能处理全血以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂和吸附器的制作方法

专利名称：能处理全血以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂和吸附器的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于吸附体液中存在的低密度脂蛋白和纤维蛋白原以减少其在体液中的浓度的吸附剂。本发明还涉及通过在所述吸附剂上吸附而从体液中除去低密度脂蛋白和纤维蛋白原的方法。此外，本发明还涉及使用用于体液中的低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂的吸附器。特别是，本发明涉及能处理全血的吸附剂。
背景技术：
近年来，患动脉硬化的患者数目随着饮食习惯的西方化和衰老而增加。众所周知低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)富含胆固醇并因此引起动脉硬化。还有一个事实，即动脉硬化在高脂血症或高胆固醇血症的患者中高发。另一方面，已知高密度脂蛋白(HDL)是对抗动脉硬化的阻滞因子。
尽管对这些疾病的治疗包括饮食疗法和药物疗法，适用于不能用这些疗法有效治疗的患者的治疗包括在体外通过吸附从血液中除去低密度脂蛋白。具体而言，将从血液中分离的血浆灌注通过填充有吸附剂的吸附器以除去低密度脂蛋白的疗法被广泛应用并具有高疗效，所述吸附剂包含固定有硫酸葡聚糖的纤维素珠。
另一方面，已报道纤维蛋白原浓度与冠状动脉疾病和脑卒中的发病率相关(W.B.Kannel等人，The Journal of the American MedicalAssociation，Vol.258，pp.1183-1186，1987)。为了预防这些与动脉硬化相关的疾病的发生，期望降低纤维蛋白原浓度以及低密度脂蛋白的浓度。
特别是，引起外周血管闭塞的动脉硬化被称为“闭塞性动脉硬化”。在这种疾病中，外周血管狭窄或闭塞而恶化外周血液循环，由此引起诸如肢体冷、麻木、间歇性跛行、静息痛、溃疡、坏疽等症状，导致截肢。还已报道了在外周血管有这种病损的闭塞性动脉硬化患者比健康成人具有更高的纤维蛋白原浓度(P.Poredos等人，Angiology，Vol.47，No.3，pp.253-259，1996)。因此，在对闭塞性动脉硬化的治疗中，也期望降低纤维蛋白原浓度以及低密度脂蛋白的浓度。
如上所述，对于动脉硬化特别是闭塞性动脉硬化患者期望的治疗包括降低血中低密度脂蛋白和纤维蛋白原的浓度。上述通过在包含固定有硫酸葡聚糖的纤维素珠的吸附剂上吸附而从血浆中去除低密度脂蛋白的疗法在吸附低密度脂蛋白方面是优异的，但该疗法未必足以降低纤维蛋白原浓度。在某些情况下，应用双重过滤血浆去除法。在该方法中，通过血浆分离器分离的血浆被引入血浆滤膜以除去未滤过的物质，即大于膜的孔径的物质以及水。这种方法可安全地除去低密度脂蛋白和纤维蛋白原，但其缺点在于所用的过滤系统需要电解质输液(液体置换)，并且甚至进行复杂的操作如温度控制、再循环或诸如此类，对于所要去除的物质的选择性也比吸附低，从而会除去除了低密度脂蛋白和纤维蛋白原以外的有用物质，例如白蛋白、免疫球蛋白如IgG、HDL-胆固醇等(Yoshie Konno等人，Japanese Journal of Apheresis，Vo.22，No.1，pp.44-50，2003)。此外还有报道已开发了一种被称为“肝素沉淀法”的疗法用于除去低密度脂蛋白和纤维蛋白原。但是，这种方法包括复杂的操作，不适于作为普通疗法推广普及。
还已知纤维蛋白原和低密度脂蛋白可用包括在其表面含有一种化合物的交联多孔材料的吸附剂除去，所述化合物具有疏水结构和阴离子官能团(日本未审专利申请No.7-136256)。尽管所述吸附剂对于纤维蛋白原具有优异的吸附能力，其对于低密度脂蛋白的吸附能力不足。为了呈现所述吸附剂在临床上充足的吸附能力，必须使用大量的该吸附剂。因此，在治疗中从体内取出的血液量增加，增大了在治疗中发生血压下降的可能性。该文献还公开了使用所述吸附剂的优选方法，其中通过血浆分离器从血液中分离血浆，然后从对于血细胞成分如血小板的影响的观点进行处理。
因此，减少低密度脂蛋白和纤维蛋白原的传统方法的缺点，在于所述方法由于血浆分离系统而包括复杂的操作并且表现差，而且还除去了有用物质。另一方面，无需从血液中分离血浆的直接全血处理体系近来已引起人们的注意，其作为一种使用吸附剂的体外循环疗法，操作简单并且缩短了治疗时间。所述直接全血处理体系不需要使用血浆分离器等进行血浆分离，并能直接处理用抗凝剂抗凝的血液。因此，流程非常简单，并可在短时间内有效吸附靶物质。从而，预期可减轻对于患者和医务人员的负担。
