专利名称：水蛭素的重组体制备方法
技术领域：
本发明涉及水蛭素，其最初从药用水蛭(Hirudo medibin alis)中分离，以及其衍生物的制备。
最常用的抗凝血肽可能属于水蛭素类。水蛭素最初从药用水蛭中分离，药用水蛭(Hirudo medicinalis)为众所周知的，代表性的凝血酶多肽抑制剂1，2，具体说，其通过离子间作用结合凝血酶而防止了纤维蛋白原断裂成为纤维蛋白形成纤维蛋白块。动物试验证实了水蛭素的预防静脉血栓形成，血管分路闭塞及凝血酶诱导的弥漫性血管内凝血(DIC)的作用。另外，水蛭素具有低毒性，很少或无抗原性并且在血液中清除的时间很短。
已知有三种水蛭素的天然变种，被称作HVI的第一个变种的序列由Dodt等人测定(FEBS 165(1984)180-184根据三联密码(Eur.J.Biochem.138，9-37，1984)HVI的序列为
( 缬-缬-酪-苏-天冬-半胱-苏-谷-丝-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-丝-天冬酰胺-缬-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-赖-半胱-异亮-亮-甘-丝-天冬-甘-谷-赖-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-缬-苏-甘-谷-甘-脯-谷氨酰胺-丝-组-天冬酰胺-天冬-甘-天冬-苯丙-谷-谷-异亮-脯-谷-谷-酪-亮-谷氨酰胺。
被称作HV2的第二个变种由Dodt等人叙述，(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 367(1986)803-811)HV2在下列方面与HVl不同异亮氨酸取代1位的缬氨酸，苏氨酸取代2位缬氨酸、赖氨酸取代24位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代33位的天冬氨酸、赖氨酸取代35位的谷氨酸，甘氨酸取代36位的赖氨酸，天冬酰胺取代47位的赖氨酸，谷氨酸取代49位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代53位的天冬氨酸。
被称作HV3的第三个变种被Harvey等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)1084-1088中叙述。HV3从1-32位与HV2相同。但在下列方面与HV1不同谷氨酰胺代替33位天冬氨酸，赖氨酸代替35位的谷氨酸，天冬氨酸代替36位的赖氨酸，谷氨酸胺代替53位的天冬氨酸，脯氨酸代替58位的谷氨酸，天冬氨酸代替62位的谷氨酸，丙氨酸代替63位的酪氨酸(SO3H)，天冬氨酸代替64位的亮氨酸，谷氨酸代替65位的谷氨酰胺。
现在发明了制备水蛭素及水蛭素样多肽的新方法，该方法首先根据编码水蛭素或水蛭素样多肽的核苷酸序列进行化学合成，再用重组生物体表达水蛭素或水蛭素样多肽，遗传修饰了的生物体的培养可生成所需的具有全部生物活性的产物。
同时，本发明提供了含有编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列的表达载体。本发明还提供了与适当的表达载体转换的宿主，还提供了编码水蛭素或水蛭素样多肽的合成DNA。编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA片段可以是单股或双股的。
水蛭素或水蛭素样多肽可在其中表达的宿主中通过与本发明的适当的表达载体转换进行制备，表达载体通常的制备程序是(a)化学合成编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA;
(b)将该DNA插入表达载体中。
通过本发明提供的转换的宿主，并在一定的条件下使水蛭素或水蛭素样多肽于其中表达，从而制备了水蛭素或水蛭素样多肽，分离出水蛭素或水蛭素样多肽，从而得到纯化的水蛭素或水蛭素样多肽。
