专利名称：治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程生物技术领域，具体涉及治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用。
背景技术：
肿瘤基因治疗能够在基因水平根本上弥补肿瘤发生发展过程产生的基因表达异常状况、纠正肿瘤的失调状态，因而具有广阔的应用前景。但是肿瘤基因治疗仍存在一些瓶颈环节的难题，例如，在系统给药情况下如何使被转入的治疗基因实现只限制在实体瘤内部或者整个肿瘤环境内高水平、高特异性地表达，而不在其它正常组织表达，从而有效消除或降低治疗基因可能带来的副作用？这一技术难题限制了基因治疗在实体瘤治疗中的实际应用。在开发适用于癌症基因治疗的载体的研发过程中，基因治疗载体的安全性和有效性都是极其重要的因素。很多实体瘤，包括大多数乳腺癌和黑色素瘤等原发瘤，都具有特征性的缺氧区或坏死区[Patyar S 等，2010，Journal of Biomedical Science 17 21 ；Li X 等，2003，CancerGene Therapy 10:105-111]。肿瘤患者体内的组织氧浓度分析结果表明， 肿瘤内的的氧分压为10-30mm汞柱，而在正常组织中的氧分压则达对-66!11111汞柱。而实体瘤中的缺氧坏死区的细胞对于放疗和化疗均不敏感，所以经典的放化疗不足以完全杀死肿瘤细胞，从而导致肿瘤病人对放化疗的耐受、也造成肿瘤的复发和转移[Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10 :105-111 ；Lee CH 等，2005，MolecularTherapy 11:707-716]。根据这一实际情况，在针对实体瘤的基因治疗研究领域，开发靶向于实体瘤内部缺氧坏死区的基因运载表达体系成为了近年的研究重点。一些厌氧或兼性厌氧细菌如 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，梭状芽孢杆菌(generaClostridium)和双歧杆菌(Bifidobacterium)，可以在系统性感染后，选择性地在实体瘤内缺氧区定殖生长[Patyar S 等，2010, Journal of Biomedical Science 17 21 ；Li X 等，2003, Cancer Gene Therapy 10 :105-111]，与此同时它们还能刺激机体产生免疫抗肿瘤效应[Lee CH 等，2009, Journal of Immunotherapy 32 :376-388 ；ChenG 等，2009, Cancer Science 100 :2437-2443；Avogadri F 等，2005， Cancer Research65 :3920-3927；Liu T 等，2010， Cancer Gene Therapy 17 :97-108 ；Eisenstein TK 等，2001, Microbes and Infection 3 1223-1231]。近年来，科学家们已经利用鼠伤寒沙门氏菌作为基因治疗的肿瘤靶向性载体进行了一系列工作，并且取得了可喜的效果。在这些研究工作中，研究人员对于如何使抗肿瘤的治疗基因进行表达开展了一系列尝试，他们或者尝试了一些原核生物的启动子，比如阿拉伯糖诱导启动子、外膜孔蛋白C(ompC)启动子，或者采用了真核细胞组成型启动子如 β-actin启动子，或者真核细胞中的辐射诱导启动子等，它们都表现出了较显著的抑制肿瘤生长作用[Ganai S等，2009，British Journal of Cancer 101 :1683-1691 ；Brader P等， 2008, Clinical Cancer Research 14 :2295-2302 ；Weth R^,2001, Cancer GeneTherapy 8 :599-611 ；Loessner H 等，2007，Cellular Microbiology 9 :1529-1537 ；Nguyen VH 等，
32010, Cancer Research 70 :18-23 ；Loeffler M ^,2007, Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of Americal04 12879-12883 ；LoeffIer M 等，2008，Journal of the National Cancer InstitutelOO :1113-1116 ；Loeffler M 等，2008，Cancer Gene Therapy 15 :787-794 ；Loeffler M 等，2009，Cancer Immunology Immunotherapy 58 :769-775 ；Lee CH ·，2004， Journalof Gene Medicine 6 :1382-1393 ； Lee CH等，2005,Cancer Gene Therapy 12 :175-184 ；King I等，2002,Human Gene Therapy 13 :1225-1233 ；Li YH 等，2001，hternationalJournal of Cancer 94 :438-443]。