专利名称：抗肿瘤剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一类聚合物抗肿瘤剂，这类抗肿瘤剂能够形成高分子胶束复合物，具有选择性的肿瘤靶向能力，并能长时间滞留于肿瘤部位，因此增大抗肿瘤效果，以及减轻对正常器官和组织的副作用。
更详细而言，是关于蒽环霉素系或铂系衍生物低分子抗肿瘤剂与苯乙烯-马来酸共聚物(以下称为SMA)，通过分子间键合或相互作用而形成高分子胶束复合物的聚合型抗肿瘤剂。
本发明还涉及其制备方法。
背景技术：
1969年，由Di Macro等发现蒽环霉素系抗肿瘤剂的多柔比素(doxorubicin)(阿霉素……式(1))(Cancer Chemotherapy Reports，1部分，53，33-41，1969)，另外，于1979年，在新的蒽环霉素抗生素研究中，Umezawa等发现吡柔比星(THP阿霉素……式(2))。在4’-0取代的化合物中，THP阿霉素比其他的蒽环霉素抗肿瘤剂毒性低(“癌与化学疗法”15，2819-27，1988)。
已知蒽环霉素抗生素具有以多种作用机制杀死细胞的强力的细胞毒性效果。由蒽环霉素分子中的醌基产生氧自由基，促进DNA嵌入(intercalation)性质以及拓扑异构酶(topoisomerase)抑制机制。所有这些效果可导致有效地杀死癌细胞。吡柔比星虽为此类的新成员，但心脏毒性弱，活性比多柔比素更强，并具有独特的DNA及RNA合成抑制的作用。
然而可惜的是，这些低分子量抗肿瘤剂，例如蒽环霉素或顺铂等的细胞杀伤效果与其他多数者同样地对于癌细胞无特异性，因此，导致严重的副作用，尤其对于如骨髓细胞或消化道细胞等的分裂旺盛的细胞，该作用更为显著。另外，亦对于如心脏或肝脏组织等分裂速度慢或更稳定的组织，也有慢性伤害。这些负作用是限制这些强效药剂给药剂量增加的主要原因。
为除去这些抗肿瘤剂的副作用，药剂的组织内分布起到了决定性作用。关于此点，本发明的发明者等发现药剂分子量的大小是关键，即低分子量药剂，例如分子量为10Kda以下的药剂，依据单纯的扩散容易分布于多数正常器官组织及肿瘤组织，最后由肝脏除到胆汁中，或由肾脏排泄于尿中。对于分子量为543.5及627.6的多柔比素及吡柔比星，因容易分布于正常器官，例如心脏或骨髓组织，为达成完全治愈肿瘤而大量给药时，这些低分子量药剂，因副作用而给药量受到限制。
发明内容
发明所要解决的课题然而，高分子和低分子量药物之间毒性和效力截然不同，即本发明者等首先发现40KDa以上的高分子型药剂是选择性地聚集于肿瘤组织，滞留时间较长的独特现象，将此称为EPR(enhanced permeability and retention，通透性增强及滞留)效应(Cancer Res.，44，2115-2121，1984；ibid，46，6387-92，1986；Anticancer Res.，13；1287-1292，1993)。此现象是由高分子药剂与脂质微粒子在实体瘤中观察到的。
EPR现象是肿瘤组织中的解剖学上及病理生理学上的变化，基于例如由血管生成(Angiogenesis)引起的血管密度增加、实体瘤血管中的平滑肌肉层的缺损及淋巴恢复机态不全等。实体瘤的病态生理学上的变化是由于舒缓激肽、一氧化氮、前列腺素(prostaglandin)、基质金属蛋白酶(MMPs)、VEGF/VPF等血管介质(mediator)大幅地生产亢进，从而导致EPR的效果增强，而这种效果未见于正常组织(例如Cancer Res.，58，159-165，1995；J.Control.Release，74，47-61，2001；Advan.Enzyme Regul.，41；189-207，2001)。
