的溶胶凝胶过程以及 模板移除过程往往需要严苛的条件（如高温高压、强酸碱环境以及使用大量有机溶剂），这 些严苛的条件对生物活性物质（如：蛋白质和核酸）具有极大的破坏作用，从而极大的限 制了传统表面活性剂法在生物领域的应用，且该方法制备得到的固定化酶的回收也存在问 题。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种 高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料及其制备方法。
[0007] 根据本发明的一方面，提供了一种高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备 方法，该方法包括：溶胶形成步骤：在常温下以稀酸为催化剂将TEOS水解至形成透明溶胶， 并将溶胶中乙醇抽离至质量含量< 5%;凝胶形成步骤：在搅拌下向所述溶胶中依次加入模 板溶液和纤维二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，放置生成凝胶。
[0008] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述稀酸为0. 1?0. 3M的HC1溶液，所述 HC1溶液与所述TEOS的质量比为5:32?13:32。
[0009] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述模板为葡萄糖、麦芽糖、果糖、二苯甲酰 基-L-酒石酸、环糊精、尿素、甘油、可溶性淀粉、柠檬酸、抗坏血酸或寡肽。
[0010] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述模板溶液与所述TEOS的质量比为 2:32 ?6:32〇
[0011] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述纤维二糖酶缓冲液浓度为10?100mg/ ml〇
[0012] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述纤维二糖酶缓冲液与所述TEOS的质量 比为 1:32 ?10:32。
[0013] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述稀碱液为NaOH溶液、K0H溶液或NH3. h2o〇
[0014] 可选地，根据本发明的制备方法，其中所述NaOH溶液的浓度为0. 4?0. 8M。
[0015] 可选地，根据本发明的制备方法，进一步包括：
[0016] 去除模板干燥步骤：将所述凝胶研碎、加水洗涤除去模板抽滤得到凝胶，将抽滤 得到的凝胶埋入硅胶中干燥3-7天。
[0017] 根据本发明的另一方面，提供了一种根据上述制备方法得到的高活性固定化纤维 二糖酶纳米介孔材料。
[0018] 根据本发明方法制备得到的介孔材料固定化纤维二糖酶的产品活性可达自由纤 维二糖酶活性的90%以上，可重复使用九次以上而保持活性不降低；利用介孔材料固定纤 维二糖酶可以提高纤维二糖酶的储存稳定性和使用温度，延长其在恶劣环境下的存储周 期。本发明方法采用非表面活性剂法，在室温、常压、接近中性且几乎是纯水相的环境中制 造出介孔结构，实现溶胶凝胶造孔与原位包埋生物活性物质的同步化，工艺过程简单、条件 温和、环境友好，适宜于工业化。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通 技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明 的限制。在附图中：
[0020] 图1示出了根据本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法流 程图；
[0021] 图2示出了高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的形态；
[0022] 图3示出了高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的重复使用次数与活性变化 图；
[0023] 图4示出了根据本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法原 理图；
[0024] 图5示出了根据本发明的溶胶形成机理图；
[0025] 图6示出了根据本发明的溶胶形成交联网络凝胶化原理图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上 下文中。在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实现方式的 示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。
[0027] 根据本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，原理如图4所 不〇
[0028] 根据图4和图1示出的流程图可以看出，该方法首先进入溶胶形成步骤S1100 :常 温下以稀酸为催化剂在搅拌状态下将正硅酸乙酯（TEOS)水解至透明溶胶，并将溶胶中乙 醇抽离至质量含量< 5%。
