一种发酵混合果蔬汁饮料及其制备方法与流程

本发明属于乳酸菌和果蔬加工的技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的发酵混合果蔬汁饮料及制备方法。

背景技术：

近年来，消费者日益追求天然健康无添加的食品，益生菌制品显然很符合消费者需求。然而，毫无疑问的是发酵乳制品在仍占益生菌产品的主要部分，78％的益生菌制品是通过酸奶的形式被销售。由于部分人群对乳糖不耐受，一些地区经济落后，发酵乳制品虽然营养价值高但是成本也较高，因此发展一种低成本而又绿色健康的产品具有极大的潜在价值。进行新鲜果蔬的乳酸发酵是一种低成本和可持续的过程，目的是保留原材料感官和营养特性以及在安全的条件下延长保质期。植物乳杆菌是最常发现和用于发酵蔬菜和水果的乳酸菌物种之一，常存在于植物、乳制品、肉和小麦发酵产品以及人类和动物的胃肠道中。

选用植物乳杆菌进行果蔬汁发酵可以让乳糖不耐症患者同样享用益生菌发酵制品的益处同时还可以增加软饮料竞争力，促进饮料工业的发展。鉴于乳酸菌发酵是一种低成本可持续的过程，因此益生菌发酵果蔬汁饮料具有广阔的发展前景以及巨大的经济效益。饮料行业中的传统碳酸饮料已经逐渐被大众抛弃，发酵混合果蔬汁饮料制品开始得到人们青睐。据美国全球行业分析公司(Global Industry Analysts,Inc)的数据分析，欧美国家的果蔬汁消费占据全球消费总量最多，但是亚太地区在近几年开始大幅增长，最为明显的是日本。可以估测，益生菌发酵果蔬汁将在饮料行业日益兴盛起来。最近，一些蔬菜和水果成功地被乳酸菌发酵。欧洲一些科研人员研究了双歧杆菌及乳酸菌发酵胡萝卜、芹菜、大蒜等果蔬的情况，但并没有对产品作相关评价。

木瓜，属于热带水果，具有很高的营养价值和药用价值。木瓜中维生素A和维生素C含量比西瓜和香蕉高，同时具有丰富的矿物质以及有机酸，它所含有的齐墩果酸具有抗菌作用并有利于治疗心脑血管疾病，而有机酸则可以促进人体消化吸收。除此之外，木瓜黄酮也有助于稳定血管弹性。果胶类物质则可以抗辐射。另外木瓜中的酶可促进产妇有产乳。而胡萝卜是最常见的一种营养蔬菜，主要营养成分就是胡萝卜素，含量高达9～13mg/100g，其中β胡萝卜素的含量较高，另外还含有丰富的微量元素。除此之外，类胡萝卜素、双岐因子和核酸物质等物质具有抗氧化功效并可以抑制癌变，同时有助于肠道益生菌生长。目前国内利用益生菌发酵木瓜的产品目前限于木瓜发酵乳制品，益生菌发酵木瓜饮料并没有太多研究；同时，目前国内益生菌发酵胡萝卜汁的研究也暂时不多。

技术实现要素：

本发明针对现有乳酸菌发酵木瓜和胡萝卜饮料的研究不足，目的是提供一种发酵混合果蔬汁饮料及其制备方法。本发明一种发酵混合果蔬汁饮料具有良好的抗氧化活性的特点，制作过程简单，制品的口感和风味符合“国家标准GB16321-2003乳酸菌饮料卫生标准”中规定的要求。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种发酵混合果蔬汁饮料的制备方法，以木瓜胡萝卜混合果蔬汁为发酵原料，将乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得具有抗氧化活性的灭菌型和活菌型两款发酵果蔬汁饮料。具体发酵生产步骤如下：

(1)混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按2～4:1的比例混合并破碎后，再加蔗糖后和水后得到混合果蔬汁饮料；

(2)混合果蔬汁饮料的加热杀菌：90℃～96℃加热7min～15min；

(3)将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为6％～8％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在28℃～40℃发酵12h～22h后，即制得发酵混合果蔬汁饮料。