早先本发明者等人开发了与蛋白质抗癌剂，新制癌菌素(NCS)共价连接得到的第一种聚合药物SMA[聚(苯乙烯-共-马来酸酐)半正丁酯]结合物，称为SMANCS(日本专利第1,549,302号、1,545,131号、2,556,865号及美国专利第5,389,366号)。这是世界上第一种聚合物型抗癌剂。
与原来的低分子量药剂相比较，SMA赋予独特的药理学上性质。亦即首先，与SMA的结合物与白蛋白快速地形成非共价键，由增加分子量发挥EPR效应，因此而赋予肿瘤嗜性，从而具有卓越的炎症部位的靶向能力。其次，具有免疫强化作用(immnopotentiation)(Oda T.等，Proc.Soc.Ex.Biol.Med.，181，9-17，1986.；Masuda E和H Maeda，Cancer Res.，1868-1873.1996)。
发明内容本发明人针对将具有强力的抗肿瘤效果，但对于正常器官及组织的副作用亦大的蒽环霉素抗肿瘤剂等，提高其于实体瘤的靶向能力，减轻副作用的方法。尝试将SMA聚合物与抗肿瘤剂结合时，获得独特的聚合型抗肿瘤剂；与由SMA与NCS仅以共价键聚合制备的SMANCES不同，这些药剂形成胶束型复合物，作为高分子运作，更加显著地发挥EPR效应，导致抗肿瘤效果改进，副作用更小，和在室温下更好的稳定性。
另外，蒽环霉素以外的药剂，例如顺铂，与SMA结合，形成聚合型胶束复合物，可得具有实体瘤靶向能力的聚合型抗肿瘤剂。
亦即，本发明涉及低分子抗肿瘤剂与SMA结合，形成聚合的胶束复合物的聚合型抗肿瘤剂。更优选本发明涉及聚合型抗肿瘤剂，它通过使吡柔比星或多柔比素等蒽环霉素抗肿瘤剂或顺铂与SMA结合，形成聚合的胶束复合物。
图1表示与SMA键合后的吡柔比星分子量增加的凝胶层析图。
图2表示与游离吡柔比星同一摩尔浓度下的SMA-吡柔比星复合物的荧光强度的差异。
图3表示水中及10％SDS(十二烷基硫酸钠)中SMA-吡柔比星复合物的荧光强度增加。
图4显示体外SMA-吡柔比星复合物在水相介质中的不同pH下和在乙醇中游离吡柔比星释放的时间过程。
图5显示体外游离吡柔比星及多柔比素及其SMA胶束复合物对于培养3天后的SW480人结肠癌细胞的细胞毒性效果。
图6表示各种剂量的SMA-吡柔比星及SMA-多柔比素，对于患有S-180小鼠肉瘤的ddY小鼠的体内抗肿瘤效果。
图7表示以SMA-吡柔比星及游离吡柔比星所治疗的小鼠的存活率。
图8表示SMA-吡柔比星对于患S-180小鼠肉瘤的ddY小鼠的生长抑制的效果。
图9是胶束形成后的顺铂分子量增加的凝胶层析图。
图10表示比较SMA-顺铂胶束复合物与游离顺铂相比对于培养3天后的人乳癌细胞的细胞毒性。
图11表示与SMA胶束化后的紫杉醇(taxol)分子量增加的凝胶层析图。图中A是SMA胶束化紫杉醇，B是游离紫杉醇，C是游离SMA。
图12表示游离紫杉醇、游离SMA及SMA-紫杉醇胶束复合物于水中及10％DSS溶液中的荧光强度变化。
具体实施例方式
本发明所使用的低分子抗肿瘤剂只要与SMA形成聚合胶束复合物即可，并无特别的限制，尤其以蒽环霉素抗肿瘤剂为宜。蒽环霉素抗肿瘤剂如式(1)及(2)所示，是具有7，8，9，10-四氢-5，12-萘省醌(naphthasenquinone)的糖苷结构的抗生素，例如吡柔比星、多柔比素、表柔比星、柔红比星及阿柔比星等，但以下述式(1)所示的多柔比素及式(2)所示的吡柔比星尤佳。
另外，式(3)所表示的顺式二胺二氯铂，通称为顺铂的抗肿瘤剂，这种重金属鳌合物，或喜树碱(camptothecine)、紫杉醇(taxol)等生物碱(alkaloid)亦可形成具有与SMA的胶束复合物结构的聚合型抗肿瘤剂。