但是，要求所述直接全血处理体系尽可能地减少吸附剂与血细胞之间的相互作用和减轻对血细胞成分的影响。在直接全血处理中，最重要的是尽可能地抑制白细胞和血小板的活化。当活化程度低时，可以防止这些血细胞的丢失。特别是，当血管发生损伤时，血小板粘附到损伤部位，并且纤维蛋白原受体在表面表达，血小板与纤维蛋白原交联而形成血栓。血栓可能覆盖损伤部位以阻止血液渗漏。因此，通过全血处理吸附纤维蛋白原的技术被认为是非常困难的。关于上述包括在其表面含有化合物的交联多孔材料的吸附剂，所述化合物具有疏水结构和阴离子官能团，对直接全血处理的方法没有具体研究，而血浆处理体系被认为是优选的(日本未审专利申请公开号No.7-136256)。
如上所述，还没有常规方法通过非常简单的全血处理操作而有效除去低密度脂蛋白和纤维蛋白原，所述全血处理无需血浆分离并不会丢失其它有用的物质。因此，需要开发这样一种方法。
发明公开为了解决以上问题，本发明提供了一种吸附剂，用于从体液特别是全血有效吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原，以降低体液中低密度脂蛋白和纤维蛋白原的浓度，同时使有用物质如白蛋白和HDL的丢失降到最低限度。本发明还提供使用所述吸附剂吸附体液中的低密度脂蛋白和纤维蛋白原的方法。本发明进一步提供了包含所述吸附剂以吸附体液中的低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器。特别是，本发明提供了能使血细胞的丢失降到最低限度并安全地处理全血的吸附剂和吸附器。
发明人进行了深入的研究以寻找一种能使有用物质如白蛋白和HDL的丢失降到最低限度并通过全血处理有效吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂。结果，发明人发现了一种吸附剂，其包含固定在不溶于水的多孔载体上的色氨酸衍生物和聚阴离子化合物，其中固定预定量的聚阴离子化合物，并且固定的色氨酸的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比在特定范围内。发明人还发现，所述吸附剂能进行安全的全血处理，以有效吸附体液中的低密度脂蛋白和纤维蛋白原，同时使血细胞的丢失降低到最低限度。这一发现导致完成了本发明。
在本发明的第一方面，一种吸附剂能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原，其包含固定在不溶于水的多孔载体上的色氨酸衍生物和聚阴离子化合物，其中固定的聚阴离子化合物的量为0.10μmol-1.5μmol/ml吸附剂湿体积，并且每毫升吸附剂湿体积固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比/毫升吸附剂湿体积为1-70。在本发明的第二方面，一种吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的方法包括将所述吸附剂与含有低密度脂蛋白和纤维蛋白原的体液接触。在本发明的第三方面，一种能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器包括一个容器，其具有液体进口和出口以及防止吸附剂流到外面的装置，所述容器装有用于低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂。
在本发明中，术语“体液”指血液或血浆。
在本发明中，术语“聚阴离子化合物”指在其分子中具有多个阴离子官能团的化合物。在本发明中阴离子官能团的实例包括在中性pH带负电的官能团，如羧基、磺酸基团、硫酸基团和磷酸基团。在这些官能团中，从吸附能力的观点而言，优选羧基、磺酸基团和硫酸基团。而考虑到最高吸附能力，则特别优选硫酸基团。
聚阴离子化合物的代表性实例包括合成的聚阴离子化合物，如聚丙烯酸、聚乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚甲基丙烯酸、多磷酸和苯乙烯-马来酸共聚物；合成的酸性多糖，如硫酸葡聚糖和羧甲基纤维素；具有硫酸基团的酸性组织衍生的酸性粘多糖，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素；具有N-磺酸基团或硫酸基团的酸性粘多糖，如肝素和硫酸乙酰肝素；具有阴离子官能团的组织衍生的多糖，如软骨素和磷酸甘露聚糖；和组织衍生的核酸，如脱氧核糖核酸和核糖核酸。然而，聚阴离子化合物并不限于这些代表性实例。
在这些代表性化合物中，实用的是使用合成化合物而不是直接使用组织衍生的化合物，因为可以以低成本获得高纯度物质，并且可以控制引入的阴离子官能团的量。从这些观点来看，优选使用合成的聚阴离子化合物如聚丙烯酸、聚乙烯硫酸、聚乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚甲基丙烯酸、多磷酸和苯乙烯-马来酸共聚物；和合成的酸性多糖如硫酸葡聚糖和羧甲基纤维素。特别是，从低成本的观点而言，更优选聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸和硫酸葡聚糖，而从安全性的观点而言最优选硫酸葡聚糖。
