专利名称：重组水蛭素口服肠溶缓释制剂的制作方法
从世界范围来看，血栓相关性疾病如脑卒中、冠心病、肺栓塞、脉管炎的发病率居高不下，在我国和某些发达国家已占死亡原因的第一位。虽然目前已有众多抗凝血的药物如肝素和阿斯匹林等，但其抗凝血机理均不是直接抑制凝血酶的活性。本发明的目的在于提供一种口服抗凝药物，其有效成分为水蛭素，它是迄今为止发现的效力最强的凝血酶直接抑制剂。水蛭素由医用吸血水蛭头部唾液腺提取纯化而得，含65-66个氨基酸的小肽，能特异地抑制凝血酶的活性。水蛭素可与凝血酶的催化位点和纤维蛋白原识别位点结合，抑制凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白而达到抗凝血功能；此外，还可使凝血酶诱导的血小板聚集功能受抑，使成纤维细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的激活受抑制，从而发挥特导性抗凝和抗栓作用。目前重组水蛭素在临床上均采用注射给药方式，已证明具有用量小，免疫原性弱，无明显毒副作用，不易通过血脑屏障，注射给药后大多数以原形从尿中排泄，其血药浓度和凝血功能指标相关性好，便于检测之优点，故在国外的抗凝治疗中已有取代肝素的趋势。由于天然水蛭素的来源有限，应用基因工程技术生产的重组水蛭素获得了极大的成功。重组水蛭素和天然水蛭素具有相同的生物活性，由酵母表达制备的重组水蛭素已由诺华公司和赫切斯特公司分别开发上市，用于治疗肝素引起的血小板减少症和接受关节置换术患者的术后治疗。
天然水蛭素是一个由多种变异体组成的家族，已发现的变异体达十余种，其中主要是HV1、HV2和HV3三型。应用蛋白工程技术和基因工程技术对水蛭素的改造，可获得水蛭素的突变体如HV1-HV2的杂交型，HV2-K47突变型等。以上各种水蛭素的变异体和突变体表达体系不仅在原核系统的大肠杆菌，在真核系统的酵母和昆虫中均有成功报道。重组水蛭素与天然水蛭素在结构上的最大差异在于其63位酪氨酸残基上无硫酯化，但相关资料认为有无硫酯化对水蛭素的抗凝血酶作用无影响。
早期研究发现水蛭唾液腺提取物口服给药后具有一定的抗凝效果，因此，用水蛭制成的中药口服胶囊已在临床上用于治疗瘀血症。后续研究发现，水蛭素对胃蛋白酶十分敏感，对胰蛋白酶有一定的抗性。水蛭素在酸性条件下不稳定，但对热稳定。用重组水蛭素水溶液在十二指肠给药的动物模型中证明，水蛭素可以由肠道粘膜吸收入血，但生物利用度低。大剂量的重组水蛭素溶液(5mg/kg)直接灌胃给药的动物实验显示能起到一定的抗凝血作用。国外专利报道用脂质体制成的重组水蛭素口服剂型在0.1-1.0mg/kg剂量范围内，在动物实验中有显著的抗血栓形成的作用。从而证明重组水蛭素可以由肠粘膜吸收进入血液，并起到一定的抗凝血功效。
本专利在综合考虑重组水蛭素的肠粘膜吸收特性和对胃肠蛋白敏感及低pH不稳定的因素基础上，发明了加入保护稳定剂如人血清白蛋白和甘露醇，加入胃肠蛋白酶抑制剂如抑肽酶的一种新型重组水蛭素肠溶缓释口服制剂。有关资料表明抑肽酶可广泛抑制多种胃肠道消化酶的蛋白水解作用，从而提高口服蛋白的生物利用度，现已成为蛋白质口服剂型中最常用的酶抑制剂。另该制剂的最大优点在于重组水蛭素在胃溶液中不被释放，因此能避开胃蛋白酶和胃酸的降解作用；加入蛋白质的稳定剂和酶抑制剂，使重组水蛭素在肠液中缓释后抵制消化道蛋白酶的降解作用。从而有效地提高其肠道吸收的生物利用度，起到显著的抗凝血功能。由于重组水蛭素的热稳定性，将其按实例中的方法制备成的肠溶缓释剂型有很好的稳定性。因此，本发明的重组水蛭素口服肠吸收缓释制型具有性质稳定，口服方便、生物利用度好和抗凝血、抗血栓的功效。