本发明中作为聚合剂的SMA是由苯乙烯与马来酸共聚合所得。由于SMA是具有苯乙烯和马来酸作为不可分散成分的共聚物，它基本上具有如下述式(4)所示的苯乙烯单体单元，但马来酸单体单元亦可为如下述式(5)的由烷基或酰基部位半酯化者，或马来酸酐。(Maeda H.等，Med.Chem；28，455-61.1980) (式(5)中R是碳原子数为1至4的烷基或酰基，但作为本发明中所使用的SMA，可理想的使用半烷酯化的苯乙烯-马来酸共聚物，其中一部份R是丁基。)SMA依据聚合度存在各种分子量，但于本发明中作为聚合剂所使用的SMA是以三聚体(约660Da)至约40KDa大小者为宜。
至今开发了许多多柔比素复合物或结合物，但尚未报告用SMA作为新的聚合物载体或胶束形成物。如由SMANCS证明的，SMA作为聚合剂，比现在的聚合物具有下述各优点。
(1)以聚阴离子阴离子化，使在血浆浓缩液中半衰期大幅增长。
(2)复合物由于由苯乙烯基的亲脂性变为亲脂，因此可制备油脂性/口服药物。
(3)可以是亲水性也可以是亲脂性药物。
(4)具有白蛋白键合能力，因此在生物体内可以数万至数十万道尔顿的聚合物分子量起作用，因此更提升EPR效应。
(5)由于两亲性(amphipathic)，具有高胶束化能力。
(6)具有免疫活化能力。
(7)此胶束复合物的药剂负载能力极大。
(8)制造简单。
(9)可提高稳定性。
SMA还具有多个羧基基(例如每7个重复单位的聚合链约14个)，可用于与许多化合物的氨基或羟基的交联反应。本发明的SMA-蒽环霉素的聚合型药剂的其他优点是得到淋巴嗜性，对于抵抗淋巴性转移是有利的。亦即，观察到淋巴内分布高(H.Maeda等，Gann，73，278-284，1982)。
该苯乙烯和马来酸的共聚物具有理想的生物学性质，例如能于快速与白蛋白形成非共价键(Kobayashi等，J.Bioactive.Compat.Polymer，3，319-333，1988)，另外具有肿瘤嗜性(Maeda H.，Matsumura Y.，Cancer Res.，46，6387-6392，1986)及免疫增强性(0da T.等，Proc.Soc.Ex.Biol.Med.，181，9-17，1986)。
另外，由于具有两亲性的理化性质，苯乙烯及马来酸的存在使得使用SMA显著促进细胞吸收(Oda T.等，J.Nat.Cancer Inst.，79，1205-1211，1987)。
在与低分子药剂的反应中，SMA可为马来酰二羧基型、马来酸酐型、或马来酸酐的烷基或酰基半酯等衍生物。反应也可在醇解或水解后进行。
以蒽环霉素抗肿瘤剂为例，说明了低分子药剂与SMA反应制造高分子胶束复合物的方法。
将碱性水解的SMA与抗肿瘤剂溶解于水相溶液中，一边搅拌，于pH7以下，以pH2至5为宜，在混合物中加入水溶性碳二亚胺。通过蒽环霉素的氨基与SMA的羧基间的脱水反应，形成酰胺键、酯键、或离子键、氢键等的非共价键。
或在pH7以下，以pH2至5为宜，一边搅拌，使氨基酸或聚胺与混合物反应，亦可实现非共价键，例如离子键、氢键可使用L-精氨酸、L-鸟氨酸或赖氨酸为氨基酸，但以L-精氨酸为宜。作为聚胺则以精胺及亚精胺等为宜。
接着，为游离氨基的脱质子化，提升pH至8以上，以pH10至12为宜。最后以0.1M盐酸调节pH至6-8。其次，使用超滤和/或柱层析回收聚合物。在这些过程中，SMA胶束捕获低分子药剂，同时构型变化与分子间作用，如此而生成胶束形式。
如此地，本发明的聚合型抗肿瘤剂不须表面活性剂等用于胶束化的添加剂。在聚胺的存在下，仅使用抗肿瘤剂和SMA就可形成SMA-抗肿瘤剂胶束复合物的稳定胶束。因此，并不一定需要脱水缩合反应。这也是本发明的特征之一。
本发明的聚合型抗肿瘤剂是由低分子药剂与SMA(水解物)反应，形成聚合胶束复合物，从而将药剂捕获于胶束中。在某些情况下，药剂是由共价键、离子键或非离子键直接与SMA交联，然而不一定需要如此化学键合(与酰胺结构共价键合)。
如此所制造的SMA胶束复合物与原先的低分子量抗肿瘤剂相比，具有独特的药理学上性质。首先，它由于EPR效应而选择性地运送至肿瘤组织及长期间释放能力，从而能够在肿瘤组织中持续地维持药剂的高治疗浓度。其次，不损及心脏组织、骨髓、及肾脏等的正常的重要器官及组织的生理机能，可保持安全。