本文所称的“水蛭素或水蛭素样多肽”指天然形式的水蛭素HV1，HV2和HV3及其衍生物，例如，通过氨基酸取代、缺失、插入、延伸、官能作用和化学修饰得到的。本发明还可用于具有抗凝活性的HV1，HV2或HV3的衍生物。
氨基酸序列HV1，HV2或HV3可被一或多个氨基酸取代，插入和/或缺失和/或在一端或另一端延伸进行修饰，含有该被修饰序列的衍生物必须仍具有抗凝活性。HV1，HV2或HV3的氨基酸序列与其衍生物的氨基酸序列之间同源程度一般为75%或更多，同源程度也可以是85%或更多，95%或更多。
例如，HV1，HV2或HV3序列的一或多个氨基酸残基可被被取代或缺失或插入一或多个氨基酸残基，原序列的物化特性可被保留。如电荷密度，亲脂/亲水性，大小和构型。根据单字母密码，竞争取代基为A代替G或相反;
V被A，L或G取代;
K被R取代;
S被T取代或相反;
E代替D或相反;
Q被N取代或相反涉及到延伸时，多达50个氨基酸残基的短序列可接于任一末端，该序列可含有多达30，例如多达20或多达10个氨基酸残基。
水蛭素或水蛭素样多肽可进行一种或多种相译后修饰，如糖基化，硫酸化、羧基-酰胺化，酰化，或多肽链的化学变化。例如63位的酪氨酸残基可硫酸化。本发明得到的重组体水蛭素或水蛭素样多肽不象天然的HV1，HV2和HV3，通常不在此位置硫酸化，本发明还可用于制备低分子量衍生物，该衍生物无HV1，HV2或HV3的N-末端或C-末端。
本发明特别适用于制备HV1和含有HV1的前46个残基并接有HV2变种的第47-65残基氨基酸序列的HV1的衍生物。
HV1缬-缬-酪-苏-天冬-半胱-苏-谷-丝-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-丝-天冬酰胺-缬-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天塑酰胺-赖-半胱-异亮-亮-甘-丝-天冬-甘-谷-赖-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-缬-苏-甘-谷-甘-苏-脯-赖-脯-谷氨酰胺-丝-组-天冬酰胺-天冬-甘-天冬-苯丙-谷-谷-异亮-脯-谷-谷-酪-异-谷氨酰胺杂交HV1/HV2(称为HV12)缬-缬-酪-苏-天冬-半胱-苏-谷-丝-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-丝-天冬酰胺-缬-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-赖-半胱-异亮-亮-甘-丝-天冬-甘-谷-赖-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-缬-苏-甘-苏-脯-天冬酰胺-脯-谷-丝-组-天冬酰胺-天冬酰胺-甘-天冬-苯丙-谷-谷-异亮-脯-谷-谷-苏-亮-谷氨酰胺。
划线的序列为HV2的部分。上述的多肽HV12及其衍生物构成了本发明的另一方面。
水蛭素和水蛭素样多肽通过重组DNA技术制备。制备编码水蛭素或水蛭素样多肽的合成DNA，DNA编码序列通常不包括内含子。合成基因被插入到能使重组产物生成的表达载体中。合成基因通常通过化学合成寡核苷酸制备，其与所需的基因一致，随后将寡核苷酸组装到基因中去。
基因由四种化学合成的寡核苷酸构成，每种寡核苷酸代表双股DNA基因中的二分之一股。寡核苷酸络合并重结晶得到所需基因。如需要，基因序列可经定位诱变进行修饰引入一或多个密码子的变化，具体讲，基因形成时每端均有限定部位以便于随之进行处理。
编码HV1的优选DNA序列列于附图的
图1中。编码HV12的优选DNA序列列于图3中，任一序列均可修饰以便编码衍生物。
制备可编码先导肽的DNA序列，该先导肽可引导从水蛭素或水蛭素样多肽所表达的细胞中分泌水蛭素或水蛭素样多肽。编码先导肽的序列通常与编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列的5′端融合。
