专利名称：酰胺甲基取代的1－(羧烷基)－环戊基羰基氨基-苯并氮杂－n－乙酸衍生物、它们的制 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的酰胺甲基取代的1-(羧烷基)-环戊基羰基氨基-苯并氮杂-N-乙酸衍生物，其用于例如预防和/或治疗心血管病症或疾病、尤其是心机能不全、特别是充血性心力衰竭；高血压，包括如原发性高血压、肾性高血压和/或肺动脉高血压的高血压继发形式，和/或为了预防和/或治疗性功能障碍和/或预防和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症，还涉及含这些化合物的药物。此外，本发明还涉及新的酰胺甲基取代的苯并氮杂-N-乙酸衍生物的制备方法以及该方法中的中间产物。
性功能障碍(SD)是一种能影响雄性和雌性的值得注意的临床问题。SD的原因可能是器质性的也可能是心理上的。SD的器质性方面典型地由患有与高血压或糖尿病有关的血管疾病所引起，由处方药物引起和/或由精神病学疾病如抑郁症引起。生理的因素包括恐惧、成绩焦虑和人与人之间的冲突。SD损害性能力、削弱自尊并破坏个人关系，由此导致个人的痛苦。
细胞凋亡与发育过程中的形态形成和组织发生、体内平衡的维持、以及生物防御密切相关，它是在维持个体生命中起重要作用的细胞死亡。当该由基因调节的死亡过程受到先天性(congenially)或后天性(postnatally)防碍，细胞凋亡被过度地诱导或抑制以致引起多个器官的功能紊乱，并由此引起疾病。显示出细胞凋亡抑制活性的药物可以用作防治被认为是由细胞凋亡促进介导的疾病的治疗剂。
具有心血管活性的苯并氮杂-、苯并氧氮杂(benzoxazepine)-和苯并硫氮杂(benzothiazepine)-N-乙酸衍生物对中性内肽酶(＝NEP)具有明显的抑制作用，已从EP 0733 642 A1(＝US 5,677,297)的说明书中获悉。此外，其中描述的化合物还具有较少的抑制内皮缩血管肽转化酶(＝ECE)的性质。此外落入EP 0 733 642 A1结构范围的化合物的有利的药理学性质由文献EP 0 830 863 A1(＝US 5,783,53)、WO 00/48601 A1(＝US 6,482,820)和WO 01/03699 A1(＝US-2003-0040512-A1)获知。
对NEP和ECE具有联合抑制作用的膦酸取代的苯并氮杂酮(benzazepinone)-N-酸性酸衍生物公开于文献EP 0 916 679 A1(＝US5,952,327)。
由WO 02/094176 A2的说明书获知含具有抑制金属蛋白酶NEP和IGS5的有利组合作用尤其具有心血管活性的化合物的药物制剂。对这类组合制剂的适宜化合物也是属于EP 0 733 642 A1和EP 0916 679 A1说明书范围的化合物。在本发明的上下文中应当理解，酶IGS5及其在心血管疾病方面生理作用本身也可从WO 01/36610 A1的说明书获知。前述的酶IGS5又名“人可溶性内肽酶”(＝hSEP)。
由文献WO 99/55726 A1已知ECE的某些硫醇抑制剂用于治疗或抑制尤其是勃起机能障碍。
文献EP 1 097 719 A1公开了NEP抑制剂用于治疗雌性性功能障碍(＝FSD)的用途。
公开号WO 02/06492 A1公开了抗具有可溶的经分泌的内肽酶(＝SEP)活性的特异性多肽的抗体和抑制剂。
在专利申请US 20030045449中描述了基质金属蛋白酶抑制剂用于神经变性疾病的治疗。与该发明有关的问题首先是基质金属蛋白酶抑制剂包括一大组的蛋白酶抑制剂，其次是按照所述申请必须以还含有N-NOS抑制剂的药物组合物形式应用。
公开的专利申请US 2002/0013307教导了血管肽酶抑制剂治疗或缓解认知机能障碍发展以及治疗和/或防止痴呆的用途。
M.Sumitomo等(参见Clinical Cancer Research 10(2004)260-266)描述了用NEP使非雄激素依赖型前列腺癌的化学致敏作用(chemosensitization)。
本发明的目的是以提供具有抑制NEP、hSEP和ECE的复合作用特性的新活性物质，其尤其适于预防和/或治疗心血管病症或疾病、尤其是心机能不全、特别是充血性心力衰竭；高血压、包括如原发性高血压、肾性高血压和/或肺动脉高血压的高血压继发形式；和/或预防和/或治疗性功能障碍和/或预防和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症。
现在令人惊奇地发现本发明的一类新的酰胺甲基取代的1-(羧烷基)-环戊基羰基氨基-苯并氮杂-N-乙酸衍生物以其抑制酶NEP和hSEP、并在一定程度上抑制ECE的作用特性为特征，因此显得适于预防和/或治疗心血管病症或疾病、尤其是心机能不全、特别是充血性心力衰竭；高血压，包括如原发性高血压、肾性高血压和/或肺动脉高血压的高血压继发形式；和/或预防和/或治疗性功能障碍和/或预防和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症。
本发明的主题是新的通式I的酰胺甲基取代的1-(羧烷基)-环戊基羰基氨基-苯并氮杂-N-乙酸衍生物，和式I酸的生理学相容的盐和/或式I化合物生理学相容的酸加成盐， 其中R1为氢或生成生物不稳定酯的基团，R2为氢、C1-4-烷基的或C1-4-羟烷基，其中羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化，且R3为C1-4-烷基；C1-4-烷氧基-C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，任选地被另一个羟基取代且其中的羟基各自任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基；C3-7-环烷基；C3-7-环烷基-C1-4-烷基；苯基-C1-4-烷基，其中苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次；萘基-C1-4-烷基；C3-6-氧烷基；苯基羰基甲基，其中的苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次，或2-oxoazepanyl，或者R2和R3一起为C4-7-亚烷基，其中亚甲基任选地被羰基、氮、氧和/或硫置换1-2次，和任选地被羟基取代一次，羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，其中羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；苯基或苄基，且R4为氢或生成生物不稳定酯的基团，此外，本发明的主题为含式I化合物的药物。此外，本发明的主题为制备式I化合物的方法以及该方法中的中间产物。
在本发明的范围内描述的式I化合物或其它化合物中取代基为或者包含C1-4-烷基的情况下，这些取代基可各自为直链或分支的。在式I化合物中的取代基代表卤素的情况下，氟、氯或溴是适宜的。优选氯。在取代基包含C2-4-烷酰基的情况下，该取代基可以是直链或分支的。作为C2-4-烷酰基优选乙酰基。
在式I化合物中的羟基用氨基酸残基酯化的情况下，这些氨基酸残基可以由天然的或非天然的α-或β-氨基酸而来。可以使用的适宜的氨基酸例如选自丙氨酸、2-氨基己酸(＝正亮氨酸)、2-氨基戊酸(＝正缬氨酸)、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、3，4-二羟基苯丙氨酸(＝多巴)、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸(＝2，5-二氨基戊酸)、5-氧代-2-吡咯烷碳酸(＝焦谷氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲腺原氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。优选的氨基酸残基源自于丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸以及缬氨酸。
式I化合物代表任选地用生成生物不稳定酯的基团酯化的二羧酸衍生物。式I的生物不稳定酯通常代表该游离酸的可给药的前体(＝“前体药物”)。其次，式I化合物可以单酯或二酯出现。取决于给药的形式，生物不稳定的酯或游离酸为优选，后者对于静脉内给药(＝iv)尤其合适。
可在体内生理条件下裂解释放式I化合物生物可利用的衍生物的基团是适宜作为生成生物不稳定酯的基团R1和R4的。适宜的实例为C1-4-烷基，尤其是甲基、乙基、正丙基和异丙基；C1-4-烷氧基-C1-4-烷氧基-C1-4-烷基，尤其是甲氧基乙氧基甲基；C3-7-环烷基，尤其是环己基；C3-7-环烷基-C1-4-烷基，尤其是环丙基甲基；N，N-二(C0-4-烷基)氨基-C1-6-烷基；苯基或苯基-C1-4-烷基，任选地在苯基环中被卤素、C1-4-烷基或C1-4-烷氧基取代一次或两次或被与两个相邻碳原子键合的C1-4-亚烷基取代；任选地在二氧杂环戊烷环上被C1-4-烷基取代的二氧杂环戊烷基甲基；任选地在氧-C1-4-烷基上被C1-4-烷基取代的C2-6-烷酰氧基-C1-4-烷基；双酯类如1-[[(C1-4-烷基)羰基]氧基]C1-4-烷基酯，例如(RS)-1-[[(异丙基)羰基]氧基]乙基或(RS)-1-[[(乙基)羰基]氧基]-2-甲基丙基(制备参见例如F.W.Sum等，Bioorg.Med.Chem.Lett.9(1999)1921-1926 or Y.Yoshimura等，The J ournal ofAntibiotics39/9(1986)1329-1342)；碳酸酯如1-[[(C4-7-环烷氧基)羰基]氧基]C1-4-烷基酯，优选(RS)-1-[[(环己氧基)羰基]氧基]乙基(＝cilexetil；制备参见例如K.Kubo等，J.Med.Chem.36(1993)2343-2349，下文中引为“Kubo等”))或2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-C1-4-烷基酯，其任选地在二氧杂环戊烷环中含有双键优选5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基-甲基(＝medoxomil，制备，参见例如Kubo等)或2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-甲基(＝(甲基)亚乙基碳酸酯)。在生成生物不稳定酯的基团代表任选地被取代的苯基-C1-4-烷基的情况下，该基团可以含1-3个、优选1个碳原子的亚烷基链，优选代表任选地被取代的苄基、尤其代表2-氯苄基或4-氯苄基。在生成生物不稳定酯的基团代表任选地被取代的苯基的情况下，其中苯基环被低级亚烷基链取代，该基团可以含3-4个、优选3个碳原子，尤其是茚满基。在生成生物不稳定酯的基团代表任选地被取代的C2-6-烷酰氧基-C1-4-烷基的情况下，C2-6-烷酰氧基可以是直链或分支的。
R1优选氢、乙基、甲氧基乙氧基甲基、(RS)-1-[[(异丙基)羰基]氧基]乙基、(RS)-1-[[(乙基)羰基]氧基]-2-甲基丙基、(RS)-1-[[(环己基氧基)羰基]氧基]乙基、5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基-甲基、2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-甲基或(RS)-1-[[(乙氧基)羰基]氧基]乙基。
R2优选氢、甲基、乙基、2-羟乙基或3-羟丙基，每个羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化。
在R3为(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基的情况下，一个或两个C0-4-烷基可彼此独立地存在。更具体而言，“(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基”明确地包括“(C0)2-烷基氨基-C1-6-烷基”、“(C0)(C1-4)-烷基氨基-C1-6-烷基”和“(C1-4)2-烷基氨基-C1-6-烷基”。“(C0)2-烷基氨基-C1-6-烷基”指与C1-6-烷基(烯)连接的未被取代的伯胺(＝-NH2)；“(C0)(C1-4)-烷基氨基-C1-6-烷基”指被(C1-4)-烷基单取代且与C1-6-烷基(烯)连接的仲胺基；“(C1-4)2-烷基氨基-C1-6-烷基”指被(C1-4)-烷基双取代且与C1-6-烷基(烯)连接的叔胺基；R3优选异丙基；甲氧乙基；2-羟乙基或3-羟丙基，每个羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；3-乙酰氧基-正丙基；环丙基甲基；2-甲氧苄基、4-甲氧苄基，4-甲氧苯基乙基、2，4-二甲氧基苄基；1-萘基甲基；3-氧代-1，1-二甲基丁基；苯基-2-氧代乙基、2-(4-甲氧苯基)-2-氧代乙基、3-(2-oxoazepanyl)；(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基，尤其是二甲氨基-正丙基、(甲基)氨乙基、氨基正丙基、氨基正丁基或氨基正戊基。
在R2和R3一起为C4-7-亚烷基的情况下，其中的亚甲基任选地被置换或任选地被取代，在各种情况下任选地为吗啉；哌啶；4-酮哌啶；4-羟基哌啶，任选地在羟基上用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；优选哌嗪或吡咯烷。