所述混合果蔬汁中木瓜和胡萝卜的总含量为50％～70％，蔗糖的含量5％～15％，余量为水。

所述发酵混合果蔬汁饮料再经过无菌灌装、冷藏，制得活菌型发酵混合果蔬汁饮料。

所述发酵混合果蔬汁饮料，经过滤和灭菌后，再经过无菌灌装，制得灭菌型发酵混合果蔬汁饮料。

所述植物乳杆菌DMDL9010活化液：将植物乳杆菌DMDL 9010接种于MRS肉汤培养基内，经1～2次传代培养，pH值达到6.0±0.5，菌种达到正常活力时贮藏于0～4℃。

所述活菌型发酵混合果蔬汁饮料的发酵最佳条件：发酵温度34℃，接种量6％，发酵时间18h。

所述灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的发酵最佳条件：发酵温度34℃，接种量7％，发酵时间16h。

所述活菌型发酵混合果蔬汁饮料中活菌数达到10⁹cfu/mL以上。

本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：

(1)本发明首次利用植物乳杆菌对木瓜和胡萝卜两种果蔬汁复合进行发酵，发酵混合果蔬汁饮料属于直接加工，成本低，工艺要求不高,市场潜力大，再者发酵混合果蔬汁饮料具有一定的调节人体肠道健康的功能打破了传统的乳酸菌饮料加工模式，而将乳酸菌发酵与果蔬加工结合起来，属于新型天然无添加饮料，口感适宜。

(2)DMDL 9010菌株具有很好的耐酸性，为益生菌提供了一个基础条件。

(3)活菌型发酵混合果蔬汁饮料在4℃条件下储存28天后pH基本不变，乳酸含量先上升后趋于稳定，最终保持在3.32g/L，活菌数则从初始3.5×10⁹cfu/mL减少到1.14×10⁹cfu/mL，但是仍大于10⁶cfu/m L；灭菌型发酵混合果蔬汁饮料于常温储存3个月后，pH基本不变，乳酸含量基本不变，保持在2.25g/L，各项指标均正常，其保质期可达到3个月以上。两款产品均符合GB16321-2003对乳酸菌饮料的规定。

所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.5172，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述乳杆菌DMDL 9010已经在公开号为104430851A的中国专利中公开，属于现有技术。

附图说明

图1是发酵果蔬汁饮料的加工工艺流程图。

图2是发酵时间、发酵温度、接种量分别对发酵混合果蔬汁饮料中乳酸含量的影响。

图3是实施例1活菌型发酵混合果蔬汁饮料中D-、L-乳酸色谱图。

图4是实施例1冷藏条件下活菌型发酵混合果蔬汁饮料的pH值变化。

图5是实施例1冷藏条件下活菌型发酵混合果蔬汁饮料的乳酸含量变化。

图6是实施例1冷藏条件下活菌型发酵混合果蔬汁饮料的活菌数变化。

图7是实施例4灭菌型发酵混合果蔬汁饮料中D-、L-乳酸色谱图。

图8是实施例4灭菌型发酵混合果蔬汁饮料在常温条件下pH值变化。

图9是实施例4灭菌型发酵混合果蔬汁饮料在常温条件下乳酸含量变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按3:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为60％，蔗糖的含量为10％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：90℃加热7min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为6％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在34℃发酵18h后，经过无菌灌装、冷藏，即得活菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.60g/L，pH为3.37，活菌数达到3.5×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

实施例1中的发酵工艺条件是通过单因素试验优化，当木瓜和胡萝卜质量比1:1的混合果蔬汁味道太重，而木瓜和胡萝卜质量比在2～4:1的混合果蔬汁饮料的口感适宜，而且有利于降低成本。木瓜和胡萝卜的总含量在50％～70％的混合果蔬汁饮料色泽均一，为橙黄色，有较为浓郁的木瓜和胡萝卜的香味，口感细腻，柔和爽口，组织状态均一细腻，而蔗糖的含量在5％～15％的发酵混合果蔬汁饮料酸甜可口。因此，最佳发酵时间范围为14h～22h，最佳发酵温度范围为32℃～36℃，最佳接种量范围为6％～8％，采用三因素三水平的正交试验(表1)，以产乳酸量和活菌数为指标，确定活菌型发酵木瓜和胡萝卜混合果蔬汁饮料最佳发酵工艺参数。发酵工艺结果见表2。