药物口服制剂有多种，其中肠溶和肠吸收制剂主要在于主药成份应于肠道中释放并吸收。通过添加各种相应的剂型辅料包括成形剂、粘合剂、骨架剂等，制成临床上常用的片剂或胶囊。随着剂型的发展，普通释放制剂已发展到缓释，控释制剂阶段。这方面的技术已相当成熟，并得到了临床的广泛应用。本发明的重组水蛭素口服肠溶缓释制剂主要指按缓释方法制备成的片剂或胶囊，经动物实验证明有良好的抗凝血和抗血栓形成的功效。发明实例一、重组水蛭素的制备重组水蛭素HV1变异体65个氨基酸序列为ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln，重组水蛭素HV2-K47突变体(HV2型突变体47位氨基酸变异为赖氨酸)65个氨基酸序列为IleThrTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCysGlyLysGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAsnGlyLysGlyAsnGlnCysValThrGlyGluGlyThrProLysProGluSerHisAsnAsnGl
yAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln两种重组水蛭素相对应的CDNA序列由人工合成，嵌入毕节酵母分泌型表达质粒PIC9k的XhoI和EcoRI中，重组质粒筛选后分别命名为PIC-HV1和PIC-K47。转化毕节酵母宿主菌GS115，表达筛选相应的工程菌标示为GS-HV1和GS-K47。表达筛选用标准的抗凝血酶活性测定的Chromozym T方法。两种表达重组水蛭素HV1和HV2-K47工程菌经发酵，纯化得到纯度大于95％，N末端氨基酸序列分析与理论设计值完全一致。其中重组水蛭素HV1比活性为14000ATU/mg，重组水蛭素HV2-K47比活性为15500ATU/mg。二、重组水蛭素口服肠溶包衣缓释片的制备重组水蛭素HV1溶液用Lowry法测定蛋白浓度后，按1克中加20克甘露醇，2.5克人血清白蛋白，0.5克抑肽酶后过滤冻干成白色干粉。按以下组分取量按以下组分取量重组水蛭素HV1 1g 主药人血清白蛋白 2.5g 保护剂抑肽酶 0.5g 稳定剂甘露醇 20g 保护剂微晶纤维素 150g 粘合剂羟丙基甲基纤维素 125g 缓释骨架材料a-乳糖 150g 稀释剂硬脂酸镁5g 润滑剂将重组水蛭素、人血清白蛋白、抑肽酶、甘露醇、a-乳糖、微晶纤维素和羟丙基甲基纤维素干法混匀，以水润湿制软材，过16目筛制粒，经真空减压干燥后过14目筛整粒，再加入硬脂酸镁压片得片心。片心重量280mg，含重组水蛭素HV1 0.5mg，共2000片。肠溶包衣按以下组分取量聚丙烯酸II号树脂17.2gIII号树脂 17.2g85％乙醇26.6ml钛白粉8.6g吐温804.3ml蓖麻油13ml柠檬黄0.5g滑石粉8.6g将II、III号树脂置于容器中，加95％乙醇搅拌，使其完全湿润，放置12-24小时使其完全溶解，再加入其它成分制成混悬液，将片心加热到35℃左右，喷上包衣后干燥。每片包衣膜重量为4mg。
按本法可同样制备肠溶包衣释缓重组水蛭素HV2-K47片剂。三、重组水蛭素口服肠溶缓释胶囊的制备重组水蛭素HV2-k47溶液用Lowry法测定蛋白浓度后，按1g中加20g甘露醇，2.5g人血清白蛋白，0.5g抑肽酶后过滤冻干成白色干粉。按以下组分取量重组水蛭素HV2-k47 1g 主药人血清白蛋白25g保护剂抑肽酶 0.5g 稳定剂甘露醇 20g保护剂蔗糖115g 丸芯淀粉115g 丸芯聚乙烯吡咯烷酮 10g粘合剂乙基纤维素 24.9g 包衣材料羟丙基纤维素8.3g 包衣材料丙醇3.3ml 溶剂乙醇660ml 溶剂取30-40目空白丸芯240g(蔗糖115g，淀粉115g，聚乙烯吡咯烷酮10g)置旋转包衣锅内，将重组水蛭素、甘露醇、抑肽酶、白蛋白冻干粉溶于水，喷雾至空白丸芯上干燥，直至制得重组水蛭素含量为3％的小丸，再用乙基纤维素和羟丙基纤维素和含丙醇的乙醇溶液喷雾包衣至增重10％，干燥过筛后取20-30目小丸装入不透明的2号肠溶空白胶囊中即得。