R4优选氢、C1-4-烷基，对甲氧苄基、N，N-二(C0-4-烷基)氨基-C1-6-烷基、(RS)-1-[[(异丙基)羰基]氧基]乙基、(RS)-1-[[(乙基)羰基]氧基]-2-甲基丙基、(RS)-1-[[(环己基氧基)羰基]氧基]乙基、5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基-甲基、2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-甲基或(RS)-1-[[(乙氧基)羰基]氧基]乙基。
尤其优选的式I化合物选自
2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸(32)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(二甲氨基)-4-氧代丁酸(54)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(二乙氨基)-4-氧代丁酸(55)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(2-羟乙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁酸(43)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁酸(56)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(4-羟基哌啶-1-基)-4-氧代丁酸(57)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代-4-[4-(L-缬氨酰氧基)哌啶-1-基]丁酸(68)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-吗啉-4-基-4-氧代丁酸(66)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代-4-(4-氧代哌啶-1-基)丁酸(45)；4-[双(2-羟乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸(58)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{乙基[3-(乙氨基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸(52)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[[2-(二甲氨基)乙基](甲基)氨基]-4-氧代丁酸(59)；4-[(3-氨丙基)(乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸(67)，2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{甲基[2-(甲氨基)乙基]氨基}-4-氧代丁酸(68)；4-[(4-氨丁基)(甲基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸(75)；4-[(4-氨丁基)(乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸(76)；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{甲基[3-(甲氨基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸(77)和4-[(5-氨基戊基)(甲基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸(78)；连同它们的生物不稳定酯和这些式I化合物的生理学相容的盐和/或这些式I化合物的生理学相容的酸加成盐。
按照本发明，新的式I化合物及其盐通过以下方法获得使通式II化合物
其中R101和R401各自相互独立地为酸保护基，与通式III化合物反应， 其中R2和R3如上定义，在R2和/或R3包含游离羟基的情况下，如有需要使其与通式IV化合物反应，C1-3--C(O)-XIV其中X代表离去基团，或与被适宜的保护基保护的氨基酸衍生物反应，在R101和/或R401不代表期望的生成生物不稳定酯的基团的情况下和/或在R2和/或R3包含以任何给出的氨基酸残基形式的保护基的情况下，将其同时或按任何期望的顺序分别相继裂解成最终的化合物，如有需要将在各种情况下释放的酸官能团转化为生物不稳定的酯基，且需要时将所产生的式I酸转化为它们的生理学相容的盐，或将式I酸的盐转化为游离的酸和/或将式I的碱转化为它们的酸加成盐或将酸加成盐转化为式I的游离碱。
在各种情况下式I酸适宜的生理学相容的盐为它们的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，例如它们的钠盐、钾盐或钙盐，它们与胺类例如氨、二乙胺、叔丁胺、N-甲基葡萄糖胺、胆碱或与氨基酸例如精氨酸的生理学相容的、药理学中性的有机盐。在式I化合物中的取代基R2和/或R3含碱性原子团尤其是氮的情况下，式I化合物也可以以酸加成盐的形式存在。式I化合物生理学相容的酸加成盐为其与无机酸、或与有机酸、或与磺酸成的常规盐，无机酸例如硫酸、磷酸或氢卤酸，优选盐酸，有机酸例如低级脂肪单羧酸、二羧酸或三羧酸如马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸，磺酸例如低级烷磺酸如甲磺酸。
作为酸保护基R101和R401可以选择保护羧酸官能团的常规保护基，其可采用已知的方法裂解。对于羧酸适宜的保护基从例如McOmie，“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press(在下文中引为“McOmie”)，以及Greene，Wuts，“Protective Groupsin Organic Synthesis”，Wiley Interscience Publication(在下文中引为“Greene”)获知，各自在最新的版本中。生成生物不稳定酯的基团也可以用作酸-保护基。在这些情况下，式II化合物与式III化合物反应得到的化合物就已经表示本发明式I的酯。
适宜的酸-保护基R101和R401尤其是那些能相互独立地选择性裂解或选择性引入的基团。可在不同的条件下裂解的酸保护基也可以代表生成生物不稳定酯的基团的实例是无分支的低级烷基如乙基，其能在碱性条件下相对容易裂解；分支的低级烷基如叔丁基，其能容易被酸如三氟乙酸裂解；任选地在苯基环上被取代的苯基甲基如苄基，其能通过氢解或者在碱性条件下容易裂解；在苯基环上被低级烷氧基取代一次或多次的苯基甲基基团如对甲氧苄基，其在氧化条件下例如在2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(＝DDQ)或硝酸高铈铵的作用下相对容易裂解；或已知的能被氟化物离子容易裂解的含硅保护基。本领域的技术人员对选择适宜的保护基以获得所需的取代模式是熟悉的。
式I化合物含两个手性碳原子，即在苯并氮杂骨架的3位上具有酰胺侧链的碳原子(＝Cb*)和具有基团“-COOR1”的碳原子(＝Ca*)。因此该化合物可以存在总共四个立体异构形式。本发明既包括式I的立体异构体的混合物又包括其对映异构体的混合物，还包括式I的纯异构化合物。优选式I的纯异构化合物。尤其优选其中在苯并氮杂骨架的3位具有酰胺侧链的碳原子为“S”构型的式I化合物。关于具有基团“-COOR1”的手性碳原子“*Ca”，本发明优选的式I化合物的该构型，在本发明的上下文中临时地指定该构型名称为″rell″(参见实验部分)。由已知构型的适宜化合物的类似观测可得出在手性中心“*Ca”上优选的构型“rell”可能同样为“S”构型。
式II酸与式III胺的反应可按照常规方法进行用于通过氨酰化形成酰胺基。式II的羧酸或它们的反应性衍生物可以用作酰化试剂。尤其是混合的酸酐和酰基卤为适宜的反应性衍生物。因此可以使用例如式II酸的酰基氯或酰基溴，或式II酸与有机磺酸的混合酯，例如与任选地被卤素取代的低级烷磺酸(如甲磺酸或三氟甲磺酸)的混合酯，或与芳基磺酸如苯磺酸或与被低级烷基或卤素取代的苯磺酸(例如甲苯磺酸或溴苯磺酸)的混合酯。酰化可以在有机溶剂中进行，其中有机溶剂在-20℃至室温(＝RT)之间的温度时在反应条件下为惰性。适宜的溶剂是卤代烃如二氯甲烷、或芳香烃如苯或甲苯、或环醚如四氢呋喃(＝THF)或二烷、或这些溶剂的混合物。
在酸结合试剂的存在下酰化可有利地进行，尤其是式II酸与磺酸的混合酐用作酰化试剂时。例如适宜的酸结合剂是可溶于反应混合物的有机碱如叔氮碱，例如低级烷基叔胺和吡啶类如三乙胺、三丙胺、N-甲基吗啉、吡啶、4-二甲氨基吡啶、4-二乙氨基吡啶或4-吡咯烷并吡啶。过量使用的有机碱也可同时充当溶剂。
若式II酸本身用作酰化试剂，则式III氨基化合物与式II羧酸的反应也可在偶合试剂的存在下有利地进行，偶合试剂例如从肽化学过程已知的适于酰胺形成的偶合试剂。通过使游离酸与酸在原位反应形成反应性酸衍生物来促进酰胺形成的偶合试剂的实例尤其是氯甲酸乙酯、烷基碳二亚胺、例如环烷基碳二亚胺如二环己基碳二亚胺或N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(＝EDC)、羰二咪唑和N-低级烷基-2-卤代吡啶盐尤其是卤化物或甲苯磺酸盐。在偶合试剂的存在下该反应可在溶剂如卤代烃和/或芳烃的溶剂中和任选地在上述结合酸的胺的存在下于-30°至+50℃的温度有利地进行。
在式II化合物与式III化合物反应得到的化合物(其中R2和/或R3含游离羟基)中，需要时这些化合物可以与式IV化合物按照已知的方法反应。在式IV化合物中，离去基团X代表例如卤素，优选氯。
在式II化合物与式III化合物反应得到的化合物(其中R2和/或R3含游离羟基)中，需要时这些化合物可以与被适宜的保护基保护的氨基酸衍生物按照已知的方法反应。适宜的氨基酸保护基连同引入它们或选择性地裂解它们的方法在现有技术中例如从McOmie或从Greene已知。适当的经保护的氨基酸衍生物是市购可得的或者可用已知的方法制取。
保护基R101和R401(假如它们不表示任何所需的生成生物不稳定酯的基团)、和/或可以以R2和/或R3存在于任何给出的氨基酸基团中的保护基，可用已知的方法由式II化合物与式III化合物反应得到的化合物裂解，需要时选择性地裂解。
式I化合物可以从反应混合物中分离出来，必要时用已知的方法进行纯化，例如通过高效液相色谱(＝HPLC)纯化。
式II原料化合物为适合作为用于制备新活性物质例如制备式I化合物的中间产物的新化合物。式II化合物可通过以下方法来制备使通式V化合物 其中R5为酸-保护基且R101如上定义，与通式VI化合物， 其中R401如上定义，反应，随后再用已知的方法裂解酸保护基R5。该反应可用已知的氨酰化方法进行，例如按照如上所述的用于式II化合物与式III化合物反应的方法进行。为了避免不期望的副反应，通过不在碱性介质中操作的方法裂解酸-保护基R5因而选择相应地适宜的酸-保护基R5可能是有利的。
式III胺本身是已知的，或者可用已知的方法由已知的化合物制取。
式IV的反应性酸衍生物本身是已知的，或者可用已知的方法由已知的化合物制取。这些衍生物是直链或者分支的C1-4-羧酸衍生物。
式V化合物可通过以下方法来制备使通式VII丙烯酸酯衍生物 其中R101和R5如上定义，与环戊烷羧酸反应。该反应可用已知的方法在Michael缩合反应的条件下在反应条件下为惰性的有机溶剂中通过以下反应进行环戊烷羧酸与能生成环戊烷羧酸二价阴离子的强碱反应，随后与式VII丙烯酸酯衍生物反应。适宜的溶剂是醚，尤其是环醚如THF。适宜的强碱是非亲核性有机酰胺碱金属或低级烷基碱金属如二异丙基酰胺锂或者正丁基锂。有利地，使环戊烷羧酸与两当量的正丁基锂在THF中反应，然后进一步与式VII化合物反应。反应温度可以在-80℃和0℃之间。
式VI化合物是已知的，例如从EP 0 733 642 A1的说明书中获知，可按照其中描述的方法或与之类似的方法以外消旋物或者纯异构体的形式制备。
式VII化合物可通过以已知的方法用所需醇来酯化通式VIII化合物制备， 其中R5代表酸-保护基。
例如式VIII化合物可通过使衣康酸酐在已知的打开酸酐基团的条件下与能生成酸-保护基R5的试剂如相应取代的醇反应获得。
在上述反应中，式V和式VI原料化合物中的手性中心不发生变化，以致可根据原料化合物的类型获得最终的式I异构纯化合物或异构体混合物。为了制备立体化学均一的式I化合物，有利地使立体化学均一的式V化合物与立体化学均一的式VI化合物反应。若对映体纯的式V化合物与外消旋的式VI化合物反应或者外消旋的式V化合物与对映体纯的式VI化合物反应，则在每种情况下得到两种非对映体，如有需要可将其在式II化合物的阶段或在式I化合物的阶段用已知的方法分离。外消旋的式V化合物与外消旋的式VI化合物反应产生相应的四种异构体的混合物，如有需要可用已知的方法将其分离，例如通过HPLC在尽可能手性分离的材料上分离。
式V化合物在具有基团“-COOR101”的碳原子上有手性中心，通过合成由丙烯酸酯式VII衍生物以其外消旋物的形式获得。具旋光活性化合物原则上可由消旋混合物用本来已知的方法获得，例如通过在手性分离材料上进行色谱分离，或者通过与适宜的光学活性碱例如α-甲基苄胺、辛可尼定或假麻黄碱反应，随后通过将得到的盐分步结晶分离成它们的旋光对映体。