然而，在上述基因治疗表达体系中依然存在一些问题如，(1)基因表达的质粒载体在体内的稳定性较差、容易丢失；( 尽管肿瘤组织靶向性细菌在肿瘤组织中高度富集，具有较好的肿瘤靶向性，但是这并不表明它们在其它正常组织中不分布或者不存在，例如，鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)就在肝脏和脾脏中存在，因此，治疗基因会在正常组织中进行表达，导致治疗基因非肿瘤组织特异性的表达，从而产生体内毒性；C3)在绝大多数的以往研究中，治疗基因在体内表达水平较低、无法利用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹(Western blot)方法进行目标治疗基因的表达检测[Weth R等，2001，Cancer Gene Therapy 8 599-611 ；Li YH ^,2001, International Journal ofCancer 94 :438-443 ；Pawelek JM 等，1997，Cancer Research 57 :4537-4544 ；Liu SC 等，2002，Gene Therapy 9:291-306; Nemunaitis J 等，2003, Cancer Gene TherapylO :737-744]。如何解决上述肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗中的关键难题，实现治疗基因在肿瘤靶向性细菌中肿瘤组织选择性的、可检测的高水平的表达，同时也在体内具有良好的质粒稳定性，从而保证肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗不仅具有良好、持续的治疗效果，同时降低治疗的毒副作用，这是肿瘤靶向性基因治疗的亟待突破之处。
发明内容
针对厌氧靶向性细菌介导的基因治疗中存在的上述关键难题，本发明的目的旨在发明一种在利用厌氧靶向性细菌进行基因治疗的过程中实现治疗基因在厌氧组织中选择性地、可检测地高水平表达，同时又使得治疗基因在体内具有良好的质粒稳定性的方法，从而保证厌氧靶向性细菌介导的基因治疗不仅具有良好、持续的治疗效果，同时降低治疗的毒副作用。为达到上述目的，本发明的技术方案是利用缺氧或无氧诱导的原核细菌亚硝基还原酶启动子PnirB作为治疗基因的启动子，使得治疗基因能够在低氧或者乏氧的环境中表达。nirB启动子在原核细菌中高度保守。其序列在各种大肠杆菌亚种中(大肠杆菌 DHU BW2952,55989, HS、UMN026、SE15、SMS-3-5、IAI39、ABU 83972,536, CFT073、UM146、 IHE3034、EDla, S88、APEC 01、UTI89、LF82、042、TW14359、ΤΒ182Α、87_14、86_24、493/89，大肠杆菌 Κ12 菌株 DH10B、W3110、MG1655 亚菌株，大肠杆菌 ETEC H10407.BL21 (DE3)、REL606、 BL21-Gold(DE3)pLysS AG、SEll、E24377A、IAIl、ATCC 8739、ATCC 35469，大肠杆菌 055: H7 菌株 CB9615、0103:H2、0111 :H-菌株 11128、0157:H7 菌株 TW14359, 0157:H7 菌株 EC4115、 0157:H7 菌株 Sakai、0157:H7 EDL933、026:H11 菌株 11368、0127:H6 E2348/69)相同性高达95%以上；在弗累克斯讷氏杆菌各亚种中(弗累克斯讷氏杆菌5菌株8401、加菌株 30U2a菌株M57T，弗累克斯讷氏杆菌2002017)，其DNA序列相同性高达98%以上；在志贺氏菌各亚种中(波伊德氏志贺氏菌Sb227、⑶C 3083-94，索氏志贺菌&046，痢疾志贺氏菌Sdl97)，其启动子DNA序列相同性高达97% ；在柠檬酸杆菌各亚种中(克氏柠檬酸杆菌 ATCC BAA-895,鼠类柠檬酸杆菌ICC168)，其DNA序列相同性高达88%以上；在肠杆菌各亚种中(Cronobacter肠杆菌z3032，阪崎肠杆菌ATCCBAA-894，阴沟肠杆菌SCF1)，其DNA序列相同性高达83 %以上；在克雷伯氏菌各亚种中(内克雷伯氏菌At-22，肺炎克雷伯氏菌 342.NTUH-K2044,肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种MGH 78578)，其DNA序列相同性高达82%以上， 在沙门氏菌各亚种中(肠鼠伤寒沙门氏菌LT2、SL1344、14(^8S、D23580，肠鼠阿戈纳沙门氏菌SL483、肠鼠海德堡沙门氏菌SL476、肠甲型副伤寒沙门氏菌AKU 12601，肠甲型副伤寒沙门氏菌ATCC 9150，肠丙型副伤寒沙门苗RKS4594，鼠肠炎沙门氏菌P125109，肠鼠都柏林沙门氏菌CT 02021853，肠鼠纽波特沙门氏菌SL254，猪霍乱沙门氏菌79500、SC-B67，肠炎沙门氏菌观7/91，施瓦曾格隆得沙门氏菌CVM19633，副伤寒沙门氏菌SPB7，鼠伤寒沙门氏菌 Ty2、CT18，亚利桑那沙门氏菌62 z4, z23 ―)，其DNA序列相同性高达78%以上。