表1本例中三因素三水平正交试验表

从表2的极差R可知，从乳酸含量看，C＞B＞A，发酵时间C对乳酸产生量影响最大，而接种温度B影响最小。其中试验3号产酸量最高可达3.0g/L乳酸量。根据pH的结果，C＞B＞A，发酵时间C对pH影响最大。就活菌数结果而言，B＞A＞C，即接种量B影响最大。其中试验4号活菌量最高可达3.5×10⁹cfu/mL，由于此为活菌型饮料，因此结合活菌数最高和产酸量适中的原则可以确定活菌型发酵混合果蔬汁饮料的最佳发酵工艺为4号，即发酵温度34℃、接种量6％、发酵时间18h。

表2本例中正交试验结果

所述植物乳杆菌DMDL9010活化液：采用MRS肉汤培养基分装于试管内121℃，15min灭菌制成培养基，将植物乳杆菌DMDL 9010按1∶9接入培养基内，经2次传代培养，pH值达到6.0，菌种达到正常活力时将制好的发酵剂贮藏于3℃。

(1)感官指标检测：木瓜和胡萝卜发酵混合果蔬汁饮料制成后，为使果蔬汁饮料口感最佳，先于4℃条件下冷藏24h～48h，再进行感官评价(参考GB/T31121-2004《果蔬汁类及其饮料》第5.2款“感官要求”)。采用评分检验法，检验由10名感官性能良好的评价员进行评价，检验分数由10名评价员各项分数取平均值求和得出。如下表3为该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的感官检验结果。由于活菌型发酵混合果蔬汁饮料未经灭菌处理，乳酸含量相比较高，其风味较灭菌型要浓郁，口感更清爽，由于是活菌型饮料，所以分层较灭菌型明显，最终得分为96分，属于较优产品。

表3本例中感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：根据酸碱中和原理，用已标定的0.1mol/mL NaOH标准溶液标定，按碱液的消耗量计算总酸度，参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》。该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的酸度为150°T。

②可溶性固形物含量：阿贝折光计测定，参照GB/T 12413-2003《饮料通用分析方法》。该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的可溶性固形物含量为10％。

(3)卫生指标检测：参照GB/T 16321-2003，乳酸菌计数(平板稀释法)、大肠杆菌的测定(平板稀释法)；菌落总数的测定(平板稀释法)。该活菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003，其中活菌数达到3.5×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：柠檬酸、苹果酸和乳酸的含量，利用高效液相色谱法，参照GB/T16631-2008，有机酸柱是Phenomenex公司的ROA-Organic Acid，7.8mm ID×300mm L，流速为0.6mL/min，检测波长为254.0nm，进样量为5μL，流动相为0.002mmol/L稀硫酸溶液，柱温为40℃。

乳酸中两种手性异构体含量，参照文献(刘冬梅，吴晖，余以刚，等.高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定[J].现代食品科技.2007(08):74-76.)的方法进行，使用美国Waters高效液相色谱仪，使用的手性分离柱子是Phenomenex公司的Chire×3126(D)-penicillamir，4.60mm ID×250mm L，流速为1mL/min，检测波长为254.0nm，进样量为5μL，流动相为0.2mmol/L硫酸铜溶液(溶剂为5％的异丙醇溶液)，柱温为40℃。

流动相的配备：称取CuSO₄·5H₂O 0.50g，加50mL双蒸水溶解，转移置1000mL的容量瓶中，加入50mL的色谱纯异丙醇，再用双蒸水定容至1000mL，用0.45μm孔径的合成纤维素酯膜进行真空超滤，超声波脱气。

样品预处理方法：培养完成后在121℃下灭菌20min，取1mL灭菌冷却后的发酵液于1.5mL的离心管当中，经8000r/min离心10min，除去菌体和其他杂质。取离心后的上清液0.1mL于1.5mL的离心管中，之后再加入1.1mL的硫酸铜流动相稀释12倍，震荡混匀后再次以8000r/min离心10min。之后用带有0.45μm滤头的注射器吸取0.6mL的上清液于样品管中，等待上样。