式I化合物及其药理学相容的盐以有益的药理学性质为特征。尤其是，这类物质抑制酶NEP。NEP是一种分解内生的钠尿肽例如心钠素(＝ANP)的酶。由于它们对NEP活性具有抑制作用，这类物质能改善钠尿肽的生物活性和有效寿命，其中钠尿肽能够受到NEP尤其是ANP的攻击，因此它们适于治疗受这类激素作用有利影响的病理学病症，尤其是心血管疾病，特别是心机能不全，尤其是充血性心力衰竭。
在充血性心力衰竭中，由于疾病引起的心脏射血分数降低出现通过反射增加的外周血管阻力。这意味着心肌不得不开始泵血对抗增加的后负荷。这就恶性循环地导致心脏加重的劳损，使得情形更糟。外周阻力增加尤其通过血管活性肽内皮缩血管肽调节(＝ET-1)。内皮缩血管肽是目前已知的最强的内源性血管收缩物质，由前体大内皮素(＝Big-ET-1)产生。根据目前所知，在Big-ET-1至ET-1的转化中多种酶协作，尤其是酶ECE和hSEP(关于这一点，参见例如WO 02/094176)。
在充血性心力衰竭中，由于心输出量降低和外周阻力增加，在肺循环和心脏自身中出现血液反压现象。因此，在心房和心室(auriclesand chambers)的区域出现心肌的壁紧张增加。在这样的情形下，心脏起内分泌器官的作用并分泌尤其是ANP进入血流内。由于它的明显的vasodilatory和利尿钠/利尿活性，ANP致使外周阻力降低且循环血量减少。结果是前负荷和后负荷明显降低。这构成一种内源性的心脏保护机制。这种积极的内源性机制受到限制，因为ANP在血浆中只有很短的半衰期。其原因是该激素被NEP非常迅速地分解。
本发明的化合物能通过抑制ECE的活性同时还抑制hSEP的活性来降低内皮缩血管肽的产生，因而能对抗外周阻力的增加，因此导致心肌劳损的缓解。此外到此的结果表明本发明的物质通过抑制NEP的活性产生更高的ANP水平和ANP延长的作用持续时间。这将导致ANP介导的心脏保护作用的内源性机制增强且给予式I物质在增强利尿/利尿钠的ANP诱导的活性方面的高效性。
NEP不仅与ANP的分解有关而且与内皮缩血管肽的分解有关。由此得出单纯的NEP抑制除导致期望的ANP水平增加之外还导致不利的内皮缩血管肽水平增加。因此，NEP、hSEP和一定比例的ECE抑制的混合将被认为是特别有益，因为它既阻止利尿钠/利尿的ANP分解(通过NEP阻抑)，又同时抑制内皮缩血管肽的生成(通过hSEP和ECE抑制)。因此，积极的影响可施加于单纯的NEP抑制剂附带的不利作用(即不期望的内皮缩血管肽水平的增加)。
式I化合物作为NEP、hSEP的抑制剂和较小的程度上还作为ECE的抑制剂的复合作用特性，使得本发明的化合物显得特别适于预防和/或治疗大哺乳动物尤其是人的病理学病症象诸如心血管病症或疾病的病症或疾病，尤其是心机能不全，包括急性心力衰竭和慢性心力衰竭，特别是充血性心力衰竭；还有高血压，包括如原发性高血压、肾性高血压和/或肺动脉高血压的高血压继发形式；心力衰竭、心绞痛、心脏心律不齐、心肌梗塞、手术期间的心肌梗塞、预后不良的心肌梗塞、心脏肥厚、充血性心肌病、肥厚性梗阻性心肌病、肥厚性非梗阻性心肌病、特发性心肌病、心肌炎、心包炎和/或心内膜炎。式I化合物还可以有利地用于预防或治疗大哺乳动物尤其是人体内心脏中毒剂量的药物引起的心脏损害，尤其是心肌损害，所述药物尤其是细胞抑制剂、优选抑制细胞生长的抗生素或化学制品；腹绞痛、大脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肾病(肾衰竭)、动脉粥样硬化以及结肠直肠癌或前列腺癌的疼痛。
令人惊奇的是式I化合物静脉注射给药后在其血压调节作用尤其是其降血压作用方面好得出奇的有效。
药理学试验方法的说明所举的实施例数与下文中描述的制备实施例有关。
1.物质的NEP抑制作用的体外研究为了证明本发明物质对NEP的抑制作用，在体外标准试验中研究物质对由于NEP的酶活性发生的多肽Mca-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH水解分解的抑制作用。在该试验中，对所测定物质抑制活性的测量为其IC50值。具有酶抑制活性的试验物质的IC50值为试验物质在NEP 50％的酶活性被阻断时的浓度。
试验缓冲液100mM pH 7.0的Tris，250mM NaCl酶可溶性人重组体NEPCrine教授，蒙特利尔大学，加拿大储备溶液100μg/ml，在20mM pH 7.0的Tris中工作溶液用试验缓冲液稀释储备溶液至2μg/ml底物 Mca*-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa**-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH；荧光淬火的Big-ET-1类似物，即经荧光信号可检测的金属蛋白酶尤其是NEP和ECE-1的底物。MCA荧光团的荧光最初由“淬灭剂”Dpa的存在淬灭。
*Mca＝(7-甲氧基香豆素-4-基)**Dpa＝(3-[2，4-二硝基苯基]-L-2，3-二氨基丙酰基)源于Polypeptide Laboratories，Wolfenbüttel，Germany储备溶液 100μm，在试验缓冲液中试验物质 将所有物质溶于DMSO(10mM)并用试验缓冲液稀释至待测浓度。
将70μl试验缓冲液、10μl酶工作溶液和10μl试验物质溶液在Eppendorf容器中混合并在37℃预温育15分钟(＝min)。然后加入10μl底物储备溶液并将该试验批次在37℃温育60分钟。然后通过加热至95℃ 5分钟结束该酶反应。离心(Heraeus Biofuge B，3分钟)后，按照以下说明通过HPLC对液体上清液进行研究。
通过反相HPLC从分解产物中分离出底物(CC 125/4 Nucleosil300/5 C18RP column with CC 8/4 Nucleosil 100/5 C18 precolumn，from Macherey-Nagel，Düren，Germany)。为此，将60μl的试验混合物注入HPLC进样点中，然后以1ml/min的流速用以下梯度洗脱柱子流动相A100％ H2O+0.5M H3PO4pH 2.0流动相B100％乙腈+0.5M H3PO40-2分钟20％ B 8-10分钟60-90％ B2-6分钟20-60％ B 10-13分钟 90％B6-8分钟60％ B 13-15分钟 90-20％ B在214nm的吸收波长328nm的激发波长和393nm的发射波长下对所有的肽进行检测。
在酶裂解肽时，荧光团(＝Mca)和淬灭剂在不同的肽片段终止，这就降低淬灭的有效性。这样导致荧光增加。由于没有淬灭的Mca荧光团引起的肽HPLC峰增加的荧光信号(相应于表面，A)用于进一步的计算。比较有式I的试验物质(＝A抑制剂)和没有式I的试验物质(＝A对照品)的该信号，“％抑制”值基于各自的峰面积按照下式计算％抑制＝100*(1-A抑制剂/A对照品)所有样品进行双份测量并由此计算均值。标准抑制剂(10nM噻吩烷)和溶剂对照(0.1％DMSO)作为每次测试的定性对照进行同样的测量。
在该试验模式中列于表1中的式I试验物质的IC50值如下
表1体外试验物质的NEP抑制作用
2.物质的hSEP抑制作用的体外研究为了证明本发明物质对hSEP的抑制作用，在体外标准试验中研究物质对由于hSEP的酶活性发生的多肽Mca-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH水解分解的抑制作用。在该试验中，对所测定物质抑制活性的测量为其IC50值。具有酶抑制活性的试验物质的IC50值为试验物质在hSEP 50％的酶活性被阻断时的浓度。
试验缓冲液100mM pH 7.0的Tris，250mM NaCl
酶 His6-标记的hSEP外功能域得自Innogenetics，Ghent，比利时储备溶液53mg/ml，在20mM pH 7.2的HEPES、5％甘油、0.005％Tween20、100mM NaCl中，纯度＞99％工作溶液储备溶液用试验缓冲液稀释至10mg/ml底物Mea-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH；荧光淬火的Big-ET-1类似物。
储备溶液100μm，在试缓冲液中得自Polypeptide Laboratories，Wolfenbüttel，德国试验物质将所有物质溶于DMSO(10mM)并用试验缓冲液稀释至待测浓度。
以类似于上述测定试验物质对NEP体外抑制作用的方法进行试验和高压液相色谱操作。10nM磷酸阿米酮作为高压液相色谱法操作中的标准抑制剂。
在该试验模式中列于表2中的式I试验物质的IC50值如下
表2体外试验物质的hSEP抑制作用
3.物质对大鼠体内Big-ET-1生成ET-1的抑制作用的体内研究为了证明本发明物质对Big-ET-1生成ET-1的抑制作用，在体内标准试验中研究试验物质对由于ECE和相关酶如hSEP的酶活性产生的Big-ET-1水解分解为ET-1的抑制作用。ET-1是一种内源性强血管收缩剂。ET-1水平增加导致血压升高。在输注Big-ET-1时，血压升高达到由酶催化Big-ET-1的裂解产生ET-1的程度。作为物质的酶抑制作用的测量，测定它们对由输注Big-ET-1导致的血压升高的抑制作用。
用1ml/kg Rompun/Ketavet 1∶1麻醉大鼠(Sprague-Dawley，CRLD＝Charles River)。将压力传感器(Statham)插入颈动脉中测量血压。一根颈静脉插入导管用于施用物质和另一根用于施用Big-ET-1。在20分钟的静止期之后，给大鼠施用浓度通常为10μmol/kg的相应的式I试验物质或媒介物。五分钟后，将0.5nmol/kgBig-ET-1在一分钟内注入。在施用物质之前或在施用Big-ET之前利用压力传感器以已知的方法分别测量收缩期血压(SAP＝动脉收缩压)和舒张期血压(DAP＝舒张期动脉压)和心率，在各种情况下在施用Big-ET后30分钟期间内每五分钟测量一次。Big-ET引起血压升高的最大值和降低心率的最大值由Big-ET作用发生极限时(通常在5分钟后)的测量值与Big-ET输注之前的测量值之差计算。而且，测定30分钟内在Big-ET-1的影响下的血压曲线的积分(AUC＝曲线下面积)。AUC值提供关于Big-ET作用的或被物质降低的总体程度和持续时间的信息，因此除Big-ET作用的最大值外AUC值还可提供关于物质作用的附加信息，例如在物质不影响、或只轻微地影响Big-ET作用的最大值，但显著加速该作用减退的事件中的附加信息。
与施用媒介物相比较在静脉注射施用试验物质之后Big-ET-1对收缩动脉血压(SAP)影响的最大抑制百分率如下面的表3所示
表3试验物质抗高血压性质的体内研究。
式I化合物也在某种程度上显示出ECE-抑制性质。式I物质的ECE抑制性质可在体外标准试验中得到证实。
式I化合物为双重作用的化合物，它能抑制NEP和hSEP，还适合于预防和/或治疗SD。
在临床上，SD病症分为雌性性功能障碍(FSD)病症和雄性性功能障碍(MSD)病症(参见Melman，A.& Gingell，J.C.(1999).Theepidemiology and pathophysiology of erectile dysfunction.JUrology 1615-11，在下文中引为“Melman等，1999”)。本发明化合物尤其是式I化合物具有能抑制NEP和hSEP的双重作用，尤其对预防和/或治疗MSD(例如雄性勃起机能障碍-MED)有好处。在该适应症方面式I化合物的其它优点是在其作用特性方面还有一定的ECE抑制作用。
MSD通常与勃起机能障碍亦称雄性勃起机能障碍(＝MED)有关(参见Benet，A.E.等(1994)，Male erectile dysfunctionassessment and treatment options.C07Sp.TheY.20669-673)在下文中引为“Benet等1994”)。MED定义为“...不能获得和/或维持满意的性能力的阴茎勃起(参见NIH Consensus Development Panelon Impotence(1993).NIH Consensus Conference Impotence.JA.M.A.27083)...”。据估计在40至70岁的男子中各种程度(轻微的、中度的以及完全的阳萎)的勃起机能障碍(＝ED)的发病率为52％，在高于70岁的男子中比率更高(Melman等，1999)。该病症对患者和他们的配偶的生活质量有明显的负面影响，常常导致焦虑和紧张增加，酿成抑郁症和自尊低落。尽管二十年前，MED被认为主要是心理疾病(Benet等1994)，现在知道大部分患者有根本的器质性的原因。因此，在认识正常的阴茎勃起机理和MED的病理生理学方面已经取得了很多的进展。
能抑制NEP和hSEP的本发明的双重作用化合物，用于治疗FSD，优选治疗雌性性唤起障碍(＝FSAD)。
FSD最好的定义为雌性难以或不能对性表现感到满意。FSD为若干不同的雌性性功能障碍的集合术语(Leiblum，S.R.(1998).Definition and classification of female sexual disorders.Int.J.Impotence Res.，10，S104-S106；Berman，J.R.，Berman，L.&Goldstein，I.(1999).Female sexual dysfunctionIncidence，pathophysiology，evaluations and treatment options.Urology，54，385-391.)。雌性可能缺乏欲望、有唤起或性欲高潮的困难、性交疼痛或这些问题的组合。几种类型的疾病、药物、伤害或心理问题可引起FSD。发展中的治疗目标对准治疗特定亚型的FSD，主要是欲望和唤起障碍。FSD的类别通过将其与正常的雌性性反应阶段欲望、唤起和性欲高潮比较界限分明(Leiblum，S.R.(1998).Definition andclassification of females exual disorders.Int.J.ImpotenceRes.，10，S104-S106)。