以上序列保守性都是按照序列相同性进行分析、比较和计算，如果按照生物信息学常用的序列同源性比较、即序列相似性进行分析比较，以上序列的保守性将更高！因此，nirB启动子在细菌中高度保守，原核细菌的nirB启动子均能够作为厌氧靶向性细菌介导的基因治疗的启动子。进一步地，一种nirB启动子驱动的治疗基因的克隆方法，利用该方法将nirB启动子驱动的治疗基因克隆在含有原核复制子的质粒中，能够在低氧或者乏氧的环境下实现治疗基因在厌氧靶向性细菌中的表达。进一步地，一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧靶向性细菌中稳定存在的克隆方法，将nirB启动子及其控制下的治疗基因克隆在低拷贝质粒中，能够实现nirB启动子及其控制下的治疗基因在体内环境中在厌氧靶向性细菌中的稳定存在。进一步地，一种含有nirB启动子驱动的治疗基因的表达菌株制备方法，将上述克隆有nirB启动子驱动的治疗基因的质粒载体转化在厌氧靶向性细菌中。进一步地，一种低毒性的含有nirB启动子驱动的治疗基因的表达菌株递送到体内的方法，将含有nirB启动子驱动的治疗基因的表达菌株通过口服途径，能够将含有nirB 启动子驱动的治疗基因的表达菌株递送到体内，能够实现其在厌氧组织中的靶向性聚集， 同时毒副作用明显低于其它常规方法。进一步地，一种含有nirB启动子驱动的治疗基因的厌氧靶向细菌在体内在厌氧组织中的靶向性递送和厌氧组织选择性表达的方法，将上述含有nirB启动子驱动的治疗基因的厌氧靶向细菌通过腹腔注射、静脉注射或者口服的方法传送到体内，能够高水平地在厌氧组织中表达治疗基因、而在其它正常组织中不表达治疗基因。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物中的应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物与化学药物的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物与化疗药物的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物与中药的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧肿瘤组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧肿瘤靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与化学药物的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧肿瘤组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧肿瘤靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与化疗药物的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧肿瘤组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧肿瘤组织靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与化疗药物的联合应用。进一步地，利用上述的一种nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧肿瘤组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧肿瘤组织靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与中药的联合应用。与已有的厌氧靶向性细菌为传输系统的肿瘤基因治疗相比较，本发明的特色和创新之处在于(1)本发明不但借助于厌氧靶向性细菌实现了治疗基因在厌氧组织(包括肿瘤组织)的靶向性输送，而且利用原核的nirB启动子使得治疗基因只在低氧或者乏氧的肿瘤组织核心区表达，从而有效避免了治疗基因在一些正常组织中的表达，进一步降低了因为治疗基因表达带来的潜在体内毒性。也有研究者曾尝试利用肿瘤靶向性细菌携带真核细胞中辐射诱导型启动子来实现治疗基因在肿瘤组织中的选择性表达，但是这种肿瘤组织选择性的表达首先是需要放射性诱导的，放射性本身能够杀死治疗细菌；其次，真核生物辐射诱导型启动子如何在原核的肿瘤靶向性细菌中工作，这是一个在理论上存在疑问的方法，也许能够表达的治疗基因只是由于细菌死亡而进入肿瘤细胞内的、带有真核辐射诱导型启动子的表达质粒；而且，确实在上述真核辐射诱导型启动子介导的基因治疗中从未能提供过任何治疗基因表达的直接证据。