每粒胶囊装量为250mg，含重组水蛭素HV2-k47 0.5mg，共2000粒。按本法同样可制备肠溶缓释重组水蛭素HV1胶囊。四.重组水蛭素口服肠溶缓释胶囊预防给药对新西兰家兔颈静脉血栓形成的抑制作用新西兰家兔45只，体重2.5kg左右，随机分为7组对照组为不含重组水蛭素的相同肠溶缓释胶囊。口服缓释胶囊HV1和HV2-K47分别为100、250、500ATU/kg 3个剂量组。
家兔实验前禁食12小时，不禁水。按以上剂量给药后1小时麻醉家兔，分离局部颈静脉，置入3cm长的棉线，并在该段静脉的远心端和近心端用带套管的血管夹夹闭，30分钟后去除两端的血管夹以恢复血流。90分钟后从静脉内取出附有血栓的棉线，80℃加热1小时烘干并称重。计算血栓形成抑制率，结果如下重组水蛭素口服肠溶缓释胶囊对新西兰家兔颈静脉血栓形成的影响组别 剂量(ATU/kg)血栓重量(mg)血栓形成抑制率(％)对照组 0 34.5-缓释胶囊 HV1 100 28.417.7250 17.748.7500 7.8 77.4HV2-K47 100 27.520.3250 15.944.0500 8.5 75.4五.重组水蛭素口服肠溶缓释胶囊对大鼠的抗凝作用。
大鼠50只，体重150-200克，随机分成8组，对照组为不含重组水蛭素的同样肠溶缓释胶囊，实验组为重组水蛭素HV1和HV2-K47各三个剂量组分别100ATU/kg、250ATU/kg、500ATU/kg。口服灌胃每日二次，连续给药三天。分别于给药前，给药后3大和停约后1天测定血清中ATPP值。重组水蛭素口服肠溶缓释胶囊对大鼠凝血功能的影响APTT值剂量 增加增加组别 0天 给药后3天停药后1天(ATU/kg)(％)(％)对照组 0 18.7 17.818.2缓释胶囊HV1 100 24.1 35.4 20.1 10.4250 31.8 78.6 25.3 39.0500 38.2 114.6 30.1 65.3HV2-K47 100 24.9 39.9 20.9 14.8250 35.2 97.2 26.2 43.9500 41.3 132.0 30.9 69.8以上实验结果证明给大鼠口服肠溶缓释重组水蛭素胶囊后对凝血功能有显著改善。其中重组水蛭素HV1和HV2-K47对APTT的延长作用一致。
权利要求
1.本发明是一种含重组水蛭素的抗凝药物制剂，其特征为经口服后肠溶缓释吸收。
2.权利要求1所述的重组水蛭素，包括重组水蛭素的各种变异体和突变体。
3.权利要求1.2所述的重组水蛭素口服肠溶缓释剂型，其特征组成为重组水蛭素每1mg中含有甘露醇10mg，人血清白蛋白2.5mg，抑肽酶0.5mg。
4.权利要求3中人血清白蛋白为稳定保护剂，其范围为重组水蛭素质量的2-5倍，抑肽酶为蛋白酶抑制剂，其范围为重组水蛭素质量的0.2-1.0倍。
5.权利要求3，4中重组水蛭素肠溶缓释剂型，其特征为加入相应的剂型辅料制成的肠溶包衣缓释片剂或胶囊。
全文摘要
本发明涉及重组水蛭素(hirudin)口服肠溶缓释制剂的组分、制备和应用范围，经动物试验证实，该类制剂口服给药对家兔颈静脉血栓形成有明显的抑制作用，对大鼠外周血有显著的抗凝功能。该制剂能有效防止胃肠蛋白酶对重组水蛭素的降解作用，适用于有血栓形成倾向患者的抗凝治疗。
文档编号A61P9/10GK1428173SQ0113377
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者范开, 黄洪涛, 张益 , 王建 申请人:重庆富进生物医药有限公司