此效果在原先的低分子量抗肿瘤剂中不存在。其次，如后述的动物模型也确认高度的安全性。
本发明的该SMA-胶束复合物能与白蛋白、血纤维蛋白或脂蛋白等血浆蛋白结合，尤其对于白蛋白，能快速地形成非共价键。静脉注射本发明的上述药剂时，循环血液中的滞留时间大幅度地延长。
另外，赋予疏水性提供了剂型范围广泛的可能性，例如静脉注射用的水相制剂、经口给药或动脉内给药用的油性调剂，尤其油性碘(Lipiodol)化制剂等，可以各种方法使用。另外，如上所述，因具有负电荷，与半衰期极短的带正电的聚合物相比较，大幅度地延长生物体内的半衰期。
本发明的胶束复合物的表观分子量根据本发明的目的，适合10KDa以上，以50KDa以上者为宜。在此的表观分子量是指于水溶液中由分子相互间作用复合的分子量，以分子筛法、超滤法、超离心法或光散射法等测定。
在两种组分反应后，SMA与吡柔比星或多柔比素预计经历交联反应和构象变化，导致表观分子量大于10KDa。另外，观察到静脉注射后，基于对白蛋白的非共价键的生成，表观分子量更加增加。表观分子量的增加，结果是形成血液浓度曲线下面积(AUC)的增加。这意味着作用的持续时间延长，从而观察到EPR效应，肿瘤组织中的高药剂聚集，亦即，血浆的数倍程度，另外，诱导肿瘤聚集比正常组织亦明显地为高。其结果是全身性副作用减少而增加抗肿瘤效果。
实施例实施例1制造SMA-吡柔比星复合物(1)溶解10mg/ml的SMA于纯水，调节pH为12，于50℃下，加热4小时而得水解SMA。
(2)加入吡柔比星水溶液(10ml)于100ml的烧杯，使最终浓度为10mg/ml，于室温下，以磁棒搅拌混合。
(3)滴加0.01M的盐酸，调节混合物的pH为5之后，每隔2分钟，添加10mg/ml的乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDTA)(10ml总/终体积)，共10等份，再反应30分钟。生成着色沉淀物，将其离心分离或过滤收集。基于吡柔比星的产率为99％。
(4)将沉淀物以冷酸性水2次洗净(pH5.0以下)，溶解于水，调节成pH10后，降低至pH7。以透析管透析，以10KDa截留膜(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)超滤，然后浓缩成1/10体积。加入10倍体积蒸馏水，重复此步骤3次。接着，将浓缩物(5ml)，用Sephadex g-50 Fine(3×52cm)柱进行凝胶过滤层析，接着冻干。冻干后的产率为140mg基于SMA及吡柔比星重量为70％；基于吡柔比星重量为80％。
实施例2测定物理化学上及生化学上性质(1)凝胶层析法为表示与SMA复合反应后的分子量变化，使用Sephadex G-50Fine(PharmaciaLKB，Uppsala，Sweden)，进行凝胶过滤层析法。所用的柱体积为直径3×52cm，使用0.25M碳酸氢钠缓冲液(pH8.24)为移动相。每个组分体积为6.ml。结果如图1所示。SMA-复合物与游离的吡柔比星及游离的SMA相比较，分子量大得多。
(2)荧光光谱游离或未键合的蒽环霉素化合物以480nm激发时，显示在550nm和590nm具有强烈的荧光发射光谱。当分子与胶束或为脂质体形式的脂类胶囊接近相互作用时，该荧光大幅消失，因为能量转移到胶束、脂质体或脂类环境中的芳香族残基，导致荧光有效淬灭或受到抑制。如图2所示，SMA-吡柔比星复合物的荧光光谱与游离分子状态相比较，大幅消失。因此，消失的荧光光谱(强度)可用于证明吡柔比星进入胶束中，或与SMA的芳香族残基密切接触。