聚阴离子化合物的分子量优选为1000或以上，考虑到与色氨酸组合对低密度脂蛋白和纤维蛋白原吸附能力的亲和力，更优选3000或以上。尽管聚阴离子化合物的分子量上限没有特别限制，从实际角度而言上限优选为1,000,000或以下。
在本发明中，可以采用将聚阴离子化合物固定到不溶于水的多孔载体上的多种方法中的任何一种。所述方法的代表性实例包括(1)采用辐射或电子束的嫁接法，将聚阴离子化合物共价结合到不溶于水的多孔载体表面，和(2)通过不溶于水的多孔载体的官能团共价结合聚阴离子化合物的化学法。
在本发明中，考虑到聚阴离子化合物和色氨酸衍生物固定于其中的吸附剂结构，通过官能团共价结合聚阴离子化合物的化学法更简单而优选，因为色氨酸衍生物可通过相同方法固定。
在本发明中，色氨酸衍生物的实例包括色氨酸、色氨酸酯如色氨酸乙基酯和色氨酸甲基酯以及具有吲哚环和类似于色氨酸的结构的化合物如色胺和色氨醇(tryptophanol)。色氨酸衍生物可以是L-异构体、D-异构体、DL-异构体或其混合物。或者，可以使用至少两种色氨酸衍生物的混合物。在这些色氨酸衍生物中，从安全性的观点而言优选色氨酸，并且在实际应用中最优选L-色氨酸，因为安全性数据充分，并且色氨酸是天然氨基酸、最为廉价且容易获得。
在本发明中，作为固定色氨酸衍生物的方法，优选采用通过不溶于水的多孔载体的官能团共价结合色氨酸衍生物的化学法。
在本发明中，固定的聚阴离子化合物的量必须为0.10μmol-1.5μmol/ml吸附剂湿体积，并且固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比必须为1-70。
在本发明中，固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比(TR/PA之比)按照以下等式计算TR/PA之比＝每毫升吸附剂湿体积中固定的色氨酸衍生物的摩尔数/每毫升吸附剂湿体积中固定的聚阴离子化合物的摩尔数发明人对固定的聚阴离子化合物的量、固定的色氨酸衍生物的量、低密度脂蛋白和纤维蛋白原以及在直接全血处理中血细胞通过特性进行了深入研究。结果惊人地发现，当固定的聚阴离子化合物的量控制到0.10μmol-1.5μmol/ml吸附剂湿体积，并且TR/PA摩尔比控制到1-70时，对于低密度脂蛋白和纤维蛋白原表现出高吸附能力，而且对白细胞和血小板的通过特性优异。
在本发明中，固定的聚阴离子化合物的量为0.10μmol-1.5μmol/ml吸附剂(湿体积)。对于小于0.10μmol的量，白细胞和血小板的通过特性低，从而减少了在全血灌注中收集的血液中白细胞的数目。对于超过1.5μmol的量，即使当固定色氨酸衍生物时，表现出的纤维蛋白原吸附能力也较低。鉴于高血细胞通过特性和高吸附能力，固定的聚阴离子化合物的量优选为0.12μmol-1.0μmol，更优选0.15μmol-0.50μmol。
在本发明中，固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比(TR/PA之比)为1-70。对于TR/PA之比小于1的情况，表现出的色氨酸衍生物的纤维蛋白原吸附能力较低。相反，对于超过70的TR/PA之比，白细胞和血小板的通过特性逐渐变差，从而减少在全血灌注中收集的血液中白细胞的数目。鉴于高血细胞通过特性和高吸附能力，摩尔比优选为5-60，更优选10-50。
在本发明中，吸附剂的湿体积如下测定将吸附剂浸入水中，并作为浆液转移到测量容器如量筒中，吸附剂浆液在测量容器中自发沉淀。然后，放置一橡皮垫以防止测量容器破裂，将测量容器从在垂直方向大约5-10cm的高度轻轻地掉落到垫上大约5-10次(从而使得沉淀的吸附剂不极度上升)以向吸附剂施加振动。在使测量容器静置15分钟或更长时间后，测定沉淀的吸附剂的体积。重复振动和静置操作，当沉淀的吸附剂的体积不变时，沉淀的吸附剂的体积即测定为湿体积。
在本发明中，测量固定的聚阴离子化合物的量的方法的实例包括测定吸附剂中聚阴离子化合物中元素含量的方法(例如，当硫酸葡聚糖是聚阴离子化合物时，测定吸附剂中的硫含量)，和测定在与吸附剂接触的色素溶液中色素量的减少的方法，所述色素具有与聚阴离子化合物结合的特性。在这些方法中，采用色素溶液的方法能简单并精确地测定固定的聚阴离子化合物的量。所述方法将在以下实施例1中作详细描述。当聚阴离子化合物是硫酸葡聚糖或聚丙烯酸时，固定的化合物的量可由吸附在与甲苯胺蓝溶液接触的吸附剂上的甲苯胺蓝的量而简单地测定，因为所述化合物具有与甲苯胺蓝结合的特性。
在本发明中，固定的色氨酸衍生物的量可通过利用以下特性来测定即当醛如对-二甲基苯甲醛与色氨酸衍生物分子中的吲哚环在强酸条件下缩合时会产生颜色(Amino Acid Fermentation(第二卷)KoichiYamada编辑，pp.43-45，Kyoritsu Shupppan，1972)。固定的色氨酸衍生物的量还可通过利用以下特性的方法来测定即当用大约280nm的光激发色氨酸衍生物分子中的吲哚环时会发射出峰在大约350nm的荧光。当载体包含不含氮的化合物时，其量可通过测定吸附剂中的氮含量而测定，这将在以下实施例1的方法中作详细描述。