欲望或性欲驱动性表现。其表现常常包括当与感兴趣的伴侣一起时或者当接触其它性欲刺激时的性意念。
唤起为血管对性刺激的反应，是生殖器充血的重要的部分，包括增加阴道的润滑、伸展阴道和增加生殖器的感觉/敏感性。
性欲高潮是性紧张的释放，在唤起过程中达于顶点。因此，当在任何这些阶段有不充分的或不满意的反应时出现FSD。
FSD类别包括机能减退的性欲障碍、性唤起障碍、性欲高潮障碍和性交痛障碍。
虽然本发明化合物将改善所述生殖器对性刺激的反应(如在雌性性唤起障碍中)，但这样做时它们还同时可以改善相关的疼痛、与性交有关的痛苦和不适，因此可治疗其它雌性性功能障碍。因此，根据本发明的具体方面，提供本发明的化合物在制备用于治疗或预防机能减退的性欲障碍、性唤起障碍、性欲高潮障碍和性交痛障碍中的用途，更优选用于治疗或预防性唤起障碍、性欲高潮障碍和性交痛障碍，优选治疗或预防性唤起障碍。若雌性没有或几乎没有性的欲望、和没有或几乎没有性意念或幻想，则存在机能减退的性欲障碍。这类FSD可由低的睾酮水平引起，低睾酮水平归因于自然的绝经或外科手术的绝经。其它原因包括疾病、药物、疲劳、抑郁和焦虑。
FSAD表征为对于性刺激不足够的生殖器反应。外生殖器不经历表现正常的性唤起特征的充血。阴道壁不充分地润滑，以致性交疼痛。性欲高潮可能受到阻碍。唤起障碍可由绝经期或产后和哺乳期间雌激素的降低引起，以及由血管部分的疾病如糖尿病和动脉粥样硬化引起。其它原因源于由利尿药、抗组胺药、抗抑郁药例如选择性的5-羟色胺重摄取抑制剂(＝SSRIs)或抗高血压药的治疗。
性交痛障碍(包括性交困难和阴道痉挛)表征为源于侵入的疼痛，并可由降低润滑的药物、子宫内膜异位症、盆腔炎、炎性肠病或泌尿道问题引起。FSD的患病率难以计量，因为该术语包括几种类型的问题，其中一些难以估量，而且因为对治疗FSD的兴趣相对全新。
许多雌性的性问题要么直接与雌性衰老过程有关要么与慢性病如糖尿病和高血压有关。因为FSD包括在性反应周期的各阶段呈现症状的若干亚型，所以没有单一的治疗。
目前FSD的治疗主要集中于心理或关系问题。FSD的治疗逐渐展为更多的临床和基础科学，研究致力于医药问题的研究。雌性性抱怨在病理生理学上并不都是心理上的，尤其是那些可能有促成总体雌性性抱怨的血管性功能障碍(例如FSAD)因素的个体。目前还没有药物被许可用于FSD的治疗。经验的药物疗法包括雌激素给药(局部地或作为激素替代疗法)，雄激素或改变心境的药物如丁螺环酮或曲唑酮。这些治疗方案常常由于低效能或不能接受的副作用不能令人满意。因为在药理学治疗FSD的兴趣相对全新，治疗包括下列心理咨询、非处方的性润滑剂、以及处于研究中的试验对象包括批准用于其它病症的药物。这些药物包括激素治疗剂，睾酮或雌激素与睾酮的组合，以及已经验证在MED方面有效的更新近的血管药物。这些治疗剂当中还没有一个被证实对FSD的治疗有效。
American Psychiatric Association的Diagnostic andStatistical Manual(DSM)IV将FSAD定义为“...持续的或复发的不能获得或维持足够的润滑-性冲动的膨胀反应-直到性活动完成。这种障碍一定产生明显的苦恼或人际关系的困难...”。这种唤起反应包括骨盆血管充血、阴道润滑以及外生殖器的胀大与膨胀。这种障碍会引起明显的苦恼和/或人际关系的困难。调查夫妇性功能障碍的研究表明高达76％的雌性有性功能障碍的抱怨而且在美国30-50％的雌性经受FSD(Berman，J.R.，Berman，L.A.，Werbin，T.J.等(1999).Female sexual dysfunctionAnatomy，physiology，evaluation and treatment options，Curr Opin Urology，9，563-568)。FSAD是一种非常普遍的影响绝经前、绝经期间以及绝经后(激素替代疗法(HRT))雌性的性功能障碍。它与伴随的病症如抑郁症、心血管疾病、糖尿病以及泌尿生殖器的障碍有关。FSAD的初级后果是缺少充血/膨胀、缺少润滑以及缺少快乐的生殖器感觉。FSAD的第二后果是性欲降低、性交过程中疼痛以及难以获得性高潮。最近提出这样的假设至少一定比例的有FSAD症状的患者基于血管(Goldstein等，Int.J.Impot.Res.，10，S84-S90，1998)，有支持该观点的动物数据(Park等，Int.J.Impot.Res.，9，27-37，1997)。
已知SEP抑制剂能增强骨盆神经刺激和血管活性肠肽(＝VIP)诱导的阴道与阴蒂血流的增加。还已知SEP抑制剂能增强VIP和神经-介导的离体阴道壁的松弛。因此本发明是有利的，因为它有助于提供一种恢复正常的性唤起反应-即增加生殖器血流引起阴道、阴蒂和阴唇充血-的方法。这将导致由于血浆渗出的阴道润滑的增强、阴道应变性增加以及生殖器敏感性增加。因此，本发明提供一种恢复、或增强正常的性唤起反应的方法。本文中雌性外生殖器指“由内外组构成的生殖器官。内器官位于骨盆中并由卵巢、输卵管、子宫和阴道组成。外器官位于泌尿生殖膈的浅表和骨盆弓以下。它们包括阴阜、大阴唇和小阴部(minora pudendi)、阴蒂、前庭、前庭球、以及前庭大腺“(Gray′sAnatomy，C.D.Clemente，13th American Edition).R.J.Levin教导到因为“...雄性和雌性外生殖器由共同的组织原基胚胎学发育，雄性和雌性生殖结构被认为是彼此的相应物(homologues)。因此阴蒂为阴茎的相应物，阴囊为阴唇相应物...”(Levin，R.J.(1991)，Exp.Clin.Efzdocrinol.，98，6169)。
关于MSD，尤其是MED，阴茎勃起是血液动力学现象，它依赖于阴茎海绵体平滑肌的收缩和松弛平衡以及阴茎的脉管系统(参见Lerner，S.E.等(1993).A review of erectile dysfunctionnew insightsand more questions.J.Urology 1491246-1255)。本文中阴茎海绵体平滑肌也称为体平滑肌(corporal smooth muscle)或复数意义的海绵体(corpus cavernosa)。阴茎海绵体平滑肌的松弛导致进入阴茎海绵体小梁间隙内的血流增加，使它们对着包围膜膨胀并挤压排放静脉。这样产生阴茎海绵体的血压的巨大升高，导致勃起(参见Naylor，A.M.(1998).Endogenous neurotransmitters mediatingpenile erection.Br.J.Urology 81424-431)，在下文中引为“Naylor，1998”)。在勃起过程中的变化是复杂的，需要高度协调控制，包括外周和中枢神经系统以及内分泌系统(Naylor，1998)。体平滑肌收缩是通过突触后的α-肾上腺素能受体的激活由交感神经去甲肾上腺素能的神经支配调节的。MED可能与海绵体的内源性平滑肌紧张性增加有关。然而，体平滑机的松弛过程部分由非肾上腺素能的、非胆碱能的(＝NANC)神经传递介导。除了一氧化氮(＝NO)外，在阴茎中还发现了许多其它NANC神经递质，如降钙素基因相关肽(＝CGRP)和VIP。担负调节该松驰作用的主要松弛因子为NO，通过氧化氮合酶(＝NOS)由L-精氨酸合成(例如参见Taub，H.C.等(1993).Relationship between contraction and relaxation in human andrabbit corpus cavernosum.Urology 42698-704)。人们认为降低体平滑肌的紧张性可帮助NO诱导海绵体的松驰。在雄性的性唤起过程中，NO从神经元和内皮释放，并与位于平滑肌细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)结合并激活之，导致细胞内的环鸟苷3′，5′-单磷酸(cGMP)水平升高。这种cGMP的升高由于细胞内钙浓度([Ca2+]i)的降低导致海绵体松弛，机理未知，被认为涉及蛋白激酶G激活(可能是由于Ca2+泵和Ca2+激活的K+通道的激活)。
最近已经证明c-型钠尿肽(＝CNP)也可以在MED中起作用，作用于人海绵体组织中表达的膜-结合的鸟苷酸环化酶B(＝GC-B)。GC-B的刺激导致细胞内cGMP增加，并结果导致平滑肌松弛。PDE5-抑制剂，例如昔多芬通过抑制cGMP分解使海绵体中细胞内cGMP增加。PDE5-抑制剂在没有cGMP的刺激物生成的情况下例如在没有NO的情况下是非活性的。该发现表明海绵体中基础的(无刺激的)cGMP生成率相当低，以致在没有伴随刺激鸟苷酸环化酶的情况下通过PDE5抑制剂抑制cGMP的分解对于勃起反应是不够的。通过增加cGMP生成而增加CNP的浓度导致细胞内cGMP的浓度增加。因而，增加海绵体中CNP浓度估计可能与抑制PDE5有相似的作用。由于它们的作用机理不同，即增加cGMP的生成与抑制其分解，抑制PDE5或CNP分解的方法，分别被认为是叠加的，因此可进行合理的假设两种作用机理的组合对于对仅仅施用PDE5抑制剂不起反应的患者将尤其有效。
已经在海绵体的小梁网状结构中发现VIP阳性的神经纤维，表明VIP释放在阴茎勃起中起作用。VIP的作用被认为是通过增加cAMP介导的，因而对于那些cGMP增加治疗剂是一种补充。发现在ED患者中海绵体内注射VIP(与α-肾上腺素能受体拮抗剂酚妥拉明结合)是一种安全有效的治疗，反应率达67％(勃起对于性交是足够的)。
内肽酶NEP和hSEP两者都能降解CNP和VIP，因此能限制CNP和VIP对阴茎海绵体平滑肌的作用。抑制CNP和VIP的分解将导致这些血管松弛因素的增加的有效性从而增加进入海绵体的血流，最终导致勃起功能的改善。这可由家兔的实验数据找到支持在应用NEP抑制剂之后海绵体内压力和雌性的生殖器官血流明显增加(参见文献WO02/079143)。此外，还发现在大鼠神经原性勃起机能障碍模型中编码内源性NEP抑制剂sialorphine的前肽的基因(SMR1)(参见UserH.M.，Zelner D.J.，McKenna K.E.，McVary K.T.(2003).Microarrayanalysis and description of SMR1 gene in rat penis in apost-radical prostatectomy model of erectile dysfunction.JUrol.；170(1)298-301)被明显地向下调节(＞80倍)，这表明在该疾病中NEP活性可能被增强且促进勃起机能障碍的发展。
药理学试验方法的说明所举的实施例数与下文中描述的制备实施例有关。
按照下述方案在酶体外试验中测量根据本发明所用的化合物对酶促分解CNP和VIP的抑制酶a)hSEP(sol hu)(his)6；或His6-标记的hSEP外功能域。
储备溶液53μg/ml，在20mM pH 7.2的HEPES、5％甘油、0.005％Tween20、100mM NaCl中，纯度＞99％工作溶液储备溶液用试验缓冲液稀释至5μg/ml供应商Innogenetics，Ghent，比利时，蛋白的制备和纯化按照WO 02/094176中的描述进行。
b)NEP(由猪肾皮层制备)储备溶液120μg/ml，在20mM bisTris中，纯度＞95％工作溶液储备溶液用试验缓冲液稀释至5μg/ml供应者Philippe Crine博士，蒙特利尔大学，加拿大底物a)VIPb)CNP(32-53)储备溶液100μm，在试验缓冲液中供应者Bachem，Weil am Rhein，德国试验缓冲液100mM pH 7.0的Tris，250mM NaCl将所有试验化合物溶于DMSO中，浓度为10mM，用试验缓冲液进一步稀释。
活性测定步骤将80μl的试验缓冲液、10μl的酶工作溶液(NEP或hSEP)和10μl的肽储备溶液(VIP或CNP)在Eppendorf管形瓶中混合并于37℃温育120分钟。随后通过加热至95℃ 5分钟终止该酶促反应。离心后(Heraeus Biofuge B，3分钟)将上清液进行HPLC。
抑制试验步骤将70μl的试验缓冲液、10μl的酶工作溶液(NEP或hSEP)和10μl的试验化合物溶液在Eppendorf管形瓶中混合并于37℃预温育15分钟。然后，加入10μl的肽储备溶液(VIP或CNP)并将反应混合物于37℃温育60分钟以使其酶水解。随后通过加热至95℃5分钟终止该酶促反应。离心后(Heraeus Biofuge B、3分钟)将上清液进行HPLC。
为了使剩余的底物从裂解产物中分离，应用反相HPLC技术，CC125/4 Nucleosil 300/5 C18RP柱和CC 8/4 Nucleosil 100/5 C18前置柱(Macherey-Nagel，Düren，德国)。将60μl的反应试样注入到HPLC中并将柱子以1ml/min的流速用下列梯度洗脱溶液A100％H2O+0.5M H3PO4 pH 2.0溶液B100％乙腈+0.5M H3PO40-2min5％ B 8-10min90％ B2-7min5-50％ B10-12min90-5％ B7-8min50-90％ B所有肽于214nm的吸收波长下(紫外光谱法)检测。
水解百分率(＝％)基于含试样Y的酶相关于含相同浓度的肽但不含酶(空白)的试样中未降解肽的峰面积通过下列公式计算％水解＝100*(空白-Y)抑制百分率基于对比含试样X的抑制剂与只含肽(空白)或肽和酶但不含抑制剂(对照)中未降解肽(VIP或CNP)的峰面积按照下列公式计算％抑制＝100*(X-对照)/(空白-对照)所有样品进行双份测量并采用平均值。将对照溶剂(0.1％DMSO)加入到每份试验中。