当先导肽在细菌宿主中表达时，如大肠杆菌，优选OmpA先导肽。当先导肽在昆虫细胞中表达时，优选水泡性口炎病毒G蛋白(VSV G蛋白)先导肽。适于编码OmpA和VSV G蛋白先导序列的DNA序列分别列于图5和图8中。
还可制备编码融合蛋白的DNA序列，该融合蛋白可断裂释放水蛭素或水蛭素样多肽。还可使用编码载体多肽序列的DNA序列。该载体多肽序列通过可断裂的键与水蛭素或水蛭素样多肽的N-末端融合，可断裂的键可以是被溴化氰断裂的键。
为表达水蛭素或水蛭素样多肽，制备表达载体，其包括编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列。同时，当提供适宜的宿主时，其可表达水蛭素或水蛭素样多肽，并提供了适宜的转录和翻译控制因子，包括DNA序列的启动基因，转录终止定位，及翻译起始和终止密码子，在适当的框架中提供DNA序列以便于多肽在与载体相容的宿主中表达。
表达载体通常含有复制原形，如需要还含有可选择的标记基因如抗生素的抗性基因。启动基因与编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列相连。表达载体可以是质粒。在这种情况下，从ptrp和plcc/lac启动子中选择的启动子优选与DNA序列连接，而表达载体可以是病毒。该病毒可以是重组杆状病毒，在该病毒中，多面体启动子与编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列相连。
可表达水蛭素或水蛭素样多肽的表达载体可经任何方便的形式制备。编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA片段可以插入到表达载体如质粒载体的适当的限定位置。重组杆状病毒可按下列方法制备(ⅰ)在多面体启动子下侧的限定位置将编码水蛭素或水蛭素样多肽的基因进行克隆繁殖使成杆状病毒转移载体;
(ⅱ)将可被杆状病毒感染的昆虫细胞与步骤(ⅰ)中的重组转移载体和完整的野生型杆状DNA进行共转染。
进行同级重组，得到含有水蛭素基因或编码多面体启动子下侧水蛭素样多肽的基因的重组杆状病毒。杆状病毒转移载体可以具有多面体ATG起始密码子下游区的单一克隆位点。随后被所得重组杆状病毒表达的产物可以是融合蛋白质，其中多面体蛋白质的N-末端与水蛭素或水蛭素样多肽的N-末端融合。如上指出，在融合接合处提供了可断裂键。
步骤(ⅱ)中所用的昆虫细胞为代表性的Spodoptera frugiperda细胞、野生型杆状病毒为代表性的Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)。
在适宜的宿主中提供编码水蛭素或水蛭素样多肽的表达载体。细胞用水蛭素或水蛭素样多肽基因转化，在该条件下得到转化的宿主，水蛭素或水蛭素样多肽在其中表达，将转化的细胞培养以进行表达。任何适用的宿主一载体均可使用。
转化的宿主可以是原核或真核宿主。也可使用细菌或酵母宿主。如大肠杆菌或啤酒菌，还可使用革兰氏阳性菌。优选的细菌宿主为大肠杆菌B类菌株，也可使用昆虫细胞，在该情况下，杆状病毒表达系统较适合。昆虫细胞为代表性的Spodopterafrugiperda细胞。作为另一种选择，哺乳类细胞系的细胞可被转化。突变动物，如非人哺乳类可被提供，使水蛭素或水蛭素样多肽在其中制备。表达的水蛭素或水蛭素样多肽可被分离并纯化。
本发明制备的水蛭素或水蛭素样多肽，与药用载体或赋形剂一起可用于药剂处方中。该处方一般用于静脉给药(在此情况下，载体通常为无菌生理盐水或纯度合格的水)。本发明制备的水蛭素或水蛭素样多肽为抗凝血酶，适于治疗血栓栓塞，如凝血，典型患者为人类。本发明的一项内容为，水蛭素或水蛭素样多肽与纤维蛋白溶酶原激活剂如组织纤维蛋白溶酶原激活剂合并给药。已发现本发明中制备的水蛭素或水蛭素样多肽与后者相容。
下列实施例用于说明本发明附图中图1表示编码大部分水蛭素HV1链的四种寡核苷酸的核苷酸序列。划线的序列表明BalⅠ位置，其用于进一步制备。图的下部表明四种寡聚物的组合。HindⅢ和PstⅠ位置可进行随后的处理。