在本发明中，不溶于水的多孔载体在正常温度和正常压力下不溶于水，并具有适宜大小的细孔，即多孔结构。对于不溶于水的多孔载体的形状，可以有效使用球形、颗粒状、扁平膜、纤维形状、中空纤维等中的任何一种。但是，出于容易操作的观点而言，优选采用球形或颗粒形状。
当不溶于水的多孔载体为球形或颗粒状时，出于本发明的吸附剂能进行全血处理考虑，载体的平均颗粒大小优选尽可能地大。但是，考虑到吸附效率，则优选平均颗粒尺寸尽可能地小。在本发明中，为了能进行全血处理并表现出高吸附效率，吸附剂的平均颗粒大小优选为100μm-1000μm。另外，出于可表现出高血细胞通过特性和吸附效率的观点，吸附剂的平均颗粒大小更优选为200μm-800μm，最优选400μm-600μm。
不溶于水的多孔载体优选分子量排阻限对于球状蛋白为5×105或以上。如书(Size Exclusion Chromatography，Sadao Mori著，KyoritsuShuppan)中所述，分子量排阻限指当具有多种分子量的样品在大小排阻色谱中流动时，在不进入细孔(被排除在外)的分子中具有最小分子量的分子的分子量。当对于球状蛋白的分子量排阻限小于5×105时，由于对纤维蛋白原和低密度脂蛋白的低吸附能力而不可行。当对于球状蛋白的分子量排阻限超过1×108时，孔径过大而减少了供吸附的表面积，从而降低了对纤维蛋白原和低密度脂蛋白的吸附能力。因此，在本发明中，不溶于水的多孔载体对于球状蛋白的分子量排阻限优选为5×105-1×108，更优选1×106-1×108，最优选2×106-1×108，这是出于表现出的吸附能力的观点而言。
在本发明中，不溶于水的多孔载体优选具有可用于结合以固定聚阴离子化合物和色氨酸衍生物的官能团。官能团的代表性实例包括氨基、酰胺基团、羧基、酸酐基团、琥珀酰亚胺基团、羟基、硫醇基团、醛基、卤素基团、环氧基团、硅烷醇基团和2，2，2-三氟乙磺酰基基团。但是，官能团不限于这些基团。不溶于水的多孔载体可以用一种方法如卤化-氰化法、表氯醇法、双环氧(bisepoxide)法或溴乙酰溴法来活化。在这些方法中，从实用和安全性的观点而言，最优选采用表氯醇法。
在本发明中，不期望不溶于水的多孔载体过于柔软或容易破裂。当在体液流动期间发生凝固时，不能获得足够的体液流速来延长处理时间并且不能继续处理。因此，为了防止吸附剂凝固，吸附剂优选具有足够的机械强度(硬度)。术语“硬度”指当含水液体流经均匀填充吸附剂的圆柱时，压力下降和流速具有线性关系直至至少0.3kgf/cm2，如以下在参照实施例中所示。
在本发明中，对不溶于水的多孔载体的材料没有特别限制。但是，所述材料的代表性实例包括有机载体，其包含多糖，如纤维素、醋酸纤维素和糊精；合成聚合物，如聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和聚乙烯醇。不溶于水的多孔载体可具有包衣层，其包含具有羟基的聚合物材料，如羟乙基甲基丙烯酸酯的聚合物，接枝共聚物如具有聚环氧乙烷链的单体与另一可聚合单体的共聚体，或诸如此类。在这些材料中，对于实际应用，优选使用纤维素或合成的聚合物如聚乙烯醇，因为活性基团可容易地被引入载体表面中。
在这些材料中，最优选使用纤维素载体。纤维素载体具有以下优点(1)由于相对高的机械强度和韧性，其很少破裂或产生细颗粒，因此，即使体液以高流速流过填充纤维素载体的柱，也几乎不会发生凝固，从而可使体液以高速流动。(2)与合成的聚合物载体相比，其具有高度安全性。因此，纤维素载体最优选用作本发明中不溶于水的多孔载体。
作为用于以本发明的吸附器进行的体外循环疗法的抗凝剂可以使用以下物质中的任何一种肝素、低分子量肝素、甲磺酸萘莫司他、加贝酯、阿戈托班、柠檬酸钠溶液以及含柠檬酸的抗凝剂如酸式柠檬酸盐-葡萄糖(acid citrate-dextrose)溶液(ACD溶液)和柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖溶液(CPD溶液)。特别是，从全血处理的角度而言，特别优选使用含柠檬酸的抗凝剂、肝素、低分子量肝素或甲磺酸萘莫司他作为抗凝剂。
有多种方法来使用本发明的吸附剂从体液中吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原。所述方法的代表性实例包括这样一种方法，其包括以下步骤取出体液并将其贮存在袋或类似物中，将吸附剂与体液混合以除去低密度脂蛋白和纤维蛋白原，然后滤出吸附剂以获得不含低密度脂蛋白和纤维蛋白原的体液；和这样一种方法，其包括以下步骤制备一种吸附器，其包括一个容器，容器中填充有吸附剂并具有体液进口和出口，出口有一个滤器以允许体液通过但不允许吸附剂通过，以及使体液流过吸附器。可以使用所述方法中的任何一种，但后一种方法包括简单的操作并可引入体外循环流程中，从而可从患者体液在线有效去除低密度脂蛋白和纤维蛋白原。因此，最优选该方法作为使用本发明的吸附剂吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的方法。