采用高效液相色谱法测定两款发酵混合果蔬汁饮料的有机酸含量，测定结果经线性回归，线性方程、线性范围、相关系数和方法检出限(以S/N＝3计)见表4。

表4 3种有机酸的线性方程、线性范围、相关系数及检出限

该活菌型发酵混合果蔬汁饮料中含有2.83g/L柠檬酸、4.8g/L苹果酸、2.60g/L乳酸。根据乳酸旋光性的不同可将其分为D-乳酸和L-乳酸，但是人体只含有分解L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，而研究表明摄入较多D-乳酸可引起代谢紊乱甚至致病。因为世界卫生组织限定成人了D-乳酸的日摄入量(≤100mg/kg体重)，婴幼儿食品不得添加D-乳酸或DL-乳酸(金其荣.L-乳酸研究新进展[J].化工时刊.1997(07):31.)。因此，采取手性柱高效液相色谱法确定D-、L-乳酸的含量。该活菌型发酵混合果蔬汁饮料中D-乳酸含量为1.303g/L，L-乳酸含量为1.298g/L，比例大约1:1(如图3)，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸，因此根据WHO的规定，该活菌型发酵混合果蔬汁饮料正常成人一天不得饮用超过20瓶(100mL/瓶)，婴幼儿不得饮用。

②抗氧化功能测定：参照徐贵华(徐贵华，张凤梅，张磊.果蔬食品体外抗氧化方法研究进展[J].食品研究与开发.2010(11):215-219.)具体抗氧化能力还进行如下修正：

清除DPPH自由基能力的测定：用2mL无水乙醇加入2mL蒸馏水调零，2mL的DPPH溶液加入2mL无水乙醇进行对照。样品原液2mL加入2mL DPPH无水乙醇溶液(0.2mmol/L)，振荡摇匀，在黑暗室温下放置30min后，于517nm处测定吸光值(OD值)。以抑制率表达自由基清除能力，抑制率＝[(空白OD-样品OD)/空白OD]×100％。

清除ABTS能力的测定：将5mL的7mmol/L ABTS和89μL 140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜放置12h～16h，形成ABTS⁺储备液。取30μL样品，加入3mL稀释后的ABTS⁺溶液，在室温下反应6min，于734nm处测定吸光度值。以水溶性维生素E建立标准曲线，样品抗氧化能力以TEAC表示，即每升果汁清除自由基能力相当于水溶性维生素E清除同等自由基能力的毫摩尔数。

螯合二价铁离子能力的测定：样品原液3mL加入50μL的FeCl₂溶液(2mmol/L)混匀，室温条件下静置30s加入100μL的菲咯嗪溶液(5mmol/L)混合均匀，在室温下反应20min，于562nm波长测定吸光度值。

螯合Fe²⁺能力的计算公式：螯合Fe²⁺能力(％)＝[1-(A₂-A₁)/A₀]×100％式中：A₀为用水做空白对照的吸光度值，A₁为无菲咯嗪时样品的吸光度值，A₂为样品的吸光度。该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的DPPH自由基清除率为41.2％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.027mmol/L水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为18.2％。

③常温条件下货架期研究：对于活菌型发酵混合果蔬汁饮料，从pH值、酸度以及活菌数变化研究植物乳杆菌DMDL9010发酵木瓜和胡萝卜混合果蔬汁饮料在冷藏期间的货架期。冷藏条件下活菌型发酵混合果蔬汁饮料的pH值变化如图4所示。在经过28天活菌型发酵混合果蔬汁饮料的pH值由3.38下降至3.20。在冷藏第1周，pH值下降较为明显，而后3周的数值变化不大。主要是由于第1周内植物乳杆菌活力更强，植物乳杆菌可利用的残留蔗糖量较多因而可继续产酸，造成pH有所下降，最终维持在3.20左右。图5所示为该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的乳酸含量变化情况，经过28天乳酸含量从2.60g/L上升到3.32g/L。在冷藏期间植物乳杆菌持续利用残余糖进行发酵产酸。随冷藏天数增加，乳酸含量先增加而后趋于平稳，第1周内增长明显，而后3周趋于稳定。主要是由于第1周内植物乳杆菌活力更强，可利用的残留蔗糖量较多，而后期残留蔗糖量降低且菌体由于乳酸量增高而发酵停止，因此后续乳酸含量趋于稳定直至最后达到3.32g/L。冷藏期间内pH值和酸度的变化不大。如图6为冷藏条件下活菌型发酵混合果蔬汁饮料的活菌数变化。经过28d的冷藏，植物乳杆菌的活菌数有所下降从初始3.5×10⁹cfu/mL减少到1.14×10⁹cfu/mL，减少了3倍。冷藏期间前2周内，活菌数下降明显，从第3周开始基本不变。其最终活菌数仍能保持在1.14×10⁹cfu/mL。终产品的活菌数仍大于10⁶cfu/m L，符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

