本发明属于乳制品
技术领域：
，具体为一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法及制备出的发酵乳。
背景技术：
：发酵乳(酸乳)就是乳和乳制品在特征菌的作用下发酵而成的酸性凝乳状制品，该类产品在保质期内的特征菌必须大量存在，能继续存活且具有活性，现有技术中大多采用含有嗜热链球菌和保加利亚杆菌的发酵剂进行发酵，得到发酵乳，大多发酵乳只是作为一种保健品和奶制品，更具有治疗功能性的发酵乳在市场上属于空白。技术实现要素：为解决现有技术中功能性发酵乳在市场上属于空白的缺陷，本发明提供了一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法及制备出的发酵乳，实现的目的为弥补治疗功能性发酵乳在市场上的空白，丰富发酵乳的功能性，使之适合更广受众群体。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法，包括将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)的保藏编号为cgmccno.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106～2x107cfu/ml。该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。邮编：100101。进一步的，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％～10％。进一步的，所述发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。进一步的，所述发酵的温度为25℃～35℃，发酵的时间为3d～7d。本发明自然要求保护经过上述方法制备得到的发酵乳。所述发酵乳中含有对dpp-iv的半抑制浓度为ic50≤35mg/ml的dpp-iv抑制剂。进一步的，该发酵乳的剂型为粉状，制备该粉状发酵乳的方法为将该发酵乳冷冻干燥，制备得到发酵乳粉。进一步的，冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-25℃～-35℃，真空冷冻干燥的时间为16h～32h，真空冷冻干燥的真空度为10pa～30pa。本发明采用上述技术方案，包括以下有益效果：经本发明方法得到的发酵乳，能够延长人体内glp-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度，与现有技术相比，上述技术方案中的制备方法，首次采用多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062，以脱脂乳作为培养基进行发酵，制备得到具有二肽基肽酶-iv抑制活性发酵乳，与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062所制备的发酵乳对二肽基肽酶-iv的抑制活性更显著，并且稳定性较好。具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。实施例一：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法，包括将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106cfu/ml。所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％。所述发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm。所述发酵的温度为25℃，发酵的时间为3d。经上述制备出的发酵乳，含有对dpp-iv的半抑制浓度为ic50≤35mg/ml的dpp-iv抑制剂，可帮助ii型糖尿病患者降糖，还可以将该发酵乳冷冻干燥制成发酵乳粉，，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-27℃，真空冷冻干燥的时间为24h，真空冷冻干燥的真空度为10pa。采用冷冻干燥，将发酵乳制备成发酵乳粉，从而更便于消费者使用和运输，同时，冷冻干燥得到的发酵乳粉中的ddp-iv抑制剂对二肽基肽酶-iv抑制活性不会产生较大的变化。实施例二：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法，包括将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x107cfu/ml。所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为10％。所述发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为220rpm。所述发酵的温度为35℃，发酵的时间为7d。经上述制备出的发酵乳，含有对dpp-iv的半抑制浓度为ic50≤35mg/ml的dpp-iv抑制剂，可帮助ii型糖尿病患者降糖，还可以将该发酵乳冷冻干燥制成发酵乳粉，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-27℃，真空冷冻干燥的时间为30h，真空冷冻干燥的真空度为30pa。采用冷冻干燥，将发酵乳制备成发酵乳粉，从而更便于消费者使用和运输，同时，冷冻干燥得到的发酵乳粉中的ddp-iv抑制剂对二肽基肽酶-iv抑制活性不会产生较大的变化。实施例三：本发明提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法，包括将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为6x106cfu/ml。所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％。所述发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为150rpm。所述发酵的温度为30℃，发酵的时间为5d。经上述制备出的发酵乳，含有对dpp-iv的半抑制浓度为ic50≤35mg/ml的dpp-iv抑制剂，可帮助ii型糖尿病患者降糖，还可以将该发酵乳冷冻干燥制成发酵乳粉，，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-35℃，真空冷冻干燥的时间为20h，真空冷冻干燥的真空度为20pa。采用冷冻干燥，将发酵乳制备成发酵乳粉，从而更便于消费者使用和运输，同时，冷冻干燥得到的发酵乳粉中的ddp-iv抑制剂对二肽基肽酶-iv抑制活性不会产生较大的变化。各个实施例制备得到的发酵乳，可采用下述方法得到待检测液：将dpp-iv抑制剂溶于浓度为100mmol/l，ph8.0的tris-hcl缓冲溶液中，在室温下，10,000g离心10min，取上清，即可用于发酵乳中含有的二肽基肽酶-iv抑制活性的检测。二肽基肽酶-iv抑制剂的筛选模型：取25μl待测样品于1.0mlep(eppendorf)管，接着加入50μl，浓度为10mu/ml二肽基肽酶-iv(sigma，美国)，混匀，37℃温育15min，再加入25μl中含有0.8mmol/l的甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐(sigma，美国)，混匀，37℃反应30min，最后加入100μl，1mol/l，ph4.0醋酸钠缓冲溶液终止反应。