本发明的吸附器包括一个容器，其中填充有吸附剂并具有体液进口和出口，出口有一个滤器以允许体液但不允许吸附剂通过。从减少低密度脂蛋白和纤维蛋白原的效果而言，本发明的吸附器的容量必须为100ml或更大。尽管从吸附能力而言对吸附器的容量没有限制，但吸附器的容量优选为1000ml或更小，更优选800ml或更小，因为当从身体取出的血液量过大时可能发生血压下降。即使将吸附器引入另一血液纯化治疗如血液透析或诸如此类疗法的流程中，在体外循环的血液量也不过度增加，并且可以尽可能地防止当从身体取出血液时可能发生的血压下降，从这样的观点出发，吸附器的容量最优选为400ml或更小。
本发明的吸附器将参照

图1进行描述，该图是一个实例的示意性横截面观。
在图1中，参考数字1表示液体进口，参考数字2表示液体出口，参考数字3表示对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，参考数字4和5各表示一个筛网，参考数字6表示一个柱，而参考数字7表示对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器。但是，本发明的对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器不限于该实例，并且吸附器的形状没有特别限制，只要其包含填充有对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂的容器，所述容器具有液体进口和出口以及防止吸附剂流出到外面的装置即可。
实施本发明的最佳模式下面将参照实施例详细描述本发明。
(参照实施例)用琼脂糖材料(Biogel A-5m，由Bio-Rad Laboratories，Inc.生产，粒径50-100目)、乙烯聚合物材料(Toyopearl HW-65，由TosohCorporation生产，粒径50-100μm)和纤维素材料(CellulofineGC-700m，由Chisso Corporation生产，粒径45-105μm)中的每一种均匀填充两端均包含滤器(孔径15μm)的玻璃圆柱(内径9mm，柱长150mm)。然后，通过蠕动泵使水流过柱以确定流速与压力下降ΔP之间的关系。结果示于图2。
图2显示对于Toyopearl HW-65和Cellulofine GC-700m，流速增加基本上与压力增加成比例，而对于BiogelA-5m，即使当压力增加时，由于凝固，流速也不增加。在本发明中，如同Toyopearl HW-65和Cellulofine GC-700m，压力下降ΔP与流速之间呈线性关系直至0.3kgf/cm2的材料被称为“硬材料”。
(实施例1)。
首先，将22ml水、31ml 4N NaOH水溶液和32ml表氯醇加入100ml平均粒径大约450μm和对于球状蛋白的分子量排阻限为5×107的多孔纤维素珠，然后在搅拌下于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为16.4μmol/ml(湿体积)。
另一方面，将7.5g硫酸葡聚糖(硫含量大约18％，分子量大约4000)溶于25ml水中以制备硫酸葡聚糖水溶液。然后，将用水润湿的50ml环氧化的纤维素珠加入硫酸葡聚糖水溶液中，并用NaOH水溶液将所得混合物调至碱性，然后于45℃反应1.5小时。反应后，将珠用水和盐水充分清洗，并向珠中加入通过将0.77g L-色氨酸溶于50ml稀NaOH水溶液而制备的溶液，然后于50℃反应8小时。然后，将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(A)。
将珠A装入内径为10mm、长度为34mm、并在两端包含聚对苯二甲酸乙二醇酯筛网(各自的开口为150μm)的丙烯酸柱(体积2.7ml)。然后，将40ml健康成人的血液(通过每ml血液加入5单位肝素抗凝)以6.5ml/min的流速通过柱循环2小时。表1显示在循环2小时之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。所有的血细胞均显示出优异的通过特性。表2显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表2所示，LDL-胆固醇从116mg/dl降至78mg/dl，而纤维蛋白原从132mg/dl降至93mg/dl，但HDL-胆固醇只从66mg/dl轻微降至62mg/dl。
在珠A上固定的色氨酸的量由吸附剂的氮含量来确定。即，将1ml珠A用水充分清洗，在减压下于60℃干燥6小时或更长，然后通过总氮微分析仪进行定量分析。结果，珠A上固定的色氨酸的量为7.8μmol/ml。