图2表示中间质粒Ml3-HV1的制备图解，其为BalⅠ-BamBⅠ DNA片段进一步制备的起源。
图3表示编码大部分水蛭素HV12链的四种寡核苷酸的核苷酸序列，划线的序列表示BalⅠ位置，其用于进一步制备。图的下部表示四种寡聚物的组合。HindⅢ和PstⅠ位置可进行随后的处理。
图4表示中间质粒MB-HV12的制备图解。其为BalⅠ-BamHⅠ DNA片段进行所有进一步形成水蛭素的起源。
图5用图示新组合体M13S的形成，即OMP-HV1和OMP-HV12，其分别带有连接于OmpA先导肽的全部HV1基因和全部HV12基因，先导多肽序列下划二道线，而BalⅠ平头末端和HindⅢ粘性末端下划一道线。
图6用图示PFC-HV1和PFC-HV12的形成。其为在大肠杆菌中用于制备HV1和HV12的质粒。
图7表示在大杆杆菌中用于制备水蛭素的质粒POMP-HV1的总结构。使用传统的基因操作技术制备该新质粒，水蛭素基因是在杂交启动子plpp/lac的转录控制下，在此例中，OmpA先导肽引导水蛭素分泌到大肠杆菌的泡质中。
图8表示用于从昆虫细胞中分泌水蛭素的合成寡聚物的核苷酸序列和组合。下面划线的序列表示VSV G蛋白先导肽。
图9用图示新组合体M13，即VSV-HV12的形成，在这里全部基因与VSV蛋白先导肽相连。
图10用图示PAc-HV12的形成，其用做杆状病毒基因组的转移载体。PAcYM1为起始质粒，其广泛地用做转移到病毒的异种序列的受体。
图11表示编码水蛭素链前端的合成寡聚物的核苷酸序列和组合，下面划线者为编码附加蛋氨酸残基的ATG密码子。
图12用图示PAcFT1的形成，其用于细胞内水蛭素表达。
图13用图示新的转移质粒，即PAcFT1-HV1和PAcFT1-HV12，其分别载有连接于多面体的前18个氨基酸的全部HV1和HV12序列。这些质粒被用于将异种序列转移到杆状病毒基因组。
实施例1HV1和HV12基因的化学合成核苷酸编码序列按大肠杆菌优选的密码子设计。所设的BalⅠ限定位置靠近合成基因的5′端，以便在不同的表达载体中插入编码序列。确实，相同的合成基因可用于在细菌和昆虫细胞中表达。在昆虫细胞的情况下，改进方法生成分泌的或细胞质产物。
所有质粒DNA操作按Maniatis等人所述方法进行。
按下述方法合成并装配HV1基因。用自动DNA合成仪(实用生物系统)制备四种合成互补寡核苷酸，其序列见图1。酶磷酸化后，用DNA连接酶将四种寡聚物组合，将所得的双股序列插入M13噬菌体载体mp18中，得到图2中所示的重组质粒M13-HV1。为使水蛭素基因插入M13载体，HindⅢ和PstⅠ位置也加于合成寡聚物中。正确的核苷酸序列已被在单股噬菌体DNA上进行的桑格法证实。
重组质粒M13-HV1用做实施例中全部表达载体HV1基因的起源。
按同样的方法合成并装配HV12基因，用于装配基因的寡聚物列于图3中。寡聚物3和4与图1中的寡聚物3和4编码不同的氨基酸，得到图3中所示的重组质粒M13-HV12。
实施例2大肠杆菌细胞中水蛭素的表达和分泌。
为获得分泌至胞质重组产物，必须合成前蛋白形式的HV1和HV2分子，特别是称为“先导肽”的氨基酸序列，它必须存在于HV1或HV12的NH2端7.8，才能起到有效分泌的作用。该外加序列在体内的分泌中被特定的大肠杆菌先导肽酶断裂除去，得到正确的成熟序列9。
分泌系统的许多实例在文献中叙述10，11，其中，根据以前发表的大肠杆菌(Omp A)外膜蛋白的分泌信号选择体系，我们设计两个附加的编码OmpA先导肽的互补寡核苷酸，以负责充分翻译信使RNA的OmpA Shine-Dalgarno顺序为先导12，由图5所见，其顺序还包括编码前10个氨基酸的HV1基因的开头部分。BalⅠ位置使该合成片段与HV1编码序列的其余部分相连。而HindⅢ位置的上端使其与M13载体相连。因此该合成HindⅢ-BalⅠ片段连接于M13-HV1的BalⅠ-BamHⅠ段，并插入M13mp18，得到被称作Omp-HV1的新质粒。这种新质粒形成的图示亦见于图5中，从M13-HV12开始进行同样的处理得到OMP-HV12(图5)。