实施例2

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按2:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为50％，蔗糖的含量为5％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：93℃加热11min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为7％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在40℃发酵12h后，再经过无菌灌装、冷藏，即得活菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.51g/L，pH为3.42，活菌数达到2.8×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

所述植物乳杆菌DMDL 9010活化液为：将植物乳杆菌DMDL 9010接入MRS肉汤培养基内，经2次传代培养，pH值达到5.8，菌种达到正常活力时贮藏于1℃。

(1)感官指标检测

表5本例中感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：143°T。

②可溶性固形物含量：9％。

(3)卫生指标检测：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003，其中活菌数达到2.8×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料中含有2.74g/L柠檬酸、4.36g/L苹果酸、2.51g/L乳酸。其中D-乳酸含量为1.255g/L，L-乳酸含量为1.246g/L，比例约为1:1。

②抗氧化功能测定：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料DPPH自由基清除率为37.6％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.034mmol/L的水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为16.9％。

③常温条件下货架期研究：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的货架期达到28d以上。

实施例3

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按4:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为70％，蔗糖的含量为15％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：96℃加热15min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为8％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在28℃发酵22h后，经过无菌灌装、冷藏，即得活菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.63g/L，pH为3.35，活菌数达到3.3×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

所述植物乳杆菌DMDL 9010活化液：将植物乳杆菌DMDL 9010接入MRS肉汤培养基内，经2次传代培养培养，pH值达到6.2，菌种达到正常活力时贮藏于4℃。

(1)感官指标检测

表6本例中感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：152°T。

②可溶性固形物含量：12％。

(3)卫生指标检测：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003，其中活菌数达到3.3×10⁹cfu/mL，远远大于GB 16321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》对活菌检出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料中含有2.87g/L柠檬酸、4.69g/L苹果酸、2.63g/L乳酸。其中D-乳酸含量为1.317g/L，L-乳酸含量为1.314g/L，比例约为1:1。

②抗氧化功能测定：该活菌型发酵混合果蔬汁饮料的DPPH自由基清除率为40.5％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.018mmol/L的水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为17.6％。

③常温条件下货架期研究：该活菌型发酵混合果蔬汁的货架期达到28d以上。

实施例4

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按3:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为60％，蔗糖的含量为10％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：93℃加热11min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为7％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在34℃发酵16h后，将发酵后的混合果蔬汁饮料过滤和灭菌后，再经过无菌灌装，即得灭菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.25g/L，pH为3.41。

本例中灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的最佳发酵工艺是通过正交实验优化而得。采用三因素三水平的正交试验(表7)以产酸量和pH为指标，确定灭菌型发酵混合果蔬汁饮料最佳发酵工艺参数。

表7本例中三因素三水平正交试验表

从表8的极差R可知，从乳酸含量看，C＞A＞B，发酵时间C对乳酸产生量影响最大，而接种量B影响最小。根据pH的结果可知，C＞B＞A，与乳酸产相同，发酵时间C对pH影响最大，但是发酵时间C、接种量B、发酵温度A三者对pH的影响差异并不显著。此处灭菌型发酵混合果蔬汁饮料中影响乳酸含量及pH最大的因素与活菌型相同。根据各组产酸情况可知，选取的温度范围对于植物乳杆菌发酵混合果蔬汁饮料是较为合适的，其中产酸最高的是5号试验，其在34℃条件下接种7％的植物乳杆菌DMDL 9010发酵16h后，产酸量达到2.25g/L，pH下降至3.41，口感舒适。因此可以确定灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的最佳发酵参数为34℃，接种量7％，发酵时间16h。

表8本实施例中正交试验结果

所述植物乳杆菌DMDL9010的活化：采用MRS肉汤培养基分装于试管内121℃，15min灭菌制成培养基，将植物乳杆菌DMDL 9010按1∶9接入培养基内，经1次传代培养，pH值达到6.0，菌种达到正常活力时将制好的发酵剂保存在0℃条件下备用。