CNP和VIP被NEP和hSEP体外裂解。两种肽的分解用hSEP比用NEP快，如下面的表4所示
表4NEP或hSEP分解VIP和CNP的速度
本发明的试验化合物能阻止NEP和SEP降解CNP和VIP。在该试验模式中列于表5中的式I试验物质的IC50值如下表5试验化合物阻止CNP和VIP的降解
式I化合物还适于预防和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症。
所述病症例如神经变性病症如缺血性发作、脑缺血、外伤性脑损伤、急性播散性脑脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、视网膜色素变性、轻微的认知缺损、阿尔茨海默氏病、皮克病、老年痴呆、进行性核上性麻痹、皮层下痴呆、威尔逊病、多发性梗塞疾病、动脉硬化性痴呆、爱滋病相关性痴呆、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、运动失调性毛细血管扩张症、癫痫相关性脑损害、脊髓损伤、多动腿综合征、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏病、纹状体黑质变性、脑血管炎、线粒体脑肌病(encephalomyopathies)、神经元蜡样脂褐质沉积症、脊椎肌肉萎缩、与中枢神经系统相关的溶酶体贮藏妨碍、脑白质营养不良、尿素循环缺损病症、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、卟啉病、细菌或病毒性脑膜炎和脑膜脑炎、朊病毒病、神经毒性化合物的中毒、格-巴二氏综合征、慢性炎性神经病、多肌炎、皮肌炎、辐射引起的脑损害；胃肠道病症如肠应激性疾病和炎性肠疾病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、腹部疾病、幽门螺旋杆菌胃炎及其它感染性胃炎(gastritides)、坏死性小肠结肠炎、假膜性小肠结肠炎、辐射引起的小肠结肠炎、淋巴细胞性胃炎、移植物抗宿主病、急性和慢性胰腺炎；肝病如酒精性肝炎、病毒性肝炎、代谢性肝炎、自身免疫性肝炎、辐射引起的肝炎、肝硬化、溶血尿毒症综合征、肾小球肾炎、狼疮肾炎、病毒病如暴发型肝炎；关节疾病如创伤和骨关节炎；免疫抑制或免疫缺陷，尤其是自身免疫性疾病如特发性炎性肌病、慢性中性粒细胞减少症、血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血综合征、抗磷脂抗体综合征、心肌炎、多发性硬化症及其诊断次级分类复发-反复的(relapsing-remitting)多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、原发性进行性多发性硬化症、进行性复发的多发性硬化症、急性多发性硬化症、良性复发的多发性硬化症或无症状的多发性硬化症、视神经脊髓炎(德维克氏综合征)、淋巴细胞性垂体炎、格雷夫斯氏病、阿狄森氏病、甲状旁腺功能减退症、I型糖尿病、全身性红斑狼疮、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、银屑病关节炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性勃起机能障碍、结节病、韦格内氏肉芽肿病、自身免疫性耳聋、斯耶格伦氏病、自身免疫性色素层视网膜炎(uveoretinitis)、间质性膀胱炎、肾小球肾炎咯血综合征以及纤维肌痛；脊髓发育不良如再生障碍性贫血；皮肤学疾病包括寻常型天疱疮(pemphigous vulgaris)、皮肌炎、特应性皮炎、亨-舍二氏紫癜、痤疮、全身性硬化症、脂溢性(seborrhoeic)角化病、皮肤肥大细胞增生病、慢性增生性皮炎、角化不良、硬皮病、间质性肉芽肿皮炎、银屑病、皮肤细菌性感染、皮肤真菌病、麻风、皮肤利什曼病、白癜风、中毒性表皮坏死松解症、渗出性多形性红斑、皮脂腺腺瘤、脱发、皮肤光致损伤、硬化性苔癣、急性皮肤创伤、色素失调症、皮肤热损伤、发疹性脓疱病、苔癣样皮肤病、皮肤变应性脉管炎、细胞毒性皮炎；内耳的疾病如声创伤引起的听毛细胞死亡和听力损失、氨基苷引起的听毛细胞死亡和听力损失、耳毒性药物引起的听力损失、外淋巴瘘、胆脂瘤、耳蜗或前庭缺血、梅尼尔氏病、辐射引起的听力损失、细菌或病毒感染引起的听力损失和原发性听力损失；移植移植物抗宿主病，心脏、肺、肾、皮肤、角膜、骨髓或肝移植的急性和慢性排斥；伤口愈合以及组织排斥。
式I的酰胺甲基取代的1-(羧烷基)-环戊基羰基氨基-苯并氮杂-N-乙酸衍生物用于预防和治疗所述的与细胞凋亡有关的不良病症的有效性可以在预测抗细胞凋亡活性的适宜的动物模型中得到证实。
药理试验方法的说明所引用的实施例数目与以下描述的制备实施例有关。
1.创伤性脑损伤延缓的细胞凋亡性神经元死亡挫伤装置挫伤装置由不锈钢管构成，长40cm，每间隔1cm有穿孔防止管中的空气压缩。腹腔注射水合氯醛400mg/kg使230-270g的成年Wistar大鼠麻醉，在右大脑半球切开颅骨，停放在硬膜表面上的踏板(footplate)上的指引落锤装置与颅表面垂直放置，选择20g重量生成的380g×cm力以产生脑挫伤。允许脑表面最大2.5mm凹陷以避免硬膜机械刺穿。踏板的中心立体定位于前囟点后面1.5mm和侧面2.5mm。在脑损伤后用在磷酸盐缓冲液中含4％低聚甲醛的溶液灌流固定大鼠3天。
脑室内注射化合物通过Hamilton注射器脑室内(＝i.c.v)施用5-15μl。注射在创伤15分钟-8小时后在5分钟内，使用下列立体定位座标相对于前囱点AP＝-0.5mm，L＝-2mm且V＝-5.5(Swanson，L.W.(1992)Brain MapsStructure of the Rat Brain，Elsevier，Amsterdam)。
海马内的形态测定分析在外伤性损伤三天后以立体学地于5种不同的rostrocaudal水平延伸10.21至11.21mm(Swanson，L.W.(1992)Brain MapsStructure of the Rat Brain，Elsevier，Amsterdam)及其整个中侧轴通过立体学测定海马CA3亚区(subfield)的损伤。为了定量地确定海马中的神经元损失，使用立体学disector技术(Cruz-Orive，L.M.& Weibel E.R.(1990)Am.J.Physiol.258，L148-L156)估算锥体细胞(pyramidal neurons)的数密度(Nv)。使用无偏计数架(unbiased counting frame)(0.05mm×0.05mm；disector高0.01mm)和大孔径的物镜(x40)用于取样。正常的神经元通过典型的具有清楚的核质和被含尼氏体(Nisslsubstance)胞质包围的清晰的核仁的细胞核的存在而鉴别。在CA2和CA3亚区之间的边界被认为是CA3区的大锥体细胞疏松排列的大锥体细胞进入浓密地填充的锥体细胞的位置。连接齿状颗粒细胞层侧端的任意线被认为是CA3区和CA4之间的接界。
在该试验模型中实施例3的试验物质引起剂量依赖的神经保护作用。当实施例3的试验物质在创伤最多8小时后脑室内施用神经保护作用还是明显的测量实施例3的试验物质当创伤后15分钟脑室内施用于成年Wistar大鼠的神经保护作用的剂量反应。按照该方法中的描述测定CA3海马亚区中的神经元密度。在6种立体定向(stereotactic)水平测量在媒介物处理的大鼠的未创伤左侧和在媒介物处理的大鼠的经创伤的右侧和用实施例3试验物质处理的大鼠中的CA3神经元密度±测量标准误差(＝SEM)，结果列在下面的表6中。
在所有的下表中数(“n”)在使用的情况下表示每组大鼠的数目。
表6CA3海马区的神经元密度，细胞×103/mm3
注射媒介物导致CA3海马区中神经元的密度降低至对照值的最多35％，而注射3、10或30μg实施例3的试验物质则部分阻止海马区神经元的损失，10μg的剂量最有效。方差分析(“ANOVA”)表明实施例3的试验物质的所有三个试验剂量对CA3海马区中神经元的损失都有显著的治疗保护作用(P＜0.001；每组n＝10)。方差分析还表明10μg的剂量比3μg或30μg的剂量带来明显好的神经保护作用。
测量实施例3的试验物质当创伤后2、4或8小时脑室内施用于成年Wistar大鼠的神经保护作用的时窗。按照该方法中的描述测定CA3海马亚区中的神经元密度。测量用媒介物或者实施例3的试验化合物处理的大鼠创伤右侧中6种立体定向水平的CA3神经元密度±SEM，结果列在下面的表7中。
表7CA3海马区的神经元密度，细胞×103/mm3
注射媒介物导致在CA3海马区中神经元的密度降低最多至对照值的35％。脑室内注射10μg实施例3的试验物质部分阻止海马神经元的损失。方差分析(“ANOVA”)表明实施例3的试验物质的三个时点对CA3海马区中神经元的损失都有显著的治疗作用(在2和4小时时P＜0.001，8小时时p＜0.01)。
2.阿霉素毒性抗细胞凋亡活性的测定将重200-250g的Wistar大鼠用水合氯醛，400mg/kg麻醉，皮下植入Alzet渗透微泵(2ML1)(＝s.c.)。在植入之前，该泵装入媒介物或含适宜浓度的本发明化合物并进行预处理(primed)。动物随后在第1、2和3天接受三次同等日剂量的阿霉素，每日剂量为腹腔注射5mg/kg。第一次注射阿霉素5天后对大鼠施无痛死，并用在磷酸盐缓冲液中含4％低聚甲醛的溶液穿贲门地(transcardially)灌注。随后切掉心、肝和肾并包埋于石蜡(parafin)中。
TUNEL染色为了基于脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)的组织分析，将器官在4℃后固定(post-fixed)5天并以石蜡包埋。按照厂商的说明用ApopTag过氧化物酶试剂盒(S 7100，Oncor Appligene，Heidelberg，德国)在10μm厚的石蜡切片上进行TUNEL染色。简单地说，在用蛋白酶K预处理和内源性过氧化物酶淬火(quenching)后，将切片在平衡缓冲液中温育，继之以工作强度(working strength)TdT酶温育(将异羟洋地黄毒苷配基标记的dUTP核苷酸并入游离的3′-OH DNA末端)，(1小时，37℃)。切片在终止缓冲液/洗涤缓冲液中温育(30分钟37℃)，然后用抗异羟洋地黄毒苷配基-过氧化物酶缀合物温育(30分钟)，继之以DAB底物(Sigma，Deisenhofen，德国)温育，并用甲基绿淡淡地复染。
在该试验模型中实施例4试验物质在心、肝和肾中给予显著的针对阿霉素毒性的保护，其显著地降低三个器官中TUNEL阳性细胞的密度。该作用是剂量依赖性的，100mg/kg和天的剂量是最有效的给Wistar大鼠以15mg/kg腹腔注射的累积剂量施用阿霉素。将实施例4的试验物质以20、50或100mg/kg和天的剂量通过Alzet渗透微泵在5天内皮下施用。对动物施无痛死和在第一次注射阿霉素5天后穿贲门地灌注，并对心、肾和肝进行处理用于TUNEL染色。按照该方法中的描述测定TUNEL阳性细胞的密度。对于对照组和不同的试验组(20、50或100mg/kg和天的实施例4的试验化合物)测量各器官(心脏、肝、肾)TUNEL阳性细胞的平均密度±SEM并列在下面的表8中。
表8TUNEL阳性的细胞/mm3×102
实施例4的试验物质在所有三个器官中呈剂量依赖性地降低阿霉素的细胞毒性作用。通过Student′s检验在各组之间进行比较(**P＜0.01；***P＜0.001和媒介物处理的大鼠对比)。
本发明还提供一种治疗或预防哺乳动物和人的心血管病症或疾病和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症的方法，包括给需要其的对象施用有效量的式I化合物。
本发明进一步提供一种治疗或预防哺乳动物和人的性功能障碍的方法，包括给需要其的对象施用有效量的具有能抑制NEP和hSEP的双重作用的化合物，尤其是本发明的式I化合物。
式I化合物可以以常规的药物组合物给药。使用的剂量可以随个体而变化，并将根据所治疗病症的种类以及所用的物质而当然地变化。不过，具有含量为0.2至500mg的活性物质、尤其是每个个体10至200mg的活性物质的医药形式适合于给人以及大的哺乳动物给药。本发明的治疗剂还可以通过静脉输注给药，剂量很可能为0.001-10mg/kg/小时。上述剂量为平均情况的示例。根据本发明，化合物可以连同常规的药物助剂和/或赋形剂一起含在固体或液体药物组合物中。固体药物组合物的实例为口服给药的组合物，如片剂、包衣片剂、胶囊、粉剂或颗粒剂、或栓剂。除常规的药物辅料例如润滑剂或片剂崩解剂之外，这些药物组合物可以含常规的药用的无机和/或有机赋形剂，如滑石粉、乳糖或淀粉。液体药物组合物如活性物质的混悬液或乳剂可以含常规的稀释剂如水、油和/或悬浮剂如聚乙二醇等。另外还可以加入其它的辅料，如防腐剂、矫味剂等。
活性物质可以与药物助剂和/或赋形剂用已知的方法混合和配制。关于固体剂型的制备，活性物质可以例如与辅料和/或赋形剂按常规的方法混合，可以湿制粒或干制粒。颗粒剂或粉剂可以直接装入胶囊或用常规的方法压制成片剂芯。如有需要可以用已知的方法进行包衣。
以下实施例是用来是进一步说明本发明，而不限制其范围。
采用以下方法测质谱HPLC-MS与LC200泵(PE)偶联的API100 Quadrupol质谱仪(PEApplied Biosystems)电喷射电离，阳性模式。扫描范围m/z 100至1000。软件MassChrom 1.2。Xterra柱(4.6mm×50mm，2.5μm).
