专利名称：一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖及其制备方法，属于功能高分子领域。该类磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖具有抗凝血活性、抗肿瘤活性和抗病毒活性，作为一种药物在医疗方面有应用前景。
背景技术：
多糖的硫酸化衍生物/磺化衍生物包括自然界存在的天然多糖硫酸酯/磺化衍生物如硫酸软骨素、肝素等和经人工合成的多糖硫酸酯衍生物/磺化衍生物。这些多糖硫酸化/磺化衍生物，具有抗凝血、抗病毒和抗肿瘤等生物功能，因此对硫酸化/磺化多糖的研究，尤其是不同结构硫酸化/磺化多糖的制备及其性能之间的关系在当今备受重视。
甲壳素是仅次于纤维素生物生成量的第二丰富的天然高分子化合物，它是2-乙酰氨基-D-葡萄糖通过P-(l， 4)糖苷键连接起来的直链多糖，壳聚糖是甲壳素脱乙酰产物，也是自然界中唯一发现的聚阳离子的天然多糖。甲壳素/壳聚糖的化学结构与肝素有许多相似之处，并且具有无毒、生物相容性、生物可降解性等特殊性质，因此常采用甲壳素/壳聚糖通过化学修饰的方法来制备类肝素。目前采用的方法主要是在甲壳素的6位和3位羟基上引入硫酸酯基，及在2位氨基上引入磺酸基，还没有文献报道将甲壳素6位羟基转变为氨基后再进行磺化反应来制备磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖。
发明内容
本发明就是基于上述技术背景，提出一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖及其制备方法，所得磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖具有较高抗凝血活性，可替代肝素用于制备抗凝血药物。
本发明以壳聚糖为原料，首先通过邻苯二甲酰化反应在壳聚糖2位氨基上引入邻苯二甲酰保护基，然后和对甲苯磺酰氯反应在壳聚糖6位羟基上引入比较容易离去的对申苯磺酰基，再和叠氮化钠反应，由叠氮基取代对甲苯磺酰基，接着三苯基膦TPP还原叠氮基为氨基，再用水合肼脱去保护基邻苯二甲酰基，制得6-氨基-6-脱氧壳聚糖，最后利用磺化反应在氨基上引入磺酸基而制得磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖。由于壳聚糖6位羟基转化为了氨基，而氮原子的电负性要比氧小，因此磺酸基负离子的负电荷密度要比硫酸酯基的负电荷密度增大一些，这将导致产物磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖具有较高的生物活性。
本发明提供的技术方案是 一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，由壳聚糖为原料依次经邻苯二甲酰化反应、对甲苯磺酰化反应、叠氮基取代反应、叠氮基还原反应和脱保护基反应及磺
4化反应而制得。
所述的邻苯二甲酰化反应为将脱乙酰度70%-96%的壳聚糖粉末悬浮于其质量10 30倍的含水5V。的N， N-二甲基甲酰胺中搅拌0.5 12 h，加入壳聚糖自由氨基物质的量2 5倍的邻苯二甲酸酐，100 140°C搅拌反应2 10h，倾入壳聚糖质量40倍 60倍的冰水中搅拌，过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥得邻苯二甲酰化壳聚糖。
所述的对甲苯磺酰化反应为取邻苯二甲酰化壳聚糖，加入其质量0.5 2倍的三乙胺，6 15倍的吡啶，接着在搅拌下加入其质量3 8倍的对甲苯磺酰氯，反应3 20h，所得溶液倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后得对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖。
所述叠氮基取代反应为在对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖中加入其质量6 25倍干燥的N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入其糖残基物质的量2 4倍的叠氮化钠，80 120°C反应10 20h，反应物倾入冰水中过滤，依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥得叠氮化壳聚糖。
所述叠氮基还原和脱保护基反应为将叠氮化壳聚糖加入其质量10 50倍的DMSO中在25-35 。C搅拌溶解，再加入其质量1.5 4倍的三苯基膦，氮气保护下搅拌反应8 14h，加入其质量6 25倍的50%水合肼，控温卯-110 QC反应7-10h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入蒸馏水，用乙酸调pH值为6，过滤，滤液蒸馏水透析或超滤净化后减压蒸馏浓縮，然后冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。
所述磺化反应为将6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于其质量10 100倍的蒸馏水中加入糖残基物质的量3 10倍的三氧化硫-三甲胺复合物和4 6倍量的Na2C03，在40 65卩恒温下搅拌反应8 24小时，反应液经透析或超滤净化，减压蒸馏浓縮，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。