珠A上固定的硫酸葡聚糖的量通过利用硫酸葡聚糖对甲苯胺蓝的亲和性来测定。即，将调节至大约90mg/l的大约100ml甲苯胺蓝(Basicblue 17(Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.)水溶液加入3ml珠A，将所得的混合物搅拌10分钟并静置。然后，通过在630nm的吸光度测定上清中甲苯胺蓝的量，并测定甲苯胺蓝量的减少作为固定的硫酸葡聚糖的量。结果，珠A上固定的葡聚糖的量为0.16μmol/ml，且TR/PA之比为48.6。
(实施例2)首先，将4ml水、32ml 4N NaOH水溶液和29ml表氯醇加入100ml与实施例1中相同的纤维素珠，然后在搅拌下于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为19.9μmol/ml(湿体积)。
另一方面，将7.5g与实施例1中相同的硫酸葡聚糖溶于25ml水中以制备硫酸葡聚糖水溶液。然后，将用水润湿的50ml环氧化的纤维素珠加入硫酸葡聚糖水溶液中，并用NaOH水溶液将所得混合物调至碱性，然后于45℃反应3小时。反应后，将珠用水和盐水充分清洗，并向珠中加入通过将0.77g L-色氨酸溶于50ml稀NaOH水溶液而制备的溶液，然后于55℃反应6小时。然后，将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(B)。珠B上固定的色氨酸的量为7.8μmol/ml，珠B上固定的硫酸葡聚糖的量为0.23μmol/ml，且TR/PA之比为33.8。
将珠B装入柱中，并将40ml健康成人的血液以与实施例1中相同的方法通过柱循环2小时。表1显示在循环之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。所有的血细胞均显示出优异的通过特性。表2显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表2所示，LDL-胆固醇从91mg/dl降至51mg/dl，而纤维蛋白原从220mg/dl降至143mg/dl，但HDL-胆固醇只从42mg/dl轻微降至41mg/dl。
(实施例3)首先，将55ml水、15ml 4N NaOH水溶液和14ml表氯醇加入100ml与实施例1中相同的纤维素珠，然后在搅拌下于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为8.8μmol/ml(湿体积)。
另一方面，将19.8g与实施例1中相同的硫酸葡聚糖溶于25ml水中以制备硫酸葡聚糖水溶液。然后，将用水润湿的50ml环氧化的纤维素珠加入硫酸葡聚糖水溶液中，并用NaOH水溶液将所得混合物调至碱性，然后于45℃反应6小时。反应后，将珠用水和盐水充分清洗，并向珠中加入通过将0.77g L-色氨酸溶于50ml稀NaOH水溶液而制备的溶液，然后于50℃反应8小时。然后，将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(C)。珠C上固定的色氨酸的量为4.0μmol/ml，珠C上固定的硫酸葡聚糖的量为0.32μmol/ml，且TR/PA之比为12.5。
将珠C装入柱中，并将40ml健康成人的血液以与实施例1中相同的方法通过柱循环2小时。表1显示在循环之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。所有的血细胞均显示出优异的通过特性。表2显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表2所示，LDL-胆固醇从163mg/dl降至101mg/dl，而纤维蛋白原从215mg/dl降至167mg/dl，但HDL-胆固醇只从60mg/dl轻微降至56mg/dl。
(对比实施例1)以与实施例3中相同的方法制备固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(D)，除外硫酸葡聚糖的反应时间从6小时变为0.5小时，并且硫酸葡聚糖的量由19.8g变为7.5g。珠D上固定的色氨酸的量为5.7μmol/ml，珠D上固定的硫酸葡聚糖的量为0.08μmol/ml，且TR/PA之比为70.9。
将珠D装入柱中，并将40ml健康成人的血液以与实施例1中相同的方法通过柱循环2小时。表1显示在循环之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。尽管红细胞显示出优异的通过特性，但在循环后白细胞和血小板分别减少至66％和63％，由此显示出稍低的通过特性。表2显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表2所示，纤维蛋白原从189mg/dl降至127mg/dl，但LDL-胆固醇只从86mg/dl轻微降至62mg/dl，而HDL-胆固醇从66mg/dl轻微降至63mg/dl。
(对比实施例2)首先，将14ml水、24ml 4N NaOH水溶液和29ml表氯醇加入100ml与实施例1中相同的纤维素珠，然后在搅拌下于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为14.7μmol/ml(湿体积)。
