专利名称：一种香菇多糖注射用冻干粉针剂及其含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种香菇多糖制剂，尤其涉及一种香菇多糖注射用冻干粉针剂及其制备方法。
本发明还涉及所述香菇多糖注射用冻干粉针剂的含量测定方法。
背景技术：
香菇(Lentinus edodes)为担子菌纲伞形科真菌，味甘性平，健脾祛邪，调和阴阳，食药兼用。香菇中含有多种有效药用组分，尤其是香菇多糖(Lentinan)是一类特殊的生理活性物质，具有调节人体生理功能，增强人体免疫机能，预防和治疗多种慢性疾病的作用。尤其是，它具有显著的、独特的抗肿瘤活性，并能减轻放疗和化疗的毒性反应。临床医学证明香菇多糖安全无毒副作用，其抗肿瘤的药理作用并非直接杀死致病原，而是表现在增强人体免疫调节作用。它通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善人体机体平衡，达到恢复和提高人体细胞对淋巴因子、激素及其他生理活性因子的反应。
作为药物的香菇多糖研究始于上世纪50年代，成为免疫促进剂而引起人们兴趣则在60年代以后。1968年日本人千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6种胞外香菇多糖，其中二种有明显抗肿瘤作用，测试表明其平均分子量为100万，是一种带分支侧链的β-葡聚糖结构，并定商品名为Lentinan。70年代初，Shida等用三氯醋酸浸提，甲醇等沉淀又从香菇中提取得到三种水溶性多糖，首次报道香菇中除β-葡聚糖以外的另一种抗肿瘤物质，认为除分子量100万的香菇多糖外，另一种分子量在16000的香菇多糖也具有抗肿瘤活性。80年代以来，香菇多糖的研究更为深入，更为多元化，提取香菇多糖已由子实体发展到从深层发酵香菇菌丝体中提炼，对香菇多糖的研究大量转向药理和临床试验。研究充分表明香菇多糖具有抗肿瘤作用，尤其对慢性粒细胞白血病、胃癌、鼻咽癌、直肠癌和乳腺癌等有抑制和防止手术后微转移的效果，此作用是通过增强肌体免疫力而对癌细胞表现出间接毒性，尤其适用于病后肌体康复。与其他抗肿瘤药物相比，香菇多糖几乎无任何副作用，是目前已知最强的免疫增强剂之一。除此之外，香菇多糖还是治疗各种肝炎，特别是慢性迁移性肝炎的良好药物。香菇多糖是迄今为止国内唯一一个可以供静脉注射的大分子多糖冻干粉针剂。
香菇多糖的化学结构曾经利用甲基化分析和Smith降解等方法测定来源于香菇中的β-葡聚糖物质，显示该多糖的一级结构具有β-D(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链，在主链中葡萄糖的C6位上含有支点(每5个D-葡萄糖有2个支点)，其侧链是由β-D-(1→6)和β-D-(1→3)键相连的D-葡萄糖聚合体组成，在侧链上也含有少数内部β-D-(1→6)链。现已知道水溶性β-葡聚糖为线性结构，无长分支，以β-D-(1→3)链为主结构的葡聚糖，其生理活性高于β-D-(1→6)为主的多糖，而β(1→3)和β(1→6)结合的侧链共存是抗肿瘤作用所必不可少的。
药理毒理研究情况香菇多糖的抗肿瘤、抗疾病作用是通过提高机体的免疫功能来实现的。香菇多糖对正常机体并无免疫促进作用，但对机体免疫功能下降或感染疾病，患上癌症后，造成人体免疫系统紊乱患者，能有效调节免疫作用特点在于识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞，促进淋巴细胞活化因子的产生，释放各种辅助性T细胞因子，诱导或增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬作用，恢复或刺激辅助性T细胞的功能，同时促进免疫球蛋白形成的核酸蛋白合成的作用，提高机体的免疫功能。许多学者研究了香菇多糖对临床癌症患者免疫状态的影响，证实香菇多糖与化疗合用可提高化疗疗效，增加淋巴细胞转化率、NT细胞活性和T4/T8细胞比值。
经用香菇多糖给小鼠静脉注射时，LD50为1500mg/Kg，小鼠肌肉注射增至最大剂量2250mg/Kg，无法测出LD50，用香菇多糖对狗和Wister大鼠长期毒性试验，以香菇多糖注射液人用剂量的50倍和100倍分别给予狗和大鼠肌肉注射，每天1次，连续6个月，检查动物外观、体重、肝、肾功能、血常规、病理检查、电镜观察等均无明显影响。甚至狗和大鼠用药分别增至人用剂量的400倍时也无明显影响，试验表明香菇多糖长期应用是相当安全的。
中国专利申请00112407.2公开了抗肿瘤药物香菇多糖冻干粉针剂的配方及其可工业化的制备方法，配方中省去了使患者可能产生过敏的右旋糖酐，而采用甘露醇作为冻干赋形剂。
由于香菇多糖的化学本质为葡聚糖，因此该药品的含量测定采用经典的硫酸蒽酮法(国家药品标准WS1-(X-032)-2004Z)和还原糖测定法(国家药品标准WS1-(X-152)-2004Z)，但是目前上市的冻干粉针剂一般采用右旋糖酐或甘露醇(中国专利申请00112407.2)作为冻干赋形剂，而上述辅料对多糖测定含量有明显的干扰，因此国家药品含量测定方法中均采用对照品法。由于香菇多糖价格昂贵，对照品要求纯度较高，目前还没有对照品上市；并且制剂含量测定是需要在对照品中加入一定量的辅料来排除辅料的干扰，造成测定方法操作繁琐。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明采用氨基酸和盐类作为冻干赋形剂，其对多糖含量测定无影响，便于药品的质量检查和控制；并且不需要使用昂贵的对照品，降低了生产成本。