本发明还提供了上述磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖的制备方法将脱乙酰度70%-96%的壳聚糖粉末悬浮于其质量10 30倍的含水5。/o的N， N-二甲基甲酰胺中搅拌0.5 12 h，加入壳聚糖自由氨基物质的量2 5倍的邻苯二甲酸酐，100 140。C搅拌反应2 10h，倾入壳聚糖质量40倍 60倍的冰水中搅拌，过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥得邻苯二甲酰化壳聚糖；取邻苯二甲酰化壳聚糖，加入其质量0.5 2倍的三乙胺，6 15倍的吡啶，接着在搅拌下加入其质量3 8倍的对甲苯磺酰氯，反应3 20h，所得溶液倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后得对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖；在对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖中加入其质量6 25倍干燥的N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入其糖残基物质的量2 4倍的叠氮化钠，80 120。C反应10 20h，反应物倾入冰水中过滤，依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥得叠氮化壳聚糖；将叠氮化壳聚糖加入其质量10 50倍的DMSO中在25-35。C搅拌溶解，再加入其质量L5 4倍的三苯基膦，氮气保护下搅拌反应8 14h，加入其质量6 25倍的50%水合肼，控温90-110 °C反应7-10h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入蒸馏水，用乙酸调pH值为6，过滤，滤液蒸馏水透析或超滤净化后减压蒸馏浓縮，然后冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖；将6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于其质量10 100倍的蒸馏水中加入糖残基物质的量3 10倍的三氧化硫-三甲胺复合物和4 6倍量的Na2C03，在40 65'C恒温下搅拌反应8 24小时，反应液经透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。
本发明得率高，所得磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖具有高的抗凝血活性，可替代肝素用作抗凝血药物。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的技术范围。
实施例l: 15克壳聚糖粉末(脱乙酰度DD75X， Mw 51xl04)悬浮于300ml含水5%的DMF中搅拌0.5h，加入邻苯二甲酸酐35.4g， 120°C搅拌反应3h后，倾入750ml冰水中后过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥后加入三乙胺18ml，吡啶200ml，搅拌下加入对甲苯磺酰氯100g室温反应18h，得一粘性溶液；溶液倾入2100ml冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物中加入干燥的DMF 300ml，搅拌下加入叠氮化钠17g, 100°C反应12h，倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物置于DMSO380ml中，30°C搅拌溶解，接着加入TPP50g，氮气保护下搅拌反应12h后，加入50%水合肼190ml，控温100°C反应8h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入1500ml水，用乙酸调pH值为6，滤去沉淀，滤液超滤净化，减压蒸馏浓縮，冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于600ml的蒸馏水中，加入80g Me3N-S03复合物和46g Na2C03，在65"C搅拌反应18h，反应液超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。IR-SO, 1223.2cm1, 1191.4cm1,双峰，强；13C画R: S45.1卯m， C6信号强，与NHS03Na相连，S 60.07ppm， C2信号强，与NHS03Na相连。
实施例2: 15克壳聚糖粉末(脱乙酰度DD75%， Mw 51xl04)悬浮于200ml含水5%的DMF中搅拌0.5h，加入邻苯二甲酸酐24g， 140。C搅拌反应8h，倾入750ml冰水中后过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物中加入三乙胺36ml，吡啶300ml，搅拌下加入对甲苯磺酰氯150g反应4h,得一粘性溶液；溶液倾入2100ml冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后加入干燥的DMF 480ml，搅拌下加入叠氮钠20g， 90。C反应20h后，倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物置于DMSO卯0ml中，于3(fC搅拌溶解，加入TPP87g，氮气保护下搅拌反应12h，接着加入50%水合肼510ml，控温100°C反应8h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入1500ml水，用乙酸调pH值为6，滤去沉淀，滤液超滤净化，减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于350ml的蒸馏水中加入66g的Me3N-S03复合物和37gNa2C03，在5(TC搅拌反应24小时，反应液经超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。IR:S=0， 1222.6cm-1 ， 1191.2cnT1，双峰，强。