(1)感官指标检测：同实施例1。如下表9为该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的感官检测结果。由于灭菌型发酵混合果蔬汁饮料经受93℃，11min的灭菌过程，该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的最终得分为95分，属于较优产品。

表9本实施例中感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：同实施例1。该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的酸度为130°T。

②可溶性固形物含量：同实施例1。该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的可溶性固形物含量为8％。

(3)卫生指标检测：同实施例1。

表10本实施例中卫生指标

该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：同实施例1。该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料中含有3.24g/L柠檬酸、4.4g/L苹果酸、2.25g/L乳酸。其中D-乳酸含量为1.151g/L，L-乳酸含量为1.101g/L，比例约为1:1(如图7所示)，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸，因此根据WHO的规定，正常成人一天不得饮用超过20瓶(100mL/瓶)，婴幼儿不得饮用。

②抗氧化功能测定：同实施例1。该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的DPPH自由基清除率为27.2％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.035mmol/L的水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为14.9％

③常温条件下货架期研究：该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料常温条件下pH和乳酸含量变化分别如图8和9所示。在观察3个月内，pH基本不变并保持在初始值3.40左右，乳酸值有略微下降，保持在2.25g/L左右。故其保质期可达到3个月以上，符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

实施例5

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按2:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为50％，蔗糖的含量为5％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：90℃加热7min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为6％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在28℃发酵22h后，经过滤和灭菌后，再经过无菌灌装，即得灭菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.19g/L，pH为3.47。

所述植物乳杆菌DMDL9010活化液：将植物乳杆菌DMDL 9010接种于MRS肉汤培养基内，经2次传代培养，pH值达到5.8，菌种达到正常活力时贮藏于2℃。

(1)感官指标检测

表11本实施例中感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：128°T。

②可溶性固形物含量：9％。

(3)卫生指标检测：该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：该灭菌型发酵果蔬汁饮料中含有3.06g/L柠檬酸、3.9g/L苹果酸、2.18g/L乳酸。其中D-乳酸含量为1.102g/L，L-乳酸含量为1.090g/L，比例约为1:1。

②抗氧化功能测定：该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的DPPH自由基清除率为26.4％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.017mmol/L水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为13.8％

③常温条件下货架期研究：:该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料保质期可达到3个月以上，符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

实施例6

第一步混合果蔬汁饮料的制备：将切块后的木瓜和胡萝卜按4:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁饮料。所述混合果蔬汁饮料中木瓜和胡萝卜的总含量为70％，蔗糖的含量为15％，余量为水。

第二步混合果蔬汁饮料的加热杀菌：96℃加热15min。

第三步将灭菌后的混合果蔬汁饮料冷却后，再按体积百分比为8％接入植物乳杆菌DMDL 9010活化液，在40℃发酵12h后，将发酵后的混合果蔬汁饮料经过滤和灭菌后，再经过无菌灌装，即得灭菌型发酵混合果蔬汁饮料，其中乳酸含量为2.15g/L，pH为3.56。

所述植物乳杆菌DMDL9010活化液为：采用MRS肉汤培养基分装于试管内121℃，15min灭菌制成培养基，将植物乳杆菌DMDL 9010按1∶9接入培养基内，经1次传代培养，pH值达到6.2，菌种达到正常活力时将制好的发酵剂保存在4℃条件下。

(1)感官指标检测

表12本实施例的感官指标检测结果

(2)理化指标检测

①滴定酸度的测定：117°T。

②可溶性固形物含量：11％。

(3)卫生指标检测：该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。

(4)产品分析

①有机酸含量分析：该灭菌型发酵果蔬汁饮料中含有3.48g/L柠檬酸、4.16g/L苹果酸、2.15g/L乳酸。其中D-乳酸含量为1.124g/L，L-乳酸含量为1.025g/L，比例约为1:1，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸。

②抗氧化功能测定：该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的DPPH自由基清除率为26.9％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相当于1.033mmol/L水溶性维生素E清除同等自由基的能力，而螯合二价铁离子的螯合率为14.7％。

③常温条件下货架期研究：:该灭菌型发酵混合果蔬汁饮料的保质期可达到3个月以上，符合GB16321-2003关于乳酸菌饮料的规定。