溶剂系统水(10mM乙酸铵，pH 5)和乙腈，在10分钟内线性梯度5％乙腈到95％。
实施例12-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸乙酯； A)将91.9ml苯甲醇加入到99.07g衣康酸酐中并将混合物在65℃下搅拌8小时(＝h)。将冷却产生的晶体用35ml正己烷/乙醚2∶1(v/v)的混合物制成浆液然后从溶剂中滤出。将所得粗品在温热的条件下溶于150ml乙醚中，并通过添加80ml正己烷再结晶。将合并的母碱液(lyes)浓缩(reduced)，以相当于上述的方法重结晶，最后将得到的晶体加入到主量中。得到120g 2-[(2-苄氧基)-2-氧代乙基]丙烯酸不需进一步纯化直接用于下一步反应，1H-NMR(CDCl3)7.35，m，[5]；6.47，s，[1]；5.83，s，[1]；5.15，s，[2]；3.40，s，[2]ppm。
B)将上述得到的100g的2-[(2-苄氧基)-2-氧代乙基]丙烯酸悬浮在100ml甲基-叔丁基醚(＝MTBE)中并将0.5ml吡啶加入其中。向其中滴加47ml亚硫酰氯并将所得混合物在回流下加热1.5h冷却至沸腾。冷却至室温，减压蒸发至近乎干燥。将所得残留物溶于50ml二氯甲烷中并在0-5℃下滴加至由16ml乙醇和36.5ml三乙胺在150ml二氯甲烷内组成的接受溶液中。一旦滴加完毕，在大约0℃下连续搅拌1小时。然后用水连续洗两次，每次250ml水，用100ml稀碳酸氢钠水溶液洗一次，最后用饱和食盐水溶液洗一次。有机相经硫酸钠干燥并尽可能在减压下蒸干。在0.015mbar和150℃下蒸馏所得残留物得到56.3g 2-亚甲基琥珀酸-4-苄基酯-1-乙基酯，其不需进一步纯化或鉴定直接用于下一步反应。
C)将118ml二异丙胺在氮气氛下溶于3L无水四氢呋喃(＝THF)中并将溶液为冷却至0℃。将340ml 2.5M正丁基锂的正己烷溶液加入到该接受溶液中，一旦加入完毕在0℃下再继续搅拌45分钟。然后将45g环戊烷羧酸在100ml无水THF中的溶液在0-5℃下滴入所得混合物中，然后将混合物在0℃下搅拌2小时。将其冷却至-80℃，并向其中滴加上述得到的72.6g的2-亚甲基琥珀酸-4-苄基酯-1-乙基酯(若干批次的总量)在100ml THF中的溶液。在-75℃下搅拌2小时然后加入1.5L的2N盐酸水溶液。在融化和相分离后，将水相用乙酸乙酯(＝EA)萃取两次，合并有机相并经硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂并在0.02mbar和140℃下通过蒸馏分离出挥发物质。蒸馏后剩余的残留物在硅胶上层析(流动相EA/正己烷1∶6至1∶7 v/v)得到22.8g 1-[4-(苄氧基)-2-(乙氧羰基)-4-氧代丁基]环戊烷羧酸；1H-NMR(CDCl3)7.33，m，[5]；5.10，s，[2]；4.04，m，[2]；2.88，m，[1]；2.80-2.48，AB-Q.，[2]；2.2-2.1，m，[2]；1.7-1.4，m，[6]；1.20，tr，[3]。
D)将上述得到的49.5g的1-[4-(苄氧基)-2-(乙氧羰基)-4-氧代丁基]环戊烷羧酸(若干批次的总量)溶于435ml二氯甲烷中。将39.5g叔丁基-[(3S)-3-氨基-2-氧代-2，3，4，5-四氢)-1H-苯并氮杂-1-基]乙酸酯(关于其制备参见EP 0 733 642 A1)、18.3g羟基苯并三唑和60ml吗啉加入到该接受溶液中。然后将52gEDC×HCl加入到一部分所得混合物中并在室温下搅拌过夜。然后减压蒸发溶剂并将剩余的残留物在750ml EA中处理。有机相用每次100ml的2N盐酸水溶液连续洗两次，用每次100ml的水洗两次，用100ml饱和食盐水溶液洗一次并经硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂并将剩余的残留物在油泵真空(5×10-2mbar)中干燥得到87.9g淡黄色的油2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸-4-苄基酯-1-乙基酯，其不需进一步纯化或鉴定用于随后的反应。
E)将上述得到的87.9g 2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸-4-苄基酯-1-乙基酯溶于600ml乙酸乙酯(＝EA)中并向其中加入20g活性碳上载的钯(＝Pd/C)。在1 bar的氢气压力下使其氢化2小时，然后将反应混合物经Cellite过滤。随后用1.5L EA洗涤滤饼并将合并的有机相在减压下大量蒸发。将残留物在500ml EA/环己烷(1∶1，v/v)中吸收，并用半饱和Na2CO3溶液萃取两次，每次200ml。水相用浓KHSO4溶液酸化，并用EA萃取3次，每次200ml。经硫酸钠干燥后，减压蒸发。将剩余的残留物在油泵真空中干燥得到71g白色泡沫物3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-甲氧基-4-氧代丁酸，1H-NMR(CDCl3)7.31-7.17，m，[3]；7.11，d，
；7.08，d，
；6.81，d，
；6.73，d，
。
如有需要可以将如此得到的中间产物通过制备型高压液相色谱(＝HPLC)分离成非对映体纯的组分。将上述得到的70g的中间产物采用下述方法分离柱LC80-1，23.4×8cm；固定相740g ChiralpakAD，20μ；流动相庚烷/异丙醇(85∶15)；UV检测；周期时间(cycle time)45分钟；分析固定相Chiralpak AD，20μ；流动相庚烷/异丙醇9∶1(v/v)，流速2ml/分钟；周期时间15分钟。
保留时间为11.6分钟时，得到30g第一立体异构体，(3″rel1″)-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-乙氧基-4-氧代丁酸，根据含基团-COOR1的手性中心“*Ca”以″rel1″符号表示，1H-NMR(CDCl3)7.31-7.18，m，[3]；7.09，d，[1]；6.74，d，[1]；4.53，4.48，4.37，4.32，AB-Q.，[2]；4.48，m，[1]；4.11，m，[1]。
保留时间为6.5分钟时，得到33g第二立体异构体，(3″rel2″)-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]乙基}-4-乙氧基-4-氧代丁酸，根据含基团-COOR1的手性中心“*Ca”以符号″rel2″表示，1H-NMR(CDCl3)7.31-7.17，m，[3]；7.11，d，[2]；6.81，d，[1]；4.60，4.56，4.35，4.31，AB-Q.[2]；4.48，m，[1]；4.10，m，[1]；[α]D＝-136°(1％甲醇中)。
F)将上述得到的4g 3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-乙氧基-4-氧代丁酸溶于15ml二氯甲烷中。在该接受溶液冷却至0℃后，向其中相继缓缓滴加1.12ml三乙胺和0.77ml氯甲酸乙酯，并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后向其中加入0.94ml的异丙胺并在0℃下再继续搅拌3h。在减压下大量蒸发溶剂并将剩余的残留物在100ml EA中吸收。有机相用50ml饱和KHSO4水溶液和饱和食盐水溶液依次各洗一次，经硫酸钠干燥并在减压下大量蒸发溶剂。将剩余的残留物在油泵真空中干燥得到4.29g淡黄色的油的标题化合物，MS[M+H]+586；m/z530；484；425。
实施例22-{[(3S)-1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸
将上述得到的9.97g 2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸乙酯在1E)条件下溶于200ml水/乙醇的混合物(1∶1 v/v)中，并向其中加入6.64g NaOH固体，边加边搅拌。继续搅拌过夜，然后在减压下大量蒸发溶剂并将剩余的残留物在100ml EA中吸收。水相用饱和KHSO4水溶液中和，并用EA萃取三次。合并的有机相用100ml饱和食盐水溶液洗涤并经硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，并在油泵真空中干燥剩余的残留物得到5.59g的标题化合物。
实施例3(2″rel1″)-2-{[(3S)-1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸 将在上述实施例2)中得到的400mg非对映体混合物按照下述操作通过高效液相色谱分离柱LC80-1，25×8cm；固定相ChiralpakAD，20μ；流动相庚烷/异丙醇85∶15(v/v)+0.1％v/v三氟乙酸(＝TFA)；UV检测；流速1ml/min；周期时间15分钟；分析柱DAICEL Chiralpak AD；长度250mm；直径4.6mm；流动相正庚烷800ml，2-丙醇200ml，TFA 2ml；流速0.8ml/min；分析时间30分钟。
保留时间为13.5分钟时，在这些条件下得到130mg呈白色固体的第一立体异构体(＝标题化合物)，根据含基团“-COOR1”的手性中心“*Ca”以符号″rell″表示，使其从EE中沉淀出；1H-NMR(甲醇)7.37-7.2，m，[4]；4.76，4.71，4.43，4.38，AB Q.；4.4，m，[1]；3.90，m，[1]；3.40，m，[1]；2.22-2.60，m，[2]；2.48-2.0，m，[12]；1.10，d，[6]；[α]D＝-90°(0.5％甲醇中)；Mp.145℃。
保留时间为16.2分钟时，在这些条件下得到呈白色固体的第二立体异构体，根据含基团“-COOR1”的手性中心“*Ca”以符号“rel2”表示。
实施例4{(3S)-3-[({1-[(2″rel1″)-2-乙氧羰基)-4-(异丙氨基)-4-氧代丁基]环戊基}-羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸 将4.29g(2″rel1″)-2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代-丁酸乙酯(制备类似于实施例1，但用通过HPLC分离得到的(3″rel1″)-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-乙氧基-4-氧代丁酸作为1E)阶段的中间产物)，溶于30ml二氯甲烷中并加入17ml的TFA。将混合物静置过夜并减压蒸发溶剂和过量的TFA。将剩余的残留物在100ml EA中吸收，并有机相用水洗涤直到其变为pH中性。有机相经硫酸钠干燥然后将溶剂在减压下大量蒸发。向残留物中加入甲苯两次，每次30ml，再次减压蒸发混合物。将剩余的残留物在油泵真空中干燥得到2.8g白色泡沫物的标题化合物；1H-NMR(CDCl3)7.33，m，[4]；6.82，d，[1]；5.86，d，[1]；4.64，m，[1]；4.54，4.50，4.46，4.42，AB-Q.；3.20，m，[1]；1.23，[3]；1.09，[6]；[α]D-155°(1％甲醇中)。
实施例5(2″rel1″)-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸乙酯 将4.2g(3″rel1″)-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-乙氧基-4-氧代丁酸(按照实施例1E)的方法制备非对映体混合物并随后通过HPLC分离非对映体)溶于30ml二氯甲烷中。将1.17ml 3-氨基-1-丙醇、235mg二甲氨基吡啶和1.61g EDC加入到该接受溶液中，边加边搅拌。1h后，在减压下大量蒸发混合物，将剩余的残留物在100ml EA中吸收，并将有机相用每次30ml稀KHSO4水溶液振摇两次。有机相用每次30ml饱和食盐水溶液洗两次以上，经硫酸钠干燥然后在减压下大量蒸发溶剂。将剩余的残留物在油泵真空中干燥得到4g呈白色泡沫树脂的标题化合物，MS[M+H]+602；m/z546，500，425；1H-NMR(CDCl3)7.32-7.18，m，[3]；7.12，d，[2]；6.63，d，[1]；6.49，tr，[1]；4.57，4.63，4.34，4.30，AB-Q.[2]；4.51，m，[1]；4.11，m，[2]；3.57，tr，[2]。
实施例6(2″rel1″)-4-{[3-(乙酰氧基)丙基]氨基}-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸乙酯 将以上在实施例5中得到的1g(2″rel1″)-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基]}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基-4-氧代丁酸乙酯溶于20ml二氯甲烷中，并向其中加入340μl乙酰氯。90分钟后，在减压下大量蒸发溶剂，将剩余的残留物在20ml EA中吸收并用10ml稀碳酸氢钠水溶液洗涤。然后将其经硫酸镁干燥，在减压下大量蒸发溶剂，并将剩余的残留物在硅胶上色谱分离(流动相EA/正己烷7∶3v/v)。将产物级分在油泵真空中干燥(5×10-2mbar)得到920g呈无色油的标题化合物；MS[M+H]644；m/z588，542，482，425。
实施例7{(3″rel1″)-3-[({1-[(2S)-4-{[3-(乙酰氧基)丙基]氨基}-2-(乙氧羰基)-4-氧代丁基]环戊基}羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸 将929mg在以上实施例6中得到的(2″rel1″)-4-{[3-(乙酰氧基)丙基]氨基}-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸乙酯溶于10ml二氯甲烷中，并向其中加入2.2ml TFA。将混合物静置过夜，然后在减压下大量蒸发溶剂并将剩余的残留物在30ml EA中吸收。有机相用水洗涤直到其变为pH中性，再次在减压下大量蒸发，并将剩余的残留物用每次10ml甲苯排气(fumed off)两次。得到750mg白色泡沫树脂的标题化合物，MS[M+H]588；m/z542，482，425；1H-NMR(CDCl3)7.33-7.14，m，[4]；6.67，d，[1]；6.59，tr，[1]；4.69，4.64，4.35，4.30，AB-Q.，[2]；4.63，m，[1]；4.17，m，[1]；4.09，q，[2]；3.33，m，[1]；3.15，m，[2]。
实施例8((3S)-3-{[(1-{(2″rel1″)-2-乙氧羰基)-4-[(3-羟丙基)氨基-4-氧代丁基]环戊基}-羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸 依照以上实施例4中所述的方法将580mg(2″rell″)-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基]}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基-4-氧代丁酸乙酯(制备参见实施例5)与TFA反应。在通过柱层析将所得粗品纯化(固定相硅胶；流动相EA/甲醇9∶1(v/v))后，得到240mg无色树脂的标题化合物，1H-NMR(CDCl3)7.34-7.15，m，[4]；6.76，tr，[1]；6.61，d，[1]；4.75，4.71，4.20，4.16，AB-Q.，[2]；4.57，m，[1]；4.09，q，[2]；MS[M+H]+546；[α]D＝-112.5°(1％甲醇中)。
实施例92-{[1-({[(3S)-1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸 将6.43g(2S)-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸乙酯(制备参见实施例5)溶于140ml水和乙醇1∶1(v/v)的混合物中，并向其中加入4.28g NaOH固体，边加边搅拌。15h后，减压蒸发溶剂，将残留物在100ml EA中吸收并用50ml KHSO4水溶液洗一次。水相用每次30ml的EA萃取两次。合并的有机相用每次30ml的饱和食盐水溶液洗两次，并经硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到5.41g的标题化合物。
实施例10(2″rel1″)-2-{[1-({[(3S)-1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸 将在上述实施例9中得到的800mg异构体混合物按照下述操作通过制备型高压液相色谱分离固定相Nucleosil 100-10；柱长250mm；直径为20mm；流速8ml/分钟；流动相正庚烷(800ml)，2-丙醇(200ml)，TFA(1ml)；分析固定相EC 250/4 Nucleosil 100-10；柱长250ml，直径为4mm，流速1.5ml/min；流动相正庚烷(800ml)，2-丙醇(200ml)，TFA(1ml)。
保留时间为7.89分钟时，在这些条件下得到200mg的第一立体异构体(＝标题化合物)，根据含基团“-COOR1”的手性中心“*Ca”以符号″rel1″表示，1H-NMR(CD3OD)7.38，m，[4]；4.78，4.73，4.43，4.38，AB-Q.，[2]；4.41，m，[1]；3.93，m，[1]；3.56，tr[2]；3.40，m，[1]；3.31，m，[1]；3.22，m，[2]；2.78，m，[1]；2.65，m，[1]。
保留时间为4.47分钟时，在这些条件下得到第二立体异构体，根据含基团“-COOR1”的手性中心“*Ca”以符号“rel2”表示。
实施例112-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸
将以上按照实施例9得到的800mg的2-{[1-({[(3S)-1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸(异构体混合物)溶于15ml二甲基甲酰胺(＝DMF)中。将302.5mg Cs2CO3和169mg乙基溴在室温下加入到该接受溶液中，边加边搅拌。在搅拌过夜后，将其用42ml水和21ml二氨甲烷稀释并将水相用二氯甲烷萃取。在减压下大量蒸发溶剂，并将剩余的残留物色谱分离(固定相硅胶，流动相EA(100％)-EE/MeOH 7∶3(v/v))。将产物级分在油泵真空(5×10-2mbar)中干燥得到241g泡沫树脂的标题化合物，MS[M+H]+546；m/z453，425，379；1H-NMR(CDCl3)7.34-7.1，m，[4]；4.82，4.77，4.34，4.29，AB-Q-.[2]；3.62，m，[2]；3.37，m，[3]。
实施例122-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸 将2.6g 2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸乙酯(制备参见实施例1)溶于52ml乙醇中。将710mg固体NaOH在52ml水中的溶液加入到该接受溶液中。30分钟后，用稀KHSO4水溶液将其酸化至约pH 2，并将水相用每次50ml的EA萃取三次。合并的有机相经硫酸镁干燥，在减压下大量蒸发溶剂，并将剩余的残留物在硅胶上色谱分离(流动相EA/环己烷2∶1v/v)。将产物级分在油泵真空中干燥(5×10-2mbar)得到2.2g白色泡沫树脂的标题化合物，MS[M+H]+558；m/z502，425，397，323。
实施例134-氯苄基-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸酯 将上述得到的300mg 2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸溶于5ml二氯甲烷中。向其中加入33mg的4-二甲氨基吡啶(＝DMAP)、85mg 4-氯苄基醇和124mgEDCxHCl，然后搅拌过夜。混合物用5ml二氯甲烷稀释，并将有机相依次用2ml稀KHSO4水溶液和饱和食盐水溶液各洗一次。有机相经硫酸镁干燥，在减压下基本上蒸干溶剂，并将剩余的残留物在硅胶上色谱分离(流动相EA/环己烷3∶2 v/v)。将产物级分在油泵真空中干燥(5×10-2mbar)得到320g白色泡沫的标题化合物；MS[M+H]+682/684；m/z626/628，576，484，425.