实施例3:壳聚糖粉末(15克，脱乙酰度DD 87%， Mw 34x104)悬浮于240ml含水5%的DMF中搅拌0.5h，加入邻苯二甲酸酐35g， 140"C搅拌反应3h，倾入750ml冰水中后过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥后加入三乙胺12ml，吡啶150ml，搅拌下加入对甲苯磺酰氯50g反应16h，得一粘性溶液；溶液倾入2100ml冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物中加入干燥的DMF360ml，搅拌下加入叠氮化钠13.5g， 120°C反应10h后，倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥产物置于DMSO400ml中，30QC搅拌溶解，加入TPP60g，氮气保护下搅拌反应12h后，加入50V。水合肼300ml，控温100°C反应8h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入1500ml水，用乙酸调pH值为6,滤去沉淀，滤液超滤净化，减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于300ml的蒸馏水中，加入55gMe3N-S03复合物和38gNa2C03，在45。C搅拌反应10小时，反应液经超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。IR: S=0，1222.5cm'， 1192.3 cm1,峰强；l3C醒R: S 45.0ppm， <:6信号强，与NHS03Na相连，560.15ppm， C2信号强，与NHS03Na相连。
实施例4:壳聚糖粉末(15克，脱乙酰度DD92X， Mw26xl04)悬浮于450ml含水5。/。的DMF中搅拌0.5h，加入邻苯二甲酸酐52g， 10(^C搅拌反应8h后，倾入冰水750ml中后过滤，依次用水和乙醇洗涤，产物干燥后加入三乙胺21ml，吡啶220ml，搅拌下加入对甲苯磺酰氯145g反应4h，得一粘性溶液；溶液倾入2100ml冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物中加入干燥的DMF340ml，搅拌下加入叠氮钠18g， 100°C反应16h，倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物置于DMSO450ml中，3(fC搅拌溶解，接着加入TPP60g，氮气保护下搅拌反应12h后，加入50。/。水合肼300ml，控温100°C反应8h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入1500ml水，用乙酸调pH值为6，滤去沉淀，滤液超滤净化，减压蒸馏浓縮，冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于1200ml蒸馏水中加入136g的Me3N-S03复合物和48g的Na2C03，在65'C搅拌反应18小时，反应液经超滤净化，减压蒸馏浓縮，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。IR: SO， 1223.5cm"， 1192.4 cm'，双峰，强。
实施例5:壳聚糖粉末(15克，脱乙酰度DD92X， Mw26xl04)悬浮于300ml含水5。/。的DMF中搅拌0.5h，加入邻苯二甲酸酐45g， 120"C搅拌反应3h，倾入冰水中后过滤，依次用水和乙醇洗涤，产物干燥后加入三乙胺15ml，吡啶180ml，搅拌下加入对甲苯磺酰氯97g反应8h，得一粘性溶液；溶液倾入2100ml冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物中加入干燥的DMF220ml，搅拌下加入叠氮钠18g， 100。C反应20h后，倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后产物置于DMSO 400ml中，30°C搅拌溶解后，加入TPP50g，氮气保护下搅拌反应12h，加入50Y。水合肼240ml，控温100°C反应8h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入1500ml水，用乙酸调pH值为6，滤去沉淀，滤液超滤净化，减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于600ml的蒸馏水中加入84g Me3N-S03复合物和48g的Na2C03，在65"C搅拌反应12小时，反应液经超滤净化，减压蒸馏浓縮，乙醇沉淀，真空千燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。IR: S=0，1222.7cm-1 ， 1191.7cm—'，双峰，强。
以上实施例所得磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖的分子结构参数和抗凝血活性数据列于表1。
表1磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖的分子参数和抗凝血活性
Mwxl0—4 S元素含量(wt。/。) 抗凝血活性(U/mg)
实施例12.5614.4235.0
实施例22.0813.4633.2
实施例31.8610.4229.5
实施例40.4615.0142.4
实施例50.7513.8536.8
权利要求
1.一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，由壳聚糖为原料依次经邻苯二甲酰化反应、对甲苯磺酰化反应、叠氮基取代反应、叠氮基还原反应和脱保护基反应及磺化反应而制得。