因此，本发明的一个目的在于提供一种香菇多糖注射用冻干粉针剂。
本发明的另一个目的在于提供一种香菇多糖注射用冻干粉针剂的制备方法。
本发明的还一个目的在于提供所述香菇多糖注射用冻干粉针剂的含量测定方法。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种香菇多糖注射用冻干粉针剂，其包含作为活性成分的香菇多糖和冻干赋形剂，所述冻干赋形剂为选自盐类和氨基酸中的一种或多种，所述香菇多糖和冻干赋形剂的重量比为0.1～80∶20～99.9。
优选的，所述香菇多糖和冻干赋形剂的重量比为1～10∶50～99。
所述香菇多糖在注射用冻干粉针剂中的含量范围一般为0.1～10mg，优选0.5～5mg；所述冻干赋形剂在注射用冻干粉针剂中的含量范围一般为10～100mg。
所述盐类应为在注射用溶媒中可溶的盐类。优选的，所述盐类可为氯化钠、磷酸盐或柠檬酸盐等。
优选的，所述冻干赋形剂为氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸等。
更优选的，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或赖氨酸等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种香菇多糖注射用冻干粉针剂的制备方法，其包括下述步骤1)称取0.1～80重量份的香菇多糖并用注射用水溶解定容到一定体积，用0.45μm滤膜过滤，用活性炭吸附，用0.22μm滤膜过滤，得a溶液；2)用注射用水溶解20～99.9重量份的冻干赋形剂，得b溶液，所述冻干赋形剂为选自盐类和氨基酸中的一种或多种；3)将a溶液和b溶液混合均匀，用灭菌注射用水定容到一定体积，分装入瓶，进行冷冻干燥，封口，制备得到冻干针剂。
优选的，所述冻干赋形剂为氨基酸。
更优选的，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或赖氨酸。
优选的，所述香菇多糖为1～10重量份，所述冻干赋形剂为50～99重量份。
根据本发明的还一方面，本发明还提供了所述香菇多糖冻干粉针剂的含量测定方法，所述方法包括下述步骤1)对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥至恒重的葡萄糖对照品20mg，精密称定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；2)供试品溶液的制备取本品约12mg，精密称定，加0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次转移至500ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀；3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分别置于具塞试管中，各加水至3.0ml，再分别沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml，以上操作均在冰浴中进行；剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温；自振摇起，在20分钟～40分钟内，以0号管为空白，按照分光光度法，分别在625nm的波长处测定吸收度，以对照品溶液浓度与相应的吸收度计算回归方程；4)测定法精密量取供试品溶液3ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法测定，从回归方程计算多糖的含量。
本发明提供的香菇多糖制剂方法及含量测定方法有以下优点1、本发明的香菇多糖制剂中辅料对含量测定无干扰；2、含量测定不需要香菇多糖对照品；3、含量测定以葡萄糖为对照品，对照品容易得到；4、含量测定方法为经典方法，测定结果准确可靠，并且该法易于为检验人员掌握；5、含量测定操作相对简单；6、含量测定时，不需要提供辅料来消除干扰。
为了更好地理解本发明的本质，下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
具体实施例方式
本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
本发明所用香菇多糖可按照文献工艺(cancer research，No.30，2776～2781，November 1970)制备、提纯得到。
香菇多糖注射用冻干粉针剂的制备实施例1制备本发明香菇多糖注射用冻干粉针剂的具体配方和工艺如下1、配方
2、制备工艺(1)配液准备各种配液用品齐全；称量称取处方量的香菇多糖(按成品计算)，二人复核；溶药称取处方量的香菇多糖并用适量灭菌的注射用水(从灭菌到使用时间间隔不得超过24小时)，置水浴(80℃)中至全部溶解，然后定容到500ml，用0.45μm滤膜过滤，用活性炭吸附，用0.22μm滤膜过滤，得a溶液；用注射用水溶解处方量的冻干赋形剂，得b溶液；将a溶液和b溶液混合均匀，用灭菌注射用水定容到1000ml，调节pH值至7.0左右。
除菌过滤在百级洁净区，过0.22μm滤膜；起泡点试验起泡点压力＞0.35Mpa。