从OMP-HV1水蛭素基因切除HindⅢ-BamHⅠ间的负责编码OmpA Shine-Dalgarno和水蛭素编码序列后面的先导肽片段。现准备将该限定的片段插入适当的表达载体中，从理论上，可使用几种表达体系以便在细菌中得到高产量的异种蛋白，过去我们实验室成功地使用了这种基于启动子Ptrp的体系。但在选择这种启动子时，所给的多肽的表达水平不能预知，用启动子Ptrp进行水蛭素的表达以前从未有报道。
图6中的质粒PFC33已在文献中有介绍13。其带有氨苄青霉素的抗性和引导脱脂蛋白原Al表达的细菌启动子Ptrp。将带有HindⅢ和BamHⅠ的PFC33消化后，将带有抗生素抗性基因和启动子的大段HindⅢ-BamHⅠ片段分离并将其与编码水蛭素HV1或水蛭素衍生物HV12的OMP-HV1或OMP-HV12的HindⅢ-BamHⅠ片段连接。详细的形成过程见图6。我们分离出称作PFc-HV1和PFc-HV12的新质粒。其为在大肠杆菌中制备HV1和HV12的最终质粒。
本发明的主要目的是使用B型大肠杆菌菌株表达和分泌水蛭素及其衍生物至胞质。我们确实发现将质粒PFC-HV1插入大肠杆菌B型菌株，可得到高产量的水蛭素。有趣的是，不同的大肠杆菌菌株并不同样有效。看来，宿主的菌株类型是成功制备水蛭素的关键。
几种B型大肠杆菌菌株可用于制备水蛭素或水蛭素样多肽。优选的菌株为ATCC 12407，ATCC 11303，NCTC 10537。下面是NCTC 10537菌株与质粒PFC-HV1进行转化及转化细胞培养的实例。
用Mandel和Higa的氯化钙法制备NCTC 10537菌株的感受态细胞。约200μl该类细胞制品(1×109细胞/毫升)与2μl质粒DNA(近似浓度5μg/ml)进行转化。在含有100μg/ml氨苄青霉素的液体琼脂的平皿上选择转化细胞。用木牙签在含有相同抗生素的L-琼脂上给两个小菌落划线(每个划3道约1cm长的线)。在37℃培养12小时后，将菌线分段在10ml LB培养基(氨苄青霉素含量为150μg/ml)上培养。37℃过夜，以试验水蛭素的制备。第二天，培养物用含有相同浓度氨苄青霉素的M9培养基稀释(1∶100)。并在37℃培养6小时。
将20ml该培养物于4℃，以12000×g的转速离心10分钟。将菌粒重新分散于2ml的33mM的盐酸Tris缓冲液(PH8)中，加同体积的33mM EDTA溶液，和40%的蔗糖，将所得混合物于37℃温度和振摇条件下培养10分钟。离心后渗透的细胞再分散于2ml冷水中且冰浴冷却10分钟。离心分离所得的上清液，其为细菌细胞的胞质部分。
利用显色检测测定断裂合成底物的凝血酶活性的抑制率。我们测定到了胞浆中生成的水蛭素的抗凝血酶活性。这些样品中，水蛭素活性程度约为50μg/ml。而对照的胞浆中无此活性。在PFC-HV12的情况下，水蛭素变种HV12的产量为80μg/ml。
用类似的方法，用启动子PlPP/lac代替启动子Ptrp生成新的水蛭素表达/分泌质粒。这种被称作POMP-HV1的质粒列于图7。将这种质粒插入B型大肠杆菌菌株后，也得到高产量的活性水蛭素(40-80μg/ml)。我们使用Ghrayb等人所述的质粒PIN-Ⅲ-ompA 3做为制备POMP-HV1的起始质粒。培养条件及用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行表达诱导如前所述16。
实施例3从大肠杆菌所得重组HV1的抗凝活性利用活化的部分凝血致活酶时间(aPTT)试验和凝血酶时间(T.T.)试验检测水蛭素变种HV1的抗凝活性。两个试验均用自动血凝度计进行(ACL 300 Research，Instrumen-tation Laboratory，Milan，Italy)。
往正常人的柠檬酸盐血浆中，加入浓度递增的重组制备的水蛭素HV1。样品用自动血凝度计测定aPTT(活化的部分凝血致活酶时间)，和T.T.(凝血酶时间)，该测定通过往血浆中自动加入适当的试剂并记录血凝块形成速度而进行。aPTT用脑磷脂和氯化钙(自动APTT试剂，一般诊断用，USA)进行测定，T.T.用浓度为5IU/ml的人凝血酶(Fibrindex，血清诊断用，Milan，Italy)进行测定，试剂按厂家的说明制备，贮存和使用。