2. 根据权利要求l所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，其特征是所述的邻苯二甲酰化反应为将脱乙酰度70%-96%的壳聚糖粉末悬浮于其质量10 30倍的含水5%的N， N-二甲基甲酰胺中搅拌0.5 12 h，加入壳聚糖自由氨基物质的量2 5倍的邻苯二甲酸酐，100 140-C搅拌反应2 10h，倾入壳聚糖质量40倍 60倍的冰水中搅拌，过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥得邻苯二甲酰化壳聚糖。
3. 根据权利要求l所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，其特征是所述的对甲苯磺酰化反应为取邻苯二甲酰化壳聚糖，加入其质量0.5 2倍的三乙胺，6 15倍的吡啶，接着在搅拌下加入其质量3 8倍的对甲苯磺酰氯，反应3 20h，所得溶液倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后得对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖。
4. 根据权利要求l所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，其特征是所述叠氮基取代反应为在对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖中加入其质量6 25倍干燥的N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入其糖残基物质的量2 4倍的叠氮化钠，80 120°C反应10 20h，反应物倾入冰水中过滤，依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥得叠氮化壳聚糖。
5. 根据权利要求l所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，其特征是所述叠氮基还原和脱保护基反应为将叠氮化壳聚糖加入其质量10 50倍的DMSO中在25-35 °C搅拌溶解，再加入其质量L5 4倍的三苯基膦，氮气保护下搅拌反应8 14h，加入其质量6 25倍的50%水合肼，控温卯-110 UC反应7-10h，反应混合物减压蒸去水及肼后，加入蒸馏水，用乙酸调pH值为6，过滤，滤液蒸馏水透析或超滤净化后减压蒸馏浓縮，然后冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖。
6. 根据权利要求l所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖，其特征是所述磺化反应为将6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于其质量10 100倍的蒸馏水中加入糖残基物质的量3 10倍的三氧化硫-三甲胺复合物和4 6倍量的Na2C03，在40 65'C恒温下搅拌反应8 24小时，反应液经透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。
7. 权利要求1所述的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖的制备方法，其特征是将脱乙酰度`70%-96%的壳聚糖粉末悬浮于其质量10 30倍的含水5%的N， N-二甲基甲酰胺中搅拌`0.5~12 h，加入壳聚糖自由氨基物质的量2 5倍的邻苯二甲酸酐，100 140°C搅拌反应2 10h，倾入壳聚糖质量40倍 60倍的冰水中搅拌，过滤，依次用水和乙醇洗涤，干燥得邻苯二甲酰化壳聚糖；取邻苯二甲酰化壳聚糖，加入其质量0.5 2倍的三乙胺，6 `15倍的吡啶，接着在搅拌下加入其质量3 8倍的对甲苯磺酰氯，反应3 20h，所得溶液倾入冰水中，过滤后依次用水和乙醇洗涤，干燥后得对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖；在对甲苯磺酰化邻苯二甲酰化壳聚糖中加入其质量6 25倍干燥的N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入其糖残基物质的量2 4倍的叠氮化钠，80 120°C反应10 20h，反应物倾入冰水中过滤，依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥得叠氮化壳聚糖；将叠氮化壳聚糖加入其质量10 50倍的DMSO中在25-35 °C搅拌溶解，再加入其质量1.5 4倍的三苯基膦，氮气保护下搅拌反应8 14h，加入其质量6 25倍的50%水合肼，控温90-ll(TC反应7-10h,反应混合物减压蒸去水及肼后，加入蒸馏水，用乙酸调pH值为6，过滤，滤液蒸馏水透析或超滤净化后减压蒸馏浓縮，然后冷冻干燥得6-氨基-6-脱氧壳聚糖;将6-氨基-6-脱氧壳聚糖溶解于其质量10 100倍的蒸馏水中加入糖残基物质的量3 10倍的三氧化硫-三甲胺复合物和4 6倍量的Na2C03，在40 65'C恒温下搅拌反应8 24小时，反应液经透析或超滤净化，减压蒸馏浓縮，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖产物。
全文摘要
本发明涉及一种磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖及其制备方法，其制备方法为由壳聚糖为原料依次经邻苯二甲酰化反应、对甲苯磺酰化反应、叠氮基取代反应、叠氮基还原反应和脱保护基反应及磺化反应而制得。本发明得率高，所制备的磺化6-氨基-6-脱氧壳聚糖具有较高的抗凝血活性，可替代肝素用作抗凝血药物。
文档编号A61P7/02GK101671401SQ200910272319
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者康 伍, 杜予民, 杨建红 申请人:武汉大学