(2)灌装试车装好机器、接通电源，检查各部运转情况，由低速到高速运行完好后，方可使用；准备装瓶上塞，将西林瓶送入理瓶盘，将胶塞装入理塞器内；调装量按半成品含量测定结果确定装量，旋转调量螺母，调到确定的装量，理想装量1±0.02ml。
灌装理盘作顺时针旋转，将瓶子送入理瓶轨道，进入分度齿盘，分度齿盘以每分钟10～50次间歇速度旋转，将瓶子拨到灌装位置，灌装机构以同步间歇的上下往返运动进行灌装，灌装后的西林瓶转至按塞位，进行按塞。
胶塞由理塞器输塞轨道将其送到按塞轮处，胶塞在真空吸力下牢靠的跟随按塞轮作间歇转位，使塞对准瓶口，按塞推杆将瓶上推，瓶塞按入瓶口内，此时真空自动关闭，塞脱开按塞轮，随瓶进入输瓶轨道。
将灌装半压塞的药瓶装盘，送入冻干机，清场。
从过滤结束到灌装结束时间间隔应不超过7小时。
(3)冷冻干燥a.预冻搁板温度控制在-35℃至-40℃，制品温度达-35℃以下，从视窗可见冻结成冰；b.升华前期缓慢升温至制品全白(-25℃左右)，同时将系统真空度保持在6～8Pa，然后，升温速度可稍快至板温与制品接近；c.二次干燥制品35～30℃，保持4～6小时；d.压盖。
香菇多糖冻干粉针剂的两种硫酸-蒽酮测定法比较实施例2本发明采用的含量测定方法1、对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥至恒重的葡萄糖对照品20mg，精密称定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
2、供试品溶液的制备取本品约12mg，精密称定，加0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次转移至500ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。
3、标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分别置于具塞试管中，各加水至3.0ml，再分别沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml(以上操作均在冰浴中进行)，剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，在20分钟～40分钟内，以0号管为空白，按照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVB)，分别在625nm的波长处测定吸收度。以对照品溶液浓度与相应的吸收度计算回归方程。
4、测定法精密量取供试品溶液3ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法测定，从回归方程计算多糖的含量。
实施例3国家药品标准注射用香菇多糖(WS1-(X-152)-2004Z)含量测定方法1、对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的香菇多糖对照品10mg，置研钵中，加0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml研磨溶解，用水分次转移至20ml量瓶中，加甘露醇1.0g，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液3ml至25ml量瓶中，加6mol/L硫酸溶液2.5ml，摇匀，密塞，置水浴中，准确反应40分钟，取出，放冷，加酚酞指示液1滴，用30％氢氧化钠溶液调至微红色，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀。
2、供试品溶液的制备取本品3mg，分别精密加水2.0ml使溶解，合并混匀，精密量取3ml至25ml量瓶中，照对照品溶液的制备方法，自“加6mol/L硫酸溶液2.5ml”起，依法制备。
3、测定法精密量取对照品溶液及供试品溶液各10ml，分别置碘量瓶中，精密加入碱性硫酸铜溶液[取无水碳酸钠与酒石酸钾钠各25g，加水约800ml使溶解，在不断搅拌下，通过长径漏斗加入10％硫酸铜溶液75ml至容器底部，再加碳酸氢钠20g，碘化钾5g，搅拌使溶解，移至1000ml量瓶中，加碘酸钾溶液(称取碘酸钾35.7g，加水溶解使成1000ml，摇匀)25ml，用水稀释至刻度，摇匀。放置过夜，备用]5ml，摇匀，将碘瓶置水浴中，准确计时15分钟，迅速移出碘瓶，立即在流动水中冷却，沿瓶壁加碘化钾-草酸钾溶液(取碘化钾、草酸钾各2.5g，加水溶解使成100ml，临用前新制)2ml(以上操作切勿振摇)，加1mol/L硫酸溶液3ml，加塞，置冷水浴中充分振摇至氧化亚铜沉淀全部溶解，用硫代硫酸钠滴定液(0.005mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示剂5滴，继续滴定至蓝色消失。另取水10ml，照上述方法测定，作为空白。按下式计算含量 V0为空白消耗硫代硫酸钠滴定液毫升数；
VT为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液毫升数；V0为对照品消耗硫代硫酸钠滴定液毫升数；S为10ml对照品溶液中含对照品量(mg)；0.6为10ml供试品溶液的供试品表示量(mg)。