相形之下，本发明实现了治疗基因在厌氧组织中特异性的递送再加上治疗基因在厌氧组织中选择性的表达，这种治疗基因在厌氧组织中选择性的表达利用了厌氧的肿瘤组织核心区域所具有的低氧或者乏氧特征，不需要人为的、额外的诱导。 本发明构建的这种厌氧组织基因治疗的双重选择性/特异性方法是目前国际基因治疗领域前所未见的发明创造，解决了基因治疗领域最为困扰的难题之一。(2)本发明首次发现厌氧靶向性细菌传输的不同拷贝数的质粒载体在体内的稳定性不同，低拷贝数的质粒能够使携带的治疗基因在体内更稳定地存在，从而展现出更好的治疗效果。迄今为止，从未有任何研究报道或者发明关注过质粒拷贝数对厌氧靶向性细菌所携带的治疗基因在体内稳定性的影响，也从未有人注意过质粒拷贝数竟然能够影响厌氧靶向性细菌介导的治疗基因的治疗效果。(3)在绝大多数的以往有关肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗研究报道中，虽然都报道具有肿瘤治疗效果，但是治疗基因在体内外的表达水平较低、无法利用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹方法进行目标治疗基因的表达检测，因此如果能够提高治疗基因在肿瘤靶向性细菌中的表达水平、尤其是在体内的表达水平，将无疑大大提高基因治疗的抗肿瘤效果。在本发明的一种实现治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法中，治疗基因获得了高水平的表达，其表达无论在体内、还是体外都能够用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹方法直接检测。因此，本发明不仅解决了治疗基因在厌氧组织中特异性的递送和治疗基因在厌氧组织(包括肿瘤组织)中选择性表达的难题，而且解决了治疗基因在体内外、 及在肿瘤组织中高表达的问题，从而有力地保证了厌氧组织(包括肿瘤组织)靶向递送和选择性稳定表达的基因治疗方法制备的抗厌氧组织疾病(包括肿瘤)药物良好的治疗效^ ο因此，本发明建立了一种全新的实现治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法及其应用。
附图缩写说明VNP 减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 ；VNPpLuc :VNP携带Iuciferase基因质粒 (不含启动子)；VNPpBR =VNP携带pBR322空载质粒；VNPpTRAIL :VNP携带pTRAIL质粒； VNPpEndostatin =VNP 携带 pEndostatin 质粒；RSV 白藜芦醇图1. nirB启动子分析及体内体外缺氧环境特异性表达分析。1A.所构建载体的示意图黑色框表示nirB启动子，白色框表示待表达的基因1、 pNirBLuc ；2、pNirBeGFP ；3、pTRAIL ；4、pEndostatin ；5、pLuc () ；6、peGFP ( ^ 含启动子)。IB. TRAIL和Endostatin在缺氧环境中表达的Western blot分析含有质粒 pTRAIL和pEndostatin的减毒沙门氏菌在含有抗性的厌氧LB培养基中37°C培养48小时， 离心沉淀用于western blot分析。厌氧培养样品1、阳性对照(pET-28a-EndOStatin在 BL21中诱导表达的超声上清)；2、阴性对照(VNPpBR裂解上清)；3、1号VNPpEndostatin样品裂解上清；4、2号VNPpEndostatin样品裂解上清；5、3号VNPpEndostatin样品裂解上清； 6、阳性对照(TRAIL蛋白)；7、阴性对照(VNPpBR裂解上清)；8、1号VNPpTRAIL裂解上清; 9、2号VNPpTRAIL裂解上清。有氧培养样品10、阳性对照(pET-28a_Endostatin在BL21中诱导表达的超声上清)；11、阴性对照(VNPpBR裂解上清)；12、1号VNPpEndostatin样品裂解上清；13、2号VNPpEndostatin样品裂解上清；14、3号VNPpEndostatin样品裂解上清； 15、阳性对照(TRAIL蛋白)；16、阴性对照(VNPpBR裂解上清)；17、1号VNPpTRAIL裂解上清；18、2号VNPpTRAIL裂解上清。1C. nirB启动子控制下的荧光素酶报告基因在厌氧环境中的持续表达分析在细菌接种后M、36、72小时后，用荧光素酶报告基因试剂盒(美国Promega公司)检测细菌 VNPpNirBLuc和VNPpLuc (阴性对照)中荧光素酶的表达水平。数值用标准偏差来表示，每组三个重复样品，，VNPpLuc对于VNPpNirBLuc统计学分析呈极显著。ID. nirB启动子在肿瘤内选择