如图4所示，当胶束接触10％十二烷基硫酸钠(SDS)时，由于与SMA结合淬灭的荧光强度再生。该现象支持SMA胶束复合物通过非共价键形成。因SDS破坏蒽环霉素与SMA的疏水性苯乙烯残基的疏水性结合。亦即，如图3所示，SMA-吡柔比星或SMA-多柔比素结合物/复合物的荧光强度是与接触SDS溶液破坏胶束后的游离吡柔比星或多柔比素相当的。
与接触SDS溶液类似，胶束接触乙醇，能破坏SMA-药剂胶束的非共价键合，使得荧光强度与游离的药剂相同。
(3)由透析袋放出游离的药剂证明SMA-药剂复合物的表观高分子性质若形成如分子量达成10,000以上，优选50KDa以上的SMA-蒽环霉素胶束的高分子聚合物时，重要的是利用靶向肿瘤的EPR效应，最终放出游离药剂。为证明于生物体外，本发明的药剂复合物从胶束或聚合型结合物放出游离药剂，在5ml水中溶解20mg的SMA-多柔比素结合物，放入密闭的透析袋(分子量截留1,000；Spectrapor，Spectrum Laboratories Inc.CA.USA.)。将透析袋浸渍于25ml水中，用0.01M NaOH和0.1M HCl调节成pH7.4模仿循环血，或pH5.5模仿肿瘤组织，37℃下保温，放置于暗处数天。此状况下的游离药剂，亦即多柔比素或吡柔比星于数小时以内，渗出于透析管外。每隔预先所定的时间收集此透析管外侧所游离的吡柔比星或多柔比素，用480nm吸光度定量。结果如图4所示。
如图4所示，于此条件下的放出速度非常慢，每日约3％，低pH者较快，显示循环系统内胶束复合物的稳定性。当外侧溶液以乙醇取代时，放出速度极快，显示蒽环霉素与SMA的苯乙烯疏水基团之间的复合物的疏水性相互作用被破坏。此疏水环境更近似于依据内噬作用(endocytosis)，聚合物胶束进入癌细胞细胞质后的核内体(endosome)的状况。因此，此快速的药剂放出速度更可能是由于内噬作用进入细胞内后的酸性，较亲油性的肿瘤细胞内的环境。
(4)元素分析纯化后的SMA-吡柔比星复合物(分部沉淀、超滤及柱层析获得的)中的H.C.N.O的元素分析的结果证明胶束2个主要成份(SMA及多柔比素或吡柔比星)的组成百分比。该结果与测定480nm处吸光度的分光光度计数据一致。
实施例3体外(in vitro)的细胞毒性SMA-(多柔比素或吡柔比星)胶束复合物的体外细胞毒性，是使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四鎓溴化物(MTT试验)和人结肠癌SW480细胞及人子宫颈癌Hela细胞测定的。将这些细胞铺在96孔培养板(Falcon，Becton DickinsonLabware，NJ，USA)中，使细胞浓度为3000细胞/孔。细胞培养于95％的空气与5％的二氧化碳的环境下，于Dulbecco改良Eagle’s培养基(Gibco，Grand Island，N.y.U.S.A)中，加入10％胎牛血清培养一晚。SW480细胞及Hela细胞于天然多柔比素或吡柔比星或其SMA复合物的存在下，培养72小时。然后，用相对于未用药物处理的对照组的存活细胞分数定量细胞杀伤性(图5)。
如图5所示，SMA-吡柔比星在体外对于这些细胞系，与游离吡柔比星互相比较时，显示大约相同的细胞毒性效果(85至100％)。SMA-多柔比素胶束的细胞毒性活性是比游离多柔比素的低许多(约40％)。这是由于多柔比素的高疏水性，由胶束放出速度缓慢，从而延缓了游离药剂释放入培养液。结论是，SMA-蒽环霉素聚合物复合物与原先的游离药剂相当的潜在活性，或对于多柔比素，胶束体的活性比游离的药剂低。
实施例4生物体内的抗肿瘤效果使用6周龄的雄性ddY小鼠，将Sarcoma S180细胞(2×106细胞/小鼠)移植于其背部皮下。移植后7至10天后，肿瘤的直径达到5至7mm，但尚未发现坏死部份，开始依据所需浓度的多柔比素、吡柔比星或其SMA复合物的治疗。药剂溶解于蒸馏水，以预先决定时间表(参考图7)，由小鼠的尾静脉静脉给药。每2天测定肿瘤容积，监测肿瘤的成长。如图7所示，由SMA-吡柔比星复合物对于抑制肿瘤的成长是比多柔比素复合物大。