然后，向50ml环氧化的纤维素珠中加入通过将0.77g L-色氨酸溶于50ml稀NaOH水溶液而制备的溶液，而后于55℃反应6小时。之后，将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有色氨酸的纤维素珠(E)。珠E上固定的色氨酸的量为8.2μmol/ml。
将珠E装入柱中，并将40ml健康成人的血液以与实施例1中相同的方法通过柱循环2小时。表1显示在循环之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。尽管红细胞和白细胞显示出优异的通过特性，但在循环后血小板减少至69％，由此显示出稍低的通过特性。表2显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表2所示，纤维蛋白原从132mg/dl降至77mg/dl，但LDL-胆固醇只从116mg/dl轻微降至85mg/dl，而HDL-胆固醇只从66mg/dl轻微降至61mg/dl。
(实施例4)首先，将42ml水、100ml 2N NaOH水溶液和17ml表氯醇加入100ml平均粒径大约410μm和对于球状蛋白的分子量排阻限为5×107的多孔纤维素珠，然后于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为16.5μmol/ml(湿体积)。
另一方面，将23.3g与实施例1中相同的硫酸葡聚糖溶于39ml水中以制备硫酸葡聚糖水溶液。然后，将用水润湿的50ml环氧化的纤维素珠加入硫酸葡聚糖水溶液中，并用NaOH水溶液将所得混合物调至碱性，然后于45℃反应6小时。反应后，将珠用水和盐水充分清洗，并向珠中加入通过加热将0.93g L-色氨酸溶于50ml水中而制备的溶液，在将所得混合物用NaOH水溶液调至碱性后，反应于50℃进行8小时。然后，将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(F)。珠F上固定的色氨酸的量为7.8μmol/ml，珠F上固定的硫酸葡聚糖的量为0.17μmol/ml，且TR/PA之比为45.9。
将珠F装入内径为10mm、长度为45mm、并在两端包含聚对苯二甲酸乙二醇酯筛网(各自的开口为50μm)的丙烯酸柱(体积3.5ml)。然后，将43ml健康成人的血液(通过每ml血液加入5单位肝素抗凝)以2.1ml/min的流速通过柱循环2小时。表3显示在循环2小时之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。所有的血细胞均显示出优异的通过特性。表4显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表4所示，LDL-胆固醇从141mg/dl降至94mg/dl，而纤维蛋白原从234mg/dl降至146mg/dl，但HDL-胆固醇只从49mg/dl轻微降至45mg/dl。
(对比实施例3)首先，将42ml水、50ml 2N NaOH水溶液和17ml表氯醇加入100ml与实施例4中相同的纤维素珠，然后在搅拌下于40℃反应2小时。反应后，将珠用水充分清洗以制备环氧化的纤维素珠。环氧化的纤维素珠的环氧基团的量为12.4μmol/ml(湿体积)。
然后，将23.3g与实施例1中相同的硫酸葡聚糖溶于39ml水中以制备硫酸葡聚糖水溶液，并将用水润湿的50ml环氧化的纤维素珠加入硫酸葡聚糖水溶液中。在用NaOH水溶液将所得混合物调至碱性后，反应于45℃进行20小时。然后将珠用水和盐水充分清洗以制备固定有硫酸葡聚糖的纤维素珠(G)。珠G上固定的硫酸葡聚糖的量为0.6μmol/ml。
将珠G装入柱中，并将43ml健康成人的血液以与实施例4中相同的方法通过柱循环2小时。表3显示在循环之前和之后在收集的血液中血细胞的数目。尽管红细胞显示出优异的通过特性，在循环后白细胞和血小板分别减少至66％和63％，由此显示出稍低的通过特性。表4显示在循环之前和之后在收集的血液中LDL-胆固醇、纤维蛋白原和HDL-胆固醇的浓度。如表4所示，纤维蛋白原从141mg/dl降至89mg/dl，但LDL-胆固醇只从234mg/dl轻微降至198mg/dl，而HDL-胆固醇从49mg/dl轻微降至46mg/dl。
(实施例5)首先，量出1.0ml实施例2中制备的固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(B)，并向珠中加入10ml健康人的血浆，然后于37℃温育4小时。温育后，将血浆从珠中分离，测定血浆中LDL-胆固醇、纤维蛋白原、白蛋白、IgG和HDL-胆固醇的浓度。结果示于表5中。如表5所示，LDL-胆固醇由115mg/dl降至81mg/dl，而纤维蛋白原由244mg/dl降至186mg/dl，但白蛋白只由4.5g/dl轻微降至4.3g/dl，IgG由1203mg/dl轻微降至1133mg/dl，而HDL-胆固醇由62mg/dl轻微降至59mg/dl。