从aPTT和T.T.试验所得的凝血时间相对于重组蛋白的浓度绘图。在每项试验中，计算出人血浆凝血时间两倍的浓度。aPTT试验所得的数值为210ng/ml，T.T.试验的数值为90ng/ml。
实例4昆虫细胞中HV12的表达和分泌为使HV12从重组昆虫细胞中分泌HV12，必须将HV12编码序列与可被这些细胞识别的先导肽连接。我们使用了水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白
的先导肽。用这种序列在昆虫细胞中制备水蛭素或其衍生物以前从未有报道。与前述方法类似。制备了接于HV12基因前段之后的编码VSV G蛋白先导肽的合成DNA序列，该核苷酸序列列于图8中。在此例中，我们还提供了方便的限定部位(Hind Ⅲ，BamHⅠ和BalⅠ)，以便将HV12的其余部分与表达载体连接。
将合成HindⅢ-BalⅠ片段与携带HV12基因的M13-HV12的纯化的BalⅠ-BamHⅠ片段连接。并插入用HindⅢ和BamHⅠ切下的M13mp18中。生成新的被称作VSV-HV12质粒的过程在图9中表示。从VSV-HV12中切除携带HV12基因的BamHⅠ-BamHⅠ DNA片段。被携带的HV12基因与插入载体PAcYml18的VSV先导肽融合，见图10，所得质粒被称为PAC-HV12。
为在昆虫细胞中表达，VSV-HV12编码序列必须在多面体启动子的转录控制下转移到杆状病毒基因组。为此，我们将昆虫细胞与野生型杆状病毒DNA和转移载体PAc-HV12进行共转染。作为昆虫细胞，我们选择Spodoptera frugiperda细胞做宿主细胞。实验详述如下将S.frugiperda细胞用感染性的AcNPV DNA和代表着被Summer等人19的方法进行修饰了的重组转移载体的质粒DNA的混合物进行转染。将1mg病毒DNA与25-100μg质粒DNA混合，在有20mM HEPES缓冲液，PH7.5，1mM正磷酸氢二钠，5mM氯化钾，140mM氯化钠和10mM葡萄糖(总体积为1ml)存在下，用(终浓度)0.125M氯化钙溶液沉淀。
将DNA悬浮液在35mm的组织培养皿中的106个S.frugiperda单层细胞上进行培养。在室温下使其吸收其细胞1小时。随后用1ml培养液取代。于28℃培养3天后，收集上清液。并用于在S.frugiperda单层细胞中形成噬菌斑。利用光显微镜检查，根据无多面体现象可签定出含有重组病毒的噬菌斑。该噬菌斑中将病毒复原，将噬菌斑进一步纯化后用于制备多面体阴性病毒原种。
上述过程使我们能够在多面体启动子和VSV G蛋白先导肽的控制下分离出基因组携带HV12基因的重组杆状病毒。根据已建立的方法，我用这种病毒以10种感染的复合感染S.frugiperda细胞。按已发表的方法，在10%牛血清存在下，将被感染的细胞旋转培养或单层培养。在感染后不同的时间里，利用S-2238显色检测，测定上清液中抗凝血酶活性(ATU)。结果列于下表中
表水蛭素活性ATU/106细胞感染后时间0小时 24小时 48小时 72小时旋转培养 0.8 0.9 1.4 1.8单层培养 0.8 0.8 2.0 5.1实例5昆虫细胞质中HV1和HV12的表达水蛭素及其衍生物也可在S.frugiperda细胞的细胞质中制备和聚集。该方法由于使用了不分泌的病毒蛋白多面体的表达信号，得到的异种蛋白的收率较好。
我们要得到大量重组HV1和HV12所用的方法基于融合多肽的表达，在这里多面体的前18个氨基酸以框架与HV1或HV12的65个氨基酸连接，多面体NH2末端序列的存在使能产生高水平的表达20。另外，在多面体部分与HV1或HV12序列之间我们插入一个蛋氨酸残基，通过用CNBr(溴化氰)处理杂交蛋白可释出HV1或HV12部分。
与前述方法类似，我们制备了合成DNA片段，其可使M13-HV1或M13-HV12的BalⅠ-BamHⅠ片段与适合的转移载体相连。图11中所示的新的合成片段也包括BamHⅠ和BalⅠ位点以便进一步处理。