在4℃、10,000rpm离心2min，取200μl上清于96孔微孔板(greinerbio-one，德国)，spectramaxm5多功能酶标仪(moleculardevices,美国)在405nm波长下，测定吸光度值。待测样品对二肽基肽酶-iv的抑制活性，如以下公式所示：其中：阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品；阴性空白组：浓度100mmol/l的三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(tris-hcl，ph＝8.0)替代阴性对照组中的二肽基肽酶-iv；样品空白组为tris-hcl替代待测样品组中的二肽基肽酶-iv。将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备出的发酵乳产品，采用上述方法测得的各组所得发酵乳对二肽基肽酶-iv的抑制效果如表1所示。表1.不同方法制备所得发酵乳的抑制效果从表1所示的结果中可以得出，将制备所述发酵乳产品的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度调整到优选范围之外的时候，多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062依然可以发酵脱脂乳产生二肽基肽酶-iv抑制剂，但是产物的二肽基肽酶-iv抑制效果明显下降。采用上述方法可重复数次平行试验，最终得到在本发明优选的发酵参数的范围之外时，多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062发酵脱脂乳，得到的二肽基肽酶-iv抑制剂的抑制效果明显下降。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的二肽基肽酶-iv抑制剂的活性低于优选的接种量范围；当接种量过多时，一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长，不利于代谢物的积累，也使得最终获得的二肽基肽酶-iv抑制剂的活性低于优选的接种量范围。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，菌种代谢缓慢，会导致二肽基肽酶-iv抑制剂的活性有所降低。还例如，发酵的振荡速度低于优选范围时，菌种发酵的溶氧量不够，生长和代谢受到限制，导致二肽基肽酶-iv抑制剂的活性降低。本发明得到的发酵乳对二肽基肽酶-iv半抑制浓度(ic50)的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对二肽基肽酶-iv的抑制率，根据浓度与二肽基肽酶-iv抑制率构成的线性关系，计算得出样品对二肽基肽酶-iv的半抑制浓度(ic50)。进过数次平行试验检测，得到本发明的发酵乳对dpp-iv的半抑制浓度ic50≤35mg/ml。效果实施例1：产品口味与喜好程度测试取上述实施例1-3所制备的发酵乳粉产品a、b、c溶解于温水中，得到浓度为100mg/ml的发酵乳溶液，以此为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述发酵乳粉产品a、b、c的色泽、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是25分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表2。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表3。表2.产品口味测试结果数据统计表发酵乳粉产品abc色泽232224风味232421口感212223营养242224总分919092表3.产品喜好程度测试结果数据统计表喜好程度abc喜欢443847良好472一般241不喜欢—1—从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，通过本发明技术方案中的方法所制得的具有二肽基肽酶-iv抑制活性的发酵乳粉在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。效果实施例1：冷藏条件下二肽基肽酶-iv抑制剂抑制效果的稳定性将实施例1-3制备的产品a、b、c分别装入密封袋后，置于冷藏条件(8℃)保存0、10、20和30d后取出，分别测定各样品对二肽基肽酶-iv的半抑制浓度ic50值，结果如表4所示。表4.冷藏条件下产品抑制效果的稳定性由表4可知，所有测试的二肽基肽酶-iv抑制剂产品在冷藏(8℃)保存30d后，对二肽基肽酶-iv抑制活性保持在同一水平，即稳定性较好。效果实施例2：参考实施例1所述方法，比较由多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062、干酪乳杆菌(l.casei)atcc393(购买自atcc)、保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)lb340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(s.thermophilus)st-body-3(由科汉森公司提供)制备的发酵乳对二肽基肽酶-iv的抑制效果，具体操作如下：1、材料与方法(a)种子(发酵菌种)的制备：干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌atcc393和保加利亚乳杆菌lb340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于mrs固体培养基(merck，德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mlmrs液体(merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mlmrs液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌st-body-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于m17固体培养基(merck，德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mlm17液体(merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mlm17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。(b)脱脂乳的制备：同实施例1。(c)待测样品制备：同实施例1。2、发酵乳及发酵乳粉的制备将各菌株以终浓度为8.0x106cfu/ml接种量无菌接种于8％(w/w)脱脂乳，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，多粘类芽孢杆菌30℃、220rpm振荡培养)4d，获得相应的发酵乳。将相应的发酵乳冷冻干燥制得相应的发酵乳粉。3、二肽基肽酶-iv抑制活性的测定上述不同菌株制备的发酵乳粉对二肽基肽酶-iv的半抑制浓度ic50如表5所示：表5不同菌株制备的发酵乳粉对二肽基肽酶-iv的半抑制浓度ic50由表5可知，其他常规脱脂乳发酵菌株发酵脱脂乳的产物不具有二肽基肽酶-iv的抑制活性，而多粘类芽孢杆菌cgmccno.10062制备的发酵乳粉对二肽基肽酶-iv的抑制活性非常显著。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12