(实施例6)首先，量出1.0ml实施例4中制备的固定有硫酸葡聚糖和色氨酸的纤维素珠(F)，并向珠中加入10ml健康成人的血浆，然后于37℃温育4小时。温育后，将血浆从珠中分离，测定血浆中LDL-胆固醇、纤维蛋白原、白蛋白、IgG和HDL-胆固醇的浓度。结果示于表5中。如表5所示，LDL-胆固醇由87mg/dl降至62mg/dl，而纤维蛋白原由260mg/dl降至190mg/dl，但白蛋白只由4.7g/dl轻微降至4.5g/dl，IgG由927mg/dl轻微降至876mg/dl，而HDL-胆固醇由55mg/dl轻微降至54mg/dl。
表1

比值*血液灌注后/血液灌注前×100
表2

之前在血液灌注之前之后在血液灌注之后表2(续)

表3

比值*血液灌注后/血液灌注前×100表4

之前在血液灌注之前之后在血液灌注之后表4(续)

表5

表5(续)

附图简要说明图1是显示本发明的吸附器的一个实例的示意性横截面观。
参考数字各表示以下含义1 体液进口2 体液出口3 对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂4，5 筛网(防止吸附剂流出的装置)6 柱7 对低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器图2显示在3种类型凝胶的使用中流速与压力下降之间的关系。
工业实用性根据本发明，低密度脂蛋白和纤维蛋白原可直接从体液特别是全血中被有效吸附，以降低这些成分在体液中的浓度，同时将有用物质如HDL和白蛋白的丢失降到最低限度。本发明作为降低动脉硬化特别是闭塞性动脉硬化患者血中低密度脂蛋白和纤维蛋白原浓度的方法特别有效。
权利要求
1.能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，所述吸附剂包含固定在不溶于水的多孔载体上的色氨酸衍生物和聚阴离子化合物，其中固定的聚阴离子化合物的量为0.10μmol-1.5μmol/ml吸附剂湿体积，并且固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比为1-70。
2.权利要求1的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，其中所述聚阴离子化合物是硫酸葡聚糖。
3.权利要求1或2的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，其中所述色氨酸衍生物是色氨酸。
4.权利要求1-3任一项的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，其中所述不溶于水的多孔载体是纤维素载体。
5.权利要求1-4任一项的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂，其中所述不溶于水的多孔载体对球状蛋白的分子量排阻限为5×105-1×108。
6.从体液中吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的方法，所述方法包括使权利要求1-5任一项的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂与含有低密度脂蛋白和纤维蛋白原的体液相接触。
7.能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器，所述吸附器包括一个容器，其具有液体进口、液体出口和防止吸附剂流出到外面的装置，其中所述容器中装有权利要求1-5任一项的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂。
8.权利要求7的能进行全血处理以吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附器，其中所述吸附器的处理能力为100ml-400ml。
全文摘要
本发明提供了直接从体液特别是全血中有效吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原的吸附剂、吸附方法和吸附器，以降低这些成分在体液中的浓度，同时使有用物质如HDL和白蛋白的丢失降低到最低限度。所述吸附剂包括固定在不溶于水的多孔载体上的色氨酸衍生物和聚阴离子化合物，其中固定的聚阴离子化合物的量为0.10μmol－1.5μmol/ml吸附剂湿体积，并且固定的色氨酸衍生物的量与固定的聚阴离子化合物的量的摩尔比为1－70。所述吸附剂能进行全血处理以安全并且有效地吸附低密度脂蛋白和纤维蛋白原。
文档编号A61M1/36GK1697665SQ20048000056
公开日2005年11月16日 申请日期2004年4月23日 优先权日2003年5月8日
发明者中谷胜, 小林明, 西本岳弘, 古吉重雄 申请人:钟渊化学工业株式会社