另外，接受SMA-吡柔比星及游离吡柔比星给药的小鼠的生存率如图7所示。
连续4次，接受SMA复合物与当量为20或40mg/kg体重的吡柔比星的小鼠的所有肿瘤完全消退。接受治疗的小鼠100％生存6个月以上而受到瞩目。另一方面，施用20或40mg/kg体重的原先的吡柔比星(施用与作为胶束复合物使用时相同量)的小鼠，全部因毒性而于1周内死亡(图7)。依据本发明的所有小鼠肿瘤的完全治愈是至今所报告的抗肿瘤剂尚未有过先例的。
实施例5小鼠中协同肿瘤模式与实施例4同样地使用免疫学上协同(immunlolgicaly syngeneic)的小鼠肿瘤模型，进行下述实验。所使用的肿瘤是来自结肠癌的Colon38腺癌。于C57BL小鼠背皮的两侧，移植每个位点约30mg的块状Colon38肿瘤细胞的肿瘤组织。于14日后，实体瘤成为可触知的大小约100mm时，用50mg/kg吡柔比星的单剂静脉给药而开始治疗。其结果是于2周的治疗期间，小鼠100％完全恢复，此等药剂作为抗肿瘤剂，显示具有可期待性。结果如图8所示。
实施例6SMA-吡柔比星及SMA-多柔比素胶束复合物的潜在副作用该研究使用患有直径约为5-7mm的肿瘤的S-180带癌小鼠于实验。静脉注射上述的多柔比素、吡柔比星或其SMA胶束复合物前与1，2及3周后的4周期间，每周进行全血分析。血液的生物化学包括测定静脉施用游离药剂或SMA-胶束复合物的36小时后的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)及总肌酸磷酸激酶(CPK)。
同时，心脏、脾脏、肝脏及肾脏组织用苏木精-曙红染色(H&Esraining)而进行细胞学上的组织毒性检查。胶束复合化药剂1周给药4次(25mg/kg×4)，每kg体重合计至100mg，或者1次施用至70mg/kg体重时并未显示毒性。接受胶束复合物药剂给药的小鼠的血球计数、心脏及肝脏机能与无治疗的对照组小鼠相同，无显著差异。
表1是表示接受10mg/kg的游离吡柔比星与20mg/kg的SMA-吡柔比星复合物(相当于20mg/kg的游离吡柔比星当量)的小鼠于静脉注射后至3周间的全血计数，以无治疗的对照组为对比。本发明的药剂的安全性是显著的，以此为治疗法是可期待的。
表1游离吡柔比星SMA吡柔比星复合物的血液学上的毒性
±标准偏差实施例7顺铂的分子量变化由SMA与顺铂，与实施例1同样地制造SMA-顺铂复合物，测定其分子量变化。
(1)凝胶过滤层析法使用Sephadex g-50 Fine(Pharmacia LKB，Uppsala，Sweden)在下列条件下进行凝胶层析移动相0.25M碳酸氢钠缓冲液(pH8.24)。
柱大小45×1.5cm各部分体积4ml测定SMA-顺铂复合物生成前后的分子量变化。
结果如图9所示。生成的SMA胶束复合物形成后分子量增加。
(2)由分子筛膜，测定膜渗透性用3kDa的分子筛膜，测定SMA顺铂复合物和游离顺铂的渗透性。结果如表2所示。
表2由最大3KDa膜超滤后的游离顺铂浓度
*游离顺铂的浓度是使用邻苯二胺比色分析，依据于720nm的吸收而定量。
实施例8SMA-顺铂胶束复合物与游离顺铂的细胞毒性使用人乳癌细胞，以与实施例3相同的方法，于SMA-顺铂胶束复合物(25μg/ml及50μg/ml)的试管内，培养72小时，游离顺铂及无添加药剂的结果均以生存细胞的比率作为细胞毒性的指标表示于图10。如图10所示，SMA-顺铂胶束复合物是相对于上述培养癌细胞，显示与游离顺铂大约相等的细胞毒性效果。