[0029] 其中TEOS为正硅酸乙醋，在常温下以稀酸为催化剂，一般采用0. 1?0. 3M的HC1 溶液，HC1溶液与TEOS的质量比为5:32?13:32。常温下在TEOS中边搅拌边加入稀盐酸， 剧烈搅拌10?20min，得到透明的溶胶，将水解后得到的透明溶胶在0-KTC冷却（如放置 在冰箱中进行）2?4h，用高真空系统抽离除去体系水解过程中产生的副产物乙醇，温度冷 却至0-10°C为防止抽真空时由于体系中乙醇含量过高出现沸腾现象防止溶胶溅出，抽离一 段时间后，为将体系中乙醇去除更彻底，将溶胶体系用水浴加热至37-50°C恒温后进一步抽 取，至体系中乙醇质量含量< 5 %，抽取一段时间后加热进行进一步抽离，使乙醇抽离更加 彻底。将体系中的乙醇含量降低至<5%，是由于在溶胶中存在大量乙醇会影响后续生成的 高活性固定化纤维二糖酶的活性，而采用本方法后将体系中乙醇的含量控制在<5%时即 可不对高活性固定化纤维二糖酶的活性造成影响，因此本制备方法的制备条件相对更加宽 松，容易实现。其中，溶胶形成机理如图5所示。
[0030] 根据本发明的方法及上述原理图，该方法然后进行凝胶形成步骤：在搅拌下向形 成的溶胶中依次加入模板溶液和纤维二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在4-KTC 放置48?72h生成凝胶。
[0031] 在凝胶形成步骤的模板为葡萄糖、麦芽糖、果糖、二苯甲酰基-L-酒石酸、环糊精、 尿素、甘油、可溶性淀粉、柠檬酸、抗坏血酸或寡肽。模板与TEOS的质量比为2:32?6:32， 将模板制备成溶液加入体系中。纤维二糖酶缓冲液浓度为10?l〇〇mg/ml，纤维二糖酶缓冲 液与TEOS的质量比为1:32?10:32。稀碱液为NaOH溶液、K0H溶液或NH 3. H20。其中NaOH 溶液的浓度为〇. 4?0. 8M。溶胶进一步发生缩聚和醇解并形成交联网络凝胶化原理如图6 所示。
[0032] 根据本发明的制备方法及图6,该方法进一步进入去除模板干燥步骤S1300 :将所 述凝胶研碎、加水洗涤除去模板抽滤得到凝胶，将抽滤得到的凝胶埋入硅胶中干燥3-7天， 将干燥好的凝胶研磨过40目筛子装袋备用。
[0033] 根据本发明制备得到的介孔材料固定化纤维二糖酶产品活性可达自由纤维二糖 酶活性的90%以上，可重复使用九次以上而保持活性不降低；利用介孔材料固定纤维二糖 酶可以提高纤维二糖酶的储存稳定性和使用温度，延长其在恶劣环境下的存储周期。本发 明方法采用非表面活性剂法，在室温、常压、接近中性且几乎是纯水相的环境中制造出介孔 结构，实现溶胶凝胶造孔与原位包埋生物活性物质的同步化，工艺过程简单、条件温和、环 境友好，适宜于工业化。
[0034] 根据本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，可以根据溶胶 凝胶形成的条件、加入模板的量和种类、纤维二糖酶缓冲液的浓度和加入量等因素进行具 体设计出不同的实施例，下面将以高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法为实 施例对本发明的制备方法进行示例性说明。
[0035] 实施例1-6中使用原料如下：
[0036]正硅酸乙酯（TEOS)，国药试剂集团，纯度> 99%
[0037] 纤维二糖酶（Cellobiase)，阿拉丁试剂，250U/g
[0038] 盐酸（0? lmol/L)，国药试剂集团
[0039] 实施例1
[0040] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入5克0. 1M的稀HC1 溶液，盐酸溶液与TE0S的质量比为5:32,剧烈搅拌lOmin后，在常温下以稀酸为催化剂将 TE0S水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在0°C冷却降温2h后用高真空系统抽离体 系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至37 °C进行抽离，直至 溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0041] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在4°C下放置48h生成凝胶。模板溶液为2克葡萄 糖溶于10克水中制成的溶液（葡萄糖与TE0S的质量比2:32)。加入10mg/ml纤维二糖酶 缓冲液1克（纤维二糖酶缓冲液与TE0S的质量比为1:32)。稀碱液为浓度为0. 4M的NaOH 溶液。
[0042] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水洗涤2次除去 葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥3天，研磨过 40目筛，装袋备用。
[0043] 实施例2