比较上述二种测定方法，前一种方法需要香菇多糖对照品。本发明提供的制剂方法，所采用的药用辅料对多糖含量测定无干扰，采用经典的硫酸蒽酮法，以葡萄糖为对照品，测定方法简便，结果准确。
冻干赋形剂不同的香菇多糖冻干粉针剂的硫酸-蒽酮法测定比较实施例4采用实施例2的含量测定法，测定四种香菇多糖冻干粉针剂的香菇多糖含量，这四种冻干粉针剂所用冻干赋形剂分别为右旋糖酐40、甘露醇、甘氨酸、氯化钠。结果见表1。由结果可知，采用甘氨酸或氯化钠作为冻干赋形剂时，实测含量与理论含量相符，表明辅料不干扰香菇多糖的含量测定；而采用右旋糖酐40或甘露醇作为冻干赋形剂时，实测含量与理论含量偏差很大，表明辅料明显干扰香菇多糖的含量测定。
表1硫酸-蒽酮法测定四种香菇多糖制剂的结果(n＝6)
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种香菇多糖注射用冻干粉针剂，包含香菇多糖和冻干赋形剂，其特征在于，所述冻干赋形剂为选自盐类和氨基酸中的一种或多种；所述香菇多糖和冻干赋形剂的重量比为0.1～80∶20～99.9。
2.权利要求1所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述香菇多糖和冻干赋形剂的重量比为1～10∶50～99。
3.权利要求1所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述香菇多糖为0.1～10mg。
4.权利要求3所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述香菇多糖为0.5～5mg。
5.权利要求1所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述冻干赋形剂为氨基酸。
6.权利要求6所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或赖氨酸。
7.权利要求1所述的注射用冻干粉针剂，其特征在于，所述盐类为氯化钠、磷酸盐和/或柠檬酸盐。
8.一种香菇多糖注射用冻干粉针剂的制备方法，包括下述步骤1)称取0.1～80重量份的香菇多糖并用注射用水溶解定容到一定体积，用0.45μm滤膜过滤，用活性炭吸附，用0.22μm滤膜过滤，得a溶液；2)用注射用水溶解20～99.9重量份的冻干赋形剂，得b溶液，所述冻干赋形剂为选自盐类和氨基酸中的一种或多种；3)将a溶液和b溶液混合均匀，用灭菌注射用水定容到一定体积，分装入瓶，进行冷冻干燥，制备得到冻干针剂。
9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述冻干赋形剂为氨基酸。
10.权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或赖氨酸。
11.权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述香菇多糖为1～10重量份，所述冻干赋形剂为50～99重量份。
12.一种权利要求1所述香菇多糖注射用冻干粉针剂的含量测定方法，包括下述步骤1)对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥至恒重的葡萄糖对照品20mg，精密称定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；2)供试品溶液的制备取本品约12mg，精密称定，加0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次转移至500ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀；3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分别置于具塞试管中，各加水至3.0ml，再分别沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml，以上操作均在冰浴中进行；剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温；自振摇起，在20分钟～40分钟内，以0号管为空白，按照分光光度法，分别在625nm的波长处测定吸收度，以对照品溶液浓度与相应的吸收度计算回归方程；4)测定法精密量取供试品溶液3ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“沿管壁缓缓加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法测定，从回归方程计算多糖的含量。
全文摘要
本发明涉及一种香菇多糖注射用冻干粉针剂，其包含作为活性成分的香菇多糖和冻干赋形剂，所述冻干赋形剂为选自盐类和氨基酸中的一种或多种，所述香菇多糖和冻干赋形剂的重量比为0.1～80∶20～99.9。本发明还涉及制备这种注射用香菇多糖冻干粉针剂的方法。本发明采用氨基酸和盐类作为冻干赋形剂，其对多糖含量测定无影响，便于药品的质量检查和控制；并且不需要使用昂贵的对照品，降低了生产成本。
文档编号A61P35/00GK1939334SQ200510086530
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者马骉, 王天燕 申请人:北京赛生药业有限公司