得到了不同的转移载体，PAcFT1，其携带着编码多面体前18个氨基酸的核苷酸序列(图12)。简言之，即PAcYM1 EcoRV-BamHⅠ片段被含有核苷酸-92到核苷酸+55的多面体基因序列的合成寡核苷酸取代。该序列后有一个BamHⅠ位点，根据图13中设计的路线可在该位点插入全面HV1或HV12编码序列。通过此制备过程，我们得到了被称作PAcFT1-HV1和PAcFT1-HV12的两个新质粒，其可用于将杂交基因转移到杆状病毒基因组。
按实例4得到重组杆状病毒。按标准方法进行S.frugip-erda细胞的感染，被感染昆虫细胞的培养导致融合蛋白的细胞质聚积，该杂交蛋白为重组HV1或HV12的起源，按几种文献方法可用CNBr(溴化氰)断裂杂交21，22。利用Olson等人的方法，使我们能得到正确多肽序列的HV1和HV12。这两个分子展示了其抗凝血酶活性。
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1.制备具有下列序列的HV12水蛭素样多肽的重组DNA方法。缬-缬-苏-天冬-半胱-苏-谷-丝-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-丝-天冬酰胺-缬-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-赖-半胱-异亮-亮-甘-丝-天冬-甘-谷-赖-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-缬-苏-甘-谷-甘-苏-脯-天冬酰胺-脯-谷-丝-组-天冬酰胺-天冬酰胺-甘-天冬-苯丙-谷-谷-异亮-脯-谷-谷-酪-亮-谷氨酰胺，该方法包括提供一个用相容的表达载体转化的宿主，所用的表达载体含有编码该HV12水蛭素样多肽的DNA序列。
2.权利要求1的方法，其中DNA序列还可编码一个先导肽，该先导肽能够引导水蛭素样多肽从水蛭素样多肽所表达的细胞中分泌出。
3.权利要求2的方法，其中先导肽为OmpA或VSV G蛋白先导肽。
4.权利要求1的方法，其中DNA序列编码的融合蛋白可断裂释放所述的水蛭素样多肽。
5.权利要求1的方法，表达载体为质粒。
6.权利要求5的方法，其中从Ptrp和Plpp/lac启动子中选出的启动子与前述的DNA序列相连。
7.权利要求1的方法，其中表达载体为病毒。
8.权利要求7的方法，其中病毒为重组杆状病毒。其中多面体启动子与前述的DNA序列相连。
9.权利要求1的方法，其中宿主为细菌。
10.权利要求9的方法，其中细菌为大肠杆菌B型菌株。
11.权利要求1的方法，其中宿主为从酵母，哺乳细胞系，昆虫细胞系和动物中选出的真核宿主。
12.权利要求11的方法，其中宿主为spodoptera frugiperda细胞系。
13.重组DNA制备水蛭素或水蛭素样多肽的方法，该方法包括提供用重组杆状病毒表达载体转化的spodoptera frugi-perda细胞系，该杆状病毒表达载体包括与编码水蛭素或水蛭素样多肽的DNA序列相连的多面体启动子。
14.权利要求13的方法，其中DNA序列还可编码一先导肽，该先导肽可引导水蛭素或水蛭素样多肽从spodoptera frugiperda细胞中分泌出来。
15.权利要求14的方法，其中先导肽为VSV G蛋白先导肽。
16.权利要求13到15的任一方法，其中水蛭素多肽为水蛭素HVl。
全文摘要
利用重组DNA的方法制备具有抗凝血酶活性的水蛭素或水蛭素样多肽。水蛭素或水蛭素样多肽优选在大肠杆菌或昆虫细胞中表达。
文档编号C12P21/02GK1057294SQ9110302
公开日1991年12月25日 申请日期1991年5月8日 优先权日1990年5月10日
发明者卢卡·本纳狄, 波罗·卡迈纳狄, 杰奎林·兰森, 盖伊·梅祖, 罗密欧·尤卡西亚, 波罗·萨盟汤斯, 伊曼纽拉·斯卡彻, 菲利普·迪·塔克西斯·杜·普特 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司