[0044] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入13克0. 3M的稀 HC1溶液，盐酸溶液与TE0S的质量比为13:32,剧烈搅拌20min后，在常温下以稀酸为催化 剂将TE0S水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在10°C冷却降温4h后用高真空系统 抽离体系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至50 °C进行抽 离，直至溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0045] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在10°c下放置72h生成凝胶。模板溶液为6克果 糖溶于10克水中制成的溶液（果糖与TEOS的质量比6:32)。加入100mg/ml纤维二糖酶缓 冲液10克（纤维二糖酶缓冲液与TEOS的质量比为10:32)。稀碱液为浓度为0. 8M的NaOH 溶液。
[0046] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水洗涤2次除去 葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥7天，研磨后 过40目筛，装袋备用。
[0047] 实施例3
[0048] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入9克0. 2M的稀HC1 溶液，盐酸溶液与TEOS的质量比为9:32,剧烈搅拌15min后，在常温下以稀酸为催化剂将 TEOS水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在5°C冷却降温3h后用高真空系统抽离体 系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至45°C进行抽离，直至 溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0049] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在8°C下放置60h生成凝胶。模板溶液为4克麦芽 糖溶于10克水中制成的溶液（麦芽糖与TEOS的质量比4:32)。加入60mg/ml纤维二糖酶 缓冲液5克（纤维二糖酶缓冲液与TEOS的质量比为5:32)。稀碱液为浓度为0. 6M的NaOH 溶液。
[0050] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水洗涤2次除去 葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥4天，研磨过 40目筛，装袋备用。
[0051] 实施例4
[0052] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入7克0. 3M的稀HC1 溶液，盐酸溶液与TEOS的质量比为7:32,剧烈搅拌16min后，在常温下以稀酸为催化剂将 TEOS水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在7°C冷却降温3. 5h后用高真空系统抽离 体系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至48°C进行抽离，直 至溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0053] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在8°C下放置68h生成凝胶。模板溶液为3克二 苯甲酰基-L-酒石酸溶于10克水中制成的溶液（二苯甲酰基-L-酒石酸与TEOS的质量 比3:32)。加入50mg/ml纤维二糖酶缓冲液6克（纤维二糖酶缓冲液与TEOS的质量比为 6:32)。稀碱液为浓度为0. 7M的NaOH溶液。
[0054] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水洗涤2次除去 葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥4天，研磨过 40目筛，装袋备用。
[0055] 实施例5
[0056] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入12克0. 2M的稀 HC1溶液，盐酸溶液与TE0S的质量比为12:32,剧烈搅拌13min后，在常温下以稀酸为催化 剂将TE0S水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在6 °C冷却降温3h后用高真空系统抽 离体系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至42 °C进行抽离， 直至溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0057] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在7°C下放置55h生成凝胶。模板溶液为3克葡萄 糖溶于10克水中制成的溶液（葡萄糖与TE0S的质量比3:32)。加入70mg/ml纤维二糖酶 缓冲液8克（纤维二糖酶缓冲液与TE0S的质量比为8:32)。稀碱液为浓度为0. 6M的NaOH 溶液。
[0058] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水洗涤2次除去 葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥4天，研磨过 40目筛，装袋备用。