实施例9SMA-紫杉醇(taxol)胶束复合物(1)生成SMA-紫杉醇胶束复合物关于，(a)SMA+紫杉醇单独的混合物，以及(b)SMA+紫杉醇+EDAC(二甲胺基丙基碳化二亚胺)的混合物与生成SMA-吡柔比星胶束复合物的相同条件下反应，调查SMA-紫杉醇胶束复合物的生成。
上述(a)方法即使24小时后，仍显示不溶性的不透明至混浊状态，认为未生成胶束。然而，(b)方法则于6至12小时，成为透明，显示生成胶束。以此方法所得者未渗过10KDa截留超滤膜(UF-10)。
(2)凝胶层析法另外，将此SMA-吡柔比星胶束复合物，使用Sephadex G-50，与实施例2同样地调查分子量变化。
除使用0.2M碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.1)为移动相，柱尺寸是52×1.5cm，各部分体积为2ml以外，与实施例2相同的条件，进行柱过滤的结果是SMA-吡柔比星胶束以空隙体积洗脱；显示10KDa以上的大小。结果如图11所示。于图11的最上方，以箭号表示标准分子量物质位置者是BSA(牛血清白蛋白Bovine Serumalbumin)(67KDa)及酚红(354Da)。
(3)荧光光谱关于SMA-紫杉醇胶束复合物，进行与实施例2-(2)所进行的相同的荧光光谱分析。如图(12a)所示，表示游离紫杉醇在荧光光谱内525nm处有峰，但SMA-紫杉醇胶束复合物如图12(c)所示，没有峰。然而，当将胶束转移到15％的十二烷基硫酸钠(SDS)中时，荧光强度再次出现(图12(c)虚线)。由此显示，SMA与紫杉醇非共价键合而形成胶束复合物。另外，SMA本身于SDS中的荧光强度与水中的荧光强度几乎没有改变，此可证明SDS改变了SMA-紫杉醇的键合状态。
工业上利用性依据本发明，将抗肿瘤效果强，但对于肿瘤部位无选择聚集性，因此而对于正常器官及组织的副作用大的低分子量药剂，与SMA形成胶束复合物，作为聚合型抗肿瘤剂，发挥EPR效应，提升抗肿瘤效果，明显地减低对于正常器官及组织的副作用。
另外，本发明的稳定胶束复合物可仅由SMA、抗肿瘤剂和聚胺配制。复合物以10kDa以上的分子量在人体内起作用。另外，发现当于生物体内，与白蛋白非共价键合时，更增加表观分子量。因此，可在肿瘤细胞中富集。其结果是本发明对于各种癌可起到相当于低分子抗肿瘤剂10倍的强抗肿瘤作用，而尽可能减少副作用，因此是实体癌的理想治疗剂。
权利要求
1.一种聚合型抗肿瘤剂，其特征在于，该抗肿瘤剂由低分子抗肿瘤剂与苯乙烯-马来酸共聚物(SMA)形成聚合胶束复合物。
2.如权利要求1所述的聚合型抗肿瘤剂，其中低分子抗肿瘤剂为蒽环霉素抗肿瘤剂。
3.如权利要求1所述的聚合型抗肿瘤剂，其中低分子抗肿瘤剂为顺铂。
4.如权利要求1至3项所述的任一项所述的聚合型抗肿瘤剂，其水溶液中的表观分子量为10KDa以上。
5.一种权利要求1至3任一项所述的聚合型抗肿瘤剂的制造方法，其特征在于，在pH7或以下，水溶性碳二亚胺、氨基酸或聚胺的存在下，将苯乙烯-马来酸共聚物与抗肿瘤剂溶于水相溶液，然后将pH升高到8以上，中和，通过聚合物分离法回收聚合物组分。
全文摘要
本发明涉及苯乙烯－马来酸共聚物(SMA)与吡柔比星、多柔比素、表柔比星、柔红比星及阿柔比星等蒽环霉素系抗肿瘤剂、顺铂或紫杉醇(taxol)等生物碱(alkaloid)抗肿瘤剂通过分子间键合或相互作用而形成聚合胶束)复合物结构的聚合型抗肿瘤剂，该聚合型抗肿瘤剂可提高对于癌细胞的特异性而提升抗肿瘤效果，另一方面，不聚集于正常器官或组织，可减少副作用。该聚合型抗肿瘤剂可通过将SMA与低分子量抗肿瘤剂溶解于水溶液，然后在水溶性碳二亚胺、氨基酸或聚胺的存在下，调节pH，形成胶束复合物，回收聚合物部分制备。
文档编号A61P35/00GK1697663SQ200480000670
公开日2005年11月16日 申请日期2004年2月2日 优先权日2003年5月26日
发明者前田浩, 卡雷德具礼志 申请人:前田浩