实施例14{(3S)-3-[({1-[2-{[(4-氯苄基)氧基]羰基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁基]环戊基}羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸
将318g上述得到的4-氯苄基-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸酯溶于11ml二氯甲烷中，向其中加入1.08ml TFA并将混合物搅拌过夜。然后在减压下大量蒸发溶剂，将剩余的残留物在10ml EA中吸收并将有机相用水洗涤直到其变为pH中性。然后在减压下再次蒸发溶剂并将剩余的残留物用5ml甲苯排气(fumed off)一次。得到305mg白色泡沫树脂的标题化合物，MS[M+H]+626/628；m/z657，484，425。
实施例15(2-甲氧乙氧基)甲基-2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸 将300mg 2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}-羰基)环戊基]甲基}-4-(异丙氨基)-4-氧代丁酸(制备参见实施例12)溶于5ml二氯甲烷中。将33mg DMAP、74μl甲氧基乙氧基甲基氯化物和90μl三乙胺加入到接受溶液中。将反应混合物搅拌过夜，然后用5ml二氯甲烷稀释并将有机相依次用3ml稀KHSO4水溶液和饱和食盐水溶液各洗一次。有机相经硫酸镁干燥，在减压下大量蒸发溶剂，并将剩余的残留物在硅胶上色谱分离(流动相EA/环己烷2∶1 v/v)。将产物级分在油泵真空中干燥得到191g标题化合物，MS[M+H]+646；m/z590，540，484，425。
实施例44(2″rel1″)-2-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)氨基]-4-氧代丁酸乙酯 将140mg{(3S)-3-[({1-[(2″rel1″)-2-乙氧羰基)-4-(异丙氨基)-4-氧代丁基]环戊基}-羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸(制备参见实施例4)溶于3ml乙醇中，向其中加入5滴浓硫酸并将混合物在室温下搅拌2天。然后在减压下基本上除去溶剂并将剩余的残留物在5ml EA中吸收。有机相用每次2ml的NaHSO4水溶液洗两次。经硫酸钠干燥后，在减压下蒸出溶剂，并将残留物在硅胶上色谱分离(流动相EA/环己烷82(v/v))。得到46mg呈白色泡沫的标题化合物；MS[M+H]+574；m/z528，323；1H-NMR(CDCl3)7.33-7.11，m，[4]；6.69，m，[1]；6.44，m，[1]；4.79，4.75，4.34，4.30，AB-Q-.[2]；4.48，m，[1]。
列在下表9中的式I化合物也可按照以上实施例中描述的方法或与之类似的方法制备
表9其它式I化合物
表9，续；rac＝外消旋；Bn＝苄基实施例692-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(4-羟基哌啶-1-基)-4-氧代丁酸叔丁酯
A)使100g的2-[(2-苄氧基)-2-氧代乙基]丙烯酸(制备参见实施例1A)与47ml的亚硫酰氯、43ml的叔丁醇和110ml的吡啶根据实施例1B)中描述的步骤反应得到69.8g 2-亚甲基琥珀酸-4-苄基酯-1-叔丁基酯，[M+H]+277。
B)使上述得到的29.6g 2-亚甲基琥珀酸-4-苄基酯-1-叔丁基酯与41.4ml的二异丙胺、200ml的1.6M正丁基锂的正己烷溶液和12ml的环戊烷羧酸按照实施例1C)中描述的步骤反应得到24.5g的1-[4-(苄氧基)-2-(叔丁氧羰基)-4-氧代丁基]环戊烷羧酸。
C)使15.8g上述得到的1-[4-(苄氧基)-2-(叔丁氧羰基)-4-氧代丁基]环戊烷羧酸与11.75g的叔丁基-[(3S)-3-氨基-2-氧代-2，3，4，5-四氢)-1H-苯并氮杂-1-基]乙酸酯(制备参见EP 0 733642 A1)按照实施例1D)中描述的步骤反应到得到21g的2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸-4-苄基酯-1-叔丁基酯。
D)将21g上述得到的2-{[(3S)-1-({[1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸-4-苄基酯-1-叔丁基酯按照实施例1E)中描述的步骤用6g载于活性碳的钯和1.3bar的氢气压力处理并水化12h得到10g的4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸；MS[M+H]+573；m/z517，461；1H-NMR(CDCl3)7.31-7.17，m，[3]；7.10，m，[1]；6.80，d，
；6.72，d，
；4.60-4.30，m，[3]；3.30，m，
；3.17，m，
。
E)将1.11g上述得到的4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸溶于7.8ml二氯甲烷中，并加入300μl三乙胺。冰浴冷却至0℃后，向该接受溶液中滴加222μl的氯甲酸乙酯。混合物搅拌30分钟，然后加入216mg的4-羟基哌啶并将混合物搅拌过夜。混合物用EA稀释并用KHSO4水溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥并在硅胶上柱层析(液相EA/环己烷1∶1(v/v)变为纯EA变为EA/甲醇4∶1(v/v))得到550mg呈白色泡沫的标题化合物，MS[M+H]+656；m/z425，397，323。
实施例702-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代-4-[4-(L-缬氨酰氧基)哌啶-1-基]丁酸
A)将548mg按照实施例67中的方法得到的2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(4-羟基-哌啶-1-基)-4-氧代丁酸叔丁酯溶于3ml二氯甲烷中。然后加入51mg的DMAP、182mg的BOC-L-缬氨酸和176mg的EDC。搅拌3小时后将混合物用EA稀释，并用KHSO4水溶液和盐水连续洗涤。有机层经硫酸镁干燥并在硅胶上柱层析(液相EA/环己烷1∶1(v/v)变为纯EA)得到551mg的1-(4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酰基)哌啶-4-基-N-4-基-N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸酯，MS[M+H]+855；m/z699，643，625，425，397，323，235。
B)将551mg如上所得的1-(4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酰基)哌啶-4-基-N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸酯溶于14ml的二氯甲烷并将1.49ml的三氟乙酸加入到该接受溶液中。在搅拌过夜后减压蒸发溶剂和过量的酸。向剩余的残留物中加入EA，有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤直到pH达到4。然后将水层用EA萃取三次并将合并的有机层经硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，随后在油泵真空中将剩余的残留物干燥得到310mg呈白色泡沫的标题化合物。MS[M+H]643；m/z425，397，323。
实施例712-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯 A)使20g的1-[4-(苄氧基)-2-(叔丁氧羰基)-4-氧代丁基]环戊烷羧酸(制备参见实施例69B))与13.4g的[(3S)-3-氨基-2-氧代-2，3，4，5-四氢)-1H-苯并氮杂-1-基]乙酸乙酯(制备类似于EP0 733 642 A1中描述的方法)按照实施例1D)中描述的步骤反应得到28.6g的4-苄基-1-叔丁基-2-{[1-({[(3S-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸酯。
B)将28.6g上述得到的4-苄基-1-叔丁基-2{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}琥珀酸酯按照实施例1E)中描述的步骤用5g载于活性碳上的钯和2.3bar的氢气压力处理并水化4.5h得到16g的4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸，[M+H]+545；m/z489。
C)将3g如上所得的4-叔丁氧基-3-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸与859μl甲基异丙胺按照实施例1F)中描述的步骤反应得到1.6g呈白色泡沫的标题化合物，MS[M+H]+600；m/z544。
实施例722-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸
将507mg实施例69中得到的2-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯溶于18ml二氯甲烷中，并将1.95ml的三氟乙酸加入到该接受溶液中。在搅拌过夜后减压蒸发溶剂和过量的酸。向剩余的残留物中加入EA，有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤直到水层的pH达到5。然后有机层经硫酸镁干燥。有机层经硫酸镁干燥并在硅胶上柱层析(液相EA/环己烷1∶1(v/v)变为纯EA)得到430mg呈白色泡沫的标题化合物，MS[M+H]+544。
实施例731-[(乙氧羰基)氧基]乙基2-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸酯 将107mg的2-{[1-({[(3S)-1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸(制备参见实施例72)溶于1ml的DMF中。然后加入83μl的三乙胺、20mg的固体K2CO3和85μl的氯代乙基乙基碳酸酯。搅拌过夜后将混合物用EA稀释，并用KHSO4水溶液和盐水连续洗涤。有机层经硫酸镁干燥并在硅胶上柱层析(液相EA/环己烷1∶1(v/v))得到41mg呈白色泡沫的标题化合物，MS[M+H]+660；m/z526，449，310，253。
实施例741-[(乙氧羰基)氧基]乙基2-{[1-({[(3S)-1-(2-{1-[(乙氧羰基)氧基]氨基}乙氧基}-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸酯 将500mg的2-{[1-({[(3S)-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸乙酯(参见实施例32，合成类似于实施例2)溶于10ml的DMF中。然后加入312μl的氯代乙基乙基碳酸酯、758mg的固体Cs2CO3和80mg的固体碘化钾。在60℃搅拌5小时后将混合物用EA稀释并用水洗涤两次。有机层经硫酸镁干燥并在硅胶上柱层析(液相环己烷，变为EA/环己烷1∶1(v/v))得到360mg呈白油的标题化合物，MS[M+H]+748；m/z614，480。
实施例I含{(3S)-3-[({1-[(2″rel1″)-2-乙氧羰基)-4-(异丙氨基)-4-氧代丁基]环戊基}-羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸的胶囊制备每个胶囊含下列组合物的胶囊{(3S)-3-[({1-[(2″rel1″)-2-乙氧羰基)-4-(异丙基-氨基)-4-氧代丁基]环戊基}-羰基)氨基]-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基}乙酸 20mg玉米淀粉60mg乳糖300mgEA 适量将活性物质、玉米淀粉和乳糖用EA加工成均匀的糊状混合物。将该糊料磨细，将产生的颗粒置于适宜的盘中，并在45℃下干燥以除去溶剂。使干燥的颗粒通过碾碎机并在混合器内与以下的其它辅料混合滑石粉 5mg硬脂酸镁 5mg玉米淀粉 9mg然后装入400mg胶囊中(＝0号胶囊)。
权利要求
1.通式I化合物， 其中R1为氢或生成生物不稳定酯的基团，R2为氢、C1-4-烷基的或C1-4-羟烷基、其中羟基任选地用C2-4烷酰基或氨基酸残基酯化，且R3为C1-4-烷基；C1-4-烷氧基-C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，其任选地被另一个羟基取代且所述羟基各自任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基；C3-7-环烷基；C3-7环烷基-C1-4-烷基；苯基-C1-4-烷基，其中苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次；萘基-C1-4-烷基；C3-6-氧烷基；苯基羰基甲基，其中的苯基任选地被C1-4-烷基C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次，或2-oxoazepanyl，或者R2和R3一起为C4-7-亚烷基，其中亚甲基任选地被羰基、氮、氧和/或硫置换1-2次，和/或任选地被羟基取代一次，羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，其中羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；苯基或苄基，且R4为氢或生成生物不稳定酯的基团，和式I酸类的生理学相容的盐和/或式I化合物生理学相容的酸加成盐。
2.权利要求1的式I化合物，其中R1为氢或生成生物不稳定酯的基团，R2为氢、C1-4-烷基或C1-4-羟烷基，其中羟基任选地用C2-4-烷酰基取代，且R3为C1-4-烷基；C1-4-烷氧基-C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，任选地被另一个羟基取代且其中的羟基各自任选地用C2-4-烷酰基取代；C1-4-烷基氨基-C1-4-烷基；C3-7-环烷基；C3-7-环烷基-C1-4-烷基；苯基-C1-4-烷基，其中苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次；萘基-C1-4-烷基；C3-6-氧烷基；苯基羰基甲基，其中的苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次，或2-oxoazepanyl，或者R2和R3一起为C4-7-亚烷基，其中亚甲基任选地被羰基、氮、氧和/或硫置换1-2次，和任选地被C1-4-烷基取代一次；C1-4-羟烷基，其中羟基任选地被C2-4-烷酰基取代；氧；苯基或苄基，且R4为氢或生成生物不稳定酯的基团，和式I酸的生理学相容的盐和/或式I化合物生理学相容的酸加成盐。
3.权利要求1的式I化合物，其中R1为氢、乙基、甲氧基乙氧基甲基、(RS)-1-[[(异丙基)羰基]氧基]乙基、(RS)-1-[[(乙基)羰基]氧基]-2-甲基丙基、(RS)-1-[[(环己基氧基)羰基]氧基]乙基、5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基-甲基、2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-甲基或(RS)-1-[[(乙氧基)羰基]氧基]乙基。
4.权利要求1的式I化合物，其中R2为氢、甲基、乙基、2-羟乙基或3-羟丙基，每个羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化。
5.权利要求1的式I化合物，其中R3为异丙基；甲氧乙基；2-羟乙基或3-羟丙基，每个羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；3-乙酰氧基-正丙基；环丙基甲基；2-甲氧苄基、4-甲氧苄基，4-甲氧苯基乙基、2，4-二甲氧苄基；1-萘基甲基；3-氧代-1，1-二甲基丁基；苯基-2-氧代乙基、2-(4-甲氧苯基)-2-氧代乙基、3-(2-oxoazepanyl)、二甲氨基-正丙基、(甲基)氨乙基、氨基正丙基、氨基正丁基或氨基正戊基。
6.权利要求1的式I化合物，其中R2和R3一起为吗啉；哌啶；4-酮哌啶；4-羟基哌啶，任选地在羟基上用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；哌嗪或吡咯烷。