[0059] 实施例6
[0060] 根据图1示出的本发明的高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，首 先进入溶胶形成步骤S1100 :称取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在搅拌下加入12. 5克0. 1M的稀 此1溶液，盐酸溶液与1￡05的质量比为12.5:32，剧烈搅拌151^11后，在常温下以稀酸为催 化剂将TE0S水解至形成透明溶胶，将水解后的透明溶胶在4°C冷却降温2h后用高真空系 统抽离体系水解过程中产生的副产物乙醇，抽离一段时间后将溶胶水浴恒温至37°C进行抽 离，直至溶胶中乙醇质量含量< 5%。
[0061] 然后进入凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维 二糖酶缓冲液，用稀碱液将体系调至中性，在4°C下放置48h生成凝胶。模板溶液为2克果 糖溶于10克水中制成的溶液（果糖与TE0S的质量比2:32)。加入10mg/ml纤维二糖酶缓 冲液1克（纤维二糖酶缓冲液与TE0S的质量比为1:32)。稀碱液为浓度为0. 4M的NaOH溶 液。
[0062] 最后进入去除模板干燥步骤S1300 :将形成的凝胶研碎、加150ml水搅拌洗涤2 次除去葡萄糖抽滤得到白色凝胶，将抽滤得到的凝胶用滤纸埋在干燥的硅胶中干燥3天 (72h)，研磨过40目筛，装袋备用。
[0063] 根据实施例1-6制备得到的高活性固定化纤维二糖酶的纳米介孔材料，固定化纤 维二糖酶产品活性可达自由纤维二糖酶活性的90%以上；所述材料可重复使用十次以上 而保持活性不降低；利用介孔材料固定纤维二糖酶可以提高纤维二糖酶的储存稳定性和使 用温度，延长其在恶劣环境下的存储周期。本发明方法采用非表面活性剂法，在室温、常压、 接近中性且几乎是纯水相的环境中制造出介孔结构，实现溶胶凝胶造孔与原位包埋生物活 性物质的同步化，工艺过程简单、条件温和、环境友好，适宜于工业化。
[0064] 对根据本发明的制备方法得到的高活性固定化纤维二糖酶的纳米介孔材料进行 了系列性能表征。
[0065] ( -）活性测定
[0066] 活力测定方法：纤维二糖酶活力（cellobiase activity, CBA)按照IUPAC推荐的 标准方法测定，以国际单位IU表示。取1. OmL纤维二糖底物（15mmol/L、pH = 4. 8)于试管 中，加入lmL适当稀释的酶液，在50°C下恒温反应30min。用葡萄糖氧化酶法测定生成的葡 萄糖，并扣除空白试验测定值。一个纤维二糖酶活力国际单位（CBIU)等于标准酶促反应条 件下每分钟生成2. Oumol葡萄糖的酶量。则有：
[0067]
【权利要求】
1. 一种高活性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料的制备方法，该方法包括： 溶胶形成步骤S1100 :在常温下以稀酸为催化剂将TEOS水解至形成透明溶胶，并将溶 胶中的乙醇抽离至质量含量< 5% ; 凝胶形成步骤S1200 :在搅拌下向所述溶胶中依次加入模板溶液和纤维二糖酶缓冲 液，用稀碱液将体系调至中性，放置生成凝胶。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述稀酸为0. 1?0. 3M的HC1溶液，所述HC1 溶液与所述TEOS的质量比为5:32?13:32。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述模板为葡萄糖、麦芽糖、果糖、二苯甲酰 基-L-酒石酸、环糊精、尿素、甘油、可溶性淀粉、柠檬酸、抗坏血酸或寡肽。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述模板与所述TEOS的质量比为2:32? 6:32〇
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述纤维二糖酶缓冲液浓度为10?100mg/ ml〇
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其中所述纤维二糖酶缓冲液与所述TEOS的质量比 为 1:32 ?10:32。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述稀碱液为NaOH溶液、K0H溶液或NH3. H20。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其中所述NaOH溶液的浓度为0. 4?0. 8M。
9. 根据权利要求1所述的制备方法，该方法进一步包括： 去除模板干燥步骤S1300 :将所述凝胶研碎、加水洗涤除去模板抽滤得到凝胶，将抽滤 得到的凝胶埋入硅胶中干燥3-7天。
10. -种根据权利要求1-9任一所述制备方法得到的高活性固定化纤维二糖酶纳米介 孔材料。
【文档编号】C12N11/04GK104450663SQ201410605836
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月2日 优先权日:2014年11月2日
【发明者】危岩, 李书润, 翟文涛 申请人:清华大学