7.权利要求1的式I化合物，其中R4为氢、C1-4-烷基、对甲氧苄基、N，N-二-(C0-4-烷基)氨基-C1-6-烷基、(RS)-1-[[(异丙基)羰基]氧基]乙基、(RS)-1-[[(乙基)羰基]氧基]-2-甲基丙基、(RS)-1-[[(环己基氧基)羰基]氧基]乙基、5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基-甲基、2-氧代-1，3-二氧杂环戊烷-4-基-甲基或(RS)-1-[[(乙氧基)羰基]氧基]乙基。
8.权利要求1的式I化合物，选自2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[异丙基(甲基)氨基]-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(二甲氨基)-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(二乙氨基)-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(2-羟乙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[(3-羟丙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-(4-羟基哌啶-1-基)-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代-4-[4-(L-缬氨酰氧基)哌啶-1-基]丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-吗啉-4-基-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代-4-(4-氧代哌啶-1-基)丁酸；4-[双(2-羟乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-二苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸；2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{乙基[3-(乙氨基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸，2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-[[2-(二甲氨基)乙基](甲基)氨基]-4-氧代丁酸，4-[(3-氨丙基)(乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸，2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{甲基[2-(甲氨基)乙基]氨基}-4-氧代丁酸，4-[(4-氨丁基)(甲基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸，4-[(4-氨丁基)(乙基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸，2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-{甲基[3-(甲氨基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸和4-[(5-氨基戊基)(甲基)氨基]-2-{[1-({[1-(羧甲基)-2-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-3-基]氨基}羰基)环戊基]甲基}-4-氧代丁酸，连同它们的生物不稳定酯和这些式I化合物的酸的生理学相容的盐和/或这些式I化合物的生理学相容的酸加成盐。
9.前述权利要求之一的式I化合物，其中在苯并氮杂骨架的3位具有酰胺侧链的手性碳原子为“S“构型。
10.药物组合物，包含权利要求1的药理学有效量的式I化合物和常规的药物助剂和/或赋形剂。
11.权利要求1的式I化合物用于制备预防和/或治疗心血管病症或疾病的用途。
12.权利要求11的用途，其中心血管病症或疾病选自充血性心力衰竭；高血压，包括如原发性高血压、肾性高血压和/或肺动脉高血压的高血压继发形式。
13.能抑制中性内肽酶和人可溶性内肽酶双重作用的化合物在制备预防或治疗性功能障碍的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中化合物为权利要求1的式I化合物。
15.权利要求13的用途，其中性功能障碍选自雌性性功能障碍和雄性性功能障碍。
16.权利要求13的用途，其中性功能障碍为雄性性功能障碍。
17.权利要求13的用途，其中功能障碍选自勃起机能障碍、射精障碍和性欲障碍。
18.权利要求17的用途，其中功能障碍为勃起机能障碍。
19.权利要求1的式I化合物用于制备预防和/或治疗与细胞凋亡有关的不良病症的药物的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为神经变性病症如缺血性发作、脑缺血、外伤性脑损伤、急性播散性脑脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、视网膜色素变性、轻微的认知缺损、阿尔茨海默氏病、皮克病、老年痴呆、进行性核上性麻痹、皮层下痴呆、威尔逊病、多发性梗塞疾病、动脉硬化性痴呆、爱滋病相关性痴呆、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、运动失调性毛细血管扩张症、癫痫相关性脑损害、脊髓损伤、多动腿综合征、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏病、纹状体黑质变性、脑血管炎、线粒体脑肌病、神经元蜡样脂褐质沉积症、脊椎肌肉萎缩、与中枢神经系统相关的溶酶体贮藏妨碍、脑白质营养不良、尿素循环缺损病症、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、卟啉病、细菌或病毒性脑膜炎和脑膜脑炎、朊病毒病、神经毒性化合物的中毒、格-巴二氏综合征、慢性炎性神经病、多肌炎、皮肌炎、辐射引起的脑损害；胃肠道病症如肠易激性疾病和炎性肠疾病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、腹部疾病、幽门螺旋杆菌胃炎及其它感染性、坏死性小肠结肠炎、假膜性小肠结肠炎、辐射引起的小肠结肠炎、淋巴细胞性胃炎、移植物抗宿主病、急性和慢性胰腺炎；肝病如酒精性肝炎、病毒性肝炎、代谢性肝炎、自身免疫性肝炎、辐射引起的肝炎、肝硬化、溶血尿毒症综合征、肾小球肾炎、狼疮肾炎、病毒病如暴发型肝炎；关节疾病如创伤和骨关节炎；免疫抑制或免疫缺陷、尤其是自身免疫性疾病如特发性炎性肌病、慢性中性粒细胞减少症、血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血综合征、抗磷脂抗体综合征、心肌炎、多发性硬化症及其诊断次级分类复发-反复的多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、原发性进行性多发性硬化症、进行性复发的多发性硬化症、急性多发性硬化症、良性复发的多发性硬化症或无症状的多发性硬化症、视神经脊髓炎(德维克氏综合征)、淋巴细胞性垂体炎、格雷夫斯氏病、阿狄森氏病、甲状旁腺功能减退症、I型糖尿病、全身性红斑狼疮、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、银屑病关节炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性勃起机能障碍、结节病、韦格内氏肉芽肿病、自身免疫性耳聋、斯耶格伦氏病、自身免疫性色素层视网膜炎、间质性膀胱炎、肾小球肾炎咯血综合征以及纤维肌痛；脊髓发育不良如再生障碍性贫血；皮肤学疾病包括寻常型天疱疮、皮肌炎、特应性皮炎、亨-舍二氏紫癜、痤疮、全身性硬化症、脂溢性角化病、皮肤肥大细胞增生病、慢性增生性皮炎、角化不良、硬皮病、间质性肉芽肿皮炎、银屑病、皮肤细菌性感染、皮肤真菌病、麻风、皮肤利什曼病、白癜风、中毒性表皮坏死松解症、渗出性多形性红斑、皮脂腺腺瘤、脱发、皮肤光致损伤、硬化性苔癣、急性皮肤创伤、色素失调症、皮肤热损伤、发疹性脓疱病、苔癣样皮肤病、皮肤变应性脉管炎、细胞毒性皮炎；内耳的疾病如声创伤引起的听毛细胞死亡和听力损失、氨基苷引起的听毛细胞死亡和听力损失、耳毒性药物引起的听力损失、外淋巴瘘、胆脂瘤、耳蜗或前庭缺血、梅尼尔氏病、辐射引起的听力损失、细菌或病毒感染引起的听力损失和原发性听力损失；移植移植物抗宿主病，心脏、肺、肾、皮肤、角膜、骨髓或肝移植的急性和慢性排斥；伤口愈合以及组织排斥。
21.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为神经变性病症如缺血性发作、脑缺血、外伤性脑损伤、急性播散性脑脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、视网膜色素变性、轻微的认知缺损、阿尔茨海默氏病、皮克病、老年痴呆、进行性核上性麻痹、皮层下痴呆、威尔逊病、多发性梗塞疾病、动脉硬化性痴呆、爱滋病相关性痴呆、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、运动失调性毛细血管扩张症、癫痫相关性脑损害、脊髓损伤、多动腿综合征、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏病、纹状体黑质变性、脑血管炎、线粒体脑肌病、神经元蜡样脂褐质沉积症、脊椎肌肉萎缩、与中枢神经系统相关的溶酶体贮藏妨碍、脑白质营养不良、尿素循环缺损病症、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、卟啉病、细菌或病毒性脑膜炎和脑膜脑炎、朊病毒病、神经毒性化合物的中毒、格-巴二氏综合征、慢性炎性神经病、多肌炎、皮肌炎、辐射引起的脑损害。
22.权利要求19的用途，其中所述不良病症与细胞凋亡有关的不良病症为肠易激性疾病和炎性肠疾病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、腹部疾病、幽门螺旋杆菌胃炎及其它感染性gastritides、坏死性小肠结肠炎、假膜性小肠结肠炎、辐射引起的小肠结肠炎、淋巴细胞性胃炎、移植物抗宿主病、急性和慢性胰腺炎。
23.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为肝病，如酒精性肝炎、病毒性肝炎、代谢性肝炎、自身免疫性肝炎、辐射引起的肝炎、肝硬化、溶血尿毒症综合征、肾小球肾炎和狼疮肾炎。
24.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为病毒病，如暴发型肝炎。
25.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为关节疾病，如创伤和骨关节炎。
26.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为免疫抑制或免疫缺陷、尤其是自身免疫性疾病如特发性炎性肌病、慢性中性粒细胞减少症、血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血综合征、抗磷脂抗体综合征、心肌炎、多发性硬化症及其诊断次级分类复发-反复的多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、原发性进行性多发性硬化症、进行性复发的多发性硬化症、急性多发性硬化症、良性复发的多发性硬化症或无症状的多发性硬化症、视神经脊髓炎(德维克氏综合征)、淋巴细胞性垂体炎、格雷夫斯氏病、阿狄森氏病、甲状旁腺功能减退症、I型糖尿病、全身性红斑狼疮、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、银屑病关节炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性勃起机能障碍、结节病、韦格内氏肉芽肿病、自身免疫性耳聋、斯耶格伦氏病、自身免疫性色素层视网膜炎、间质性膀胱炎、肾小球肾炎咯血综合征及纤维肌痛。
27.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为脊髓发育不良，如再生障碍性贫血。
28.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为皮肤学疾病，包括寻常型天疱疮、皮肌炎、特应性皮炎、亨-舍二氏紫癜、痤疮、全身性硬化症、脂溢性角化病、皮肤肥大细胞增生病、慢性增生性皮炎、角化不良、硬皮病、间质性肉芽肿皮炎、银屑病、皮肤细菌性感染、皮肤真菌病、麻风、皮肤利什曼病、白癜风、中毒性表皮坏死松解症、渗出性多形性红斑、皮脂腺腺瘤、脱发、皮肤光致损伤、硬化性苔癣、急性皮肤创伤、色素失调症、皮肤热损伤、发疹性脓疱病、苔癣样皮肤病、皮肤变应性脉管炎以及细胞毒性皮炎。
29.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为内耳的疾病如声创伤引起的听毛细胞死亡和听力损失、氨基苷引起的听毛细胞死亡和听力损失、耳毒性药物引起的听力损失、淋巴管周的瘘、胆脂瘤、耳蜗或前庭缺血、梅尼尔氏病、辐射引起的听力损失、细菌或病毒感染引起的听力损失和原发性听力损失。
30.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症由移植引起移植物抗宿主病，心脏、肺、肾、皮肤、角膜、骨髓或肝移植的急性和慢性排斥。
31.权利要求19的用途，其中所述与细胞凋亡有关的不良病症为伤口愈合和组织排斥。
32.一种治疗或预防哺乳动物和人心血管病症或疾病的方法，包括给需要其的对象施用有效量的权利要求1的式I化合物。
33.一种治疗或预防哺乳动物和人性功能障碍的方法，包括给需要其的对象施用有效量的权利要求1的式I化合物。
34.一种治疗或预防哺乳动物和人体内与细胞凋亡有关的不良病症的方法，包括给需要其的对象施用有效量的权利要求1的式I化合物。
35.一种制备式I化合物的方法， 其中R1为氢或生成生物不稳定酯的基团，R2为氢、C1-4-烷基的或C1-4-羟烷基、其中羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化，且R3为C1-4-烷基；C1-4-烷氧基-C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，任选地被另一个羟基取代且其中的羟基各自任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；(C0-4-烷基)2氨基-C1-6-烷基；C3-7-环烷基；C3-7-环烷基-C1-4-烷基；苯基-C1-4-烷基，其中苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次；萘基-C1-4-烷基；C3-6-氧烷基；苯基羰基甲基，其中的苯基任选地被C1-4-烷基、C1-4-烷氧基和/或卤素取代1-2次，或2-oxoazepanyl，或者R2和R3一起为C4-7-亚烷基，其中亚甲基任选地被羰基、氮、氧和/或硫置换1-2次，和任选地被羟基取代一次，羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；C1-4-烷基；C1-4-羟烷基，其中羟基任选地用C2-4-烷酰基或氨基酸残基酯化；苯基或苄基，且R4为氢或生成生物不稳定酯的基团，以及式I酸的生理学相容的盐和/或式I化合物生理学相容的酸加成盐，其特征在于使通式II化合物， 其中R101和R401各自相互独立地为酸保护基，与通式III化合物起反应， 其中R2和R3如上定义，在R2和/或R3包含游离羟基的情况下，如有需要使其与通式IV化合物反应，C1-3-C(O)-XIV其中X代表离去基团，或与被适宜的保护基保护的氨基酸衍生物反应，在R101和/或R401不代表期望的生成生物不稳定酯的基团的情况下和/或在R2和/或R3包含以任何存在的氨基酸残基中的保护基的情况下，将其在所得到的化合物中同时或接任何期望的顺序分别相继裂解，需要时将在各种情况下释放的酸官能转化为生物不稳定的酯基，且需要时将所得的式I酸转化为它们的生理学相容的盐，或将式I酸的盐转化为游离的酸和/或将式I的碱转化为它们的酸加成盐或将酸加成盐转化为式I的游离碱。
36.通式II的化合物， 其中R101为酸保护基且R401为酸保护基。
全文摘要
本发明描述了具有中性内肽酶(NEP)和/或人可溶性内肽酶(hSEP)抑制活性的通式I的新化合物，其中取代基R
文档编号A61K38/05GK1856501SQ200480027747
公开日2006年11月1日 申请日期2004年9月23日 优先权日2003年9月26日
发明者D·霍尔特耶, Y·菲舍尔, D·奇格勒, M·韦斯克, K·迈克里斯, Y·卡里米-内亚德, J·麦辛格尔, A·帕尔, C·胡佛, H·伊克诺米多, L·特斯基 申请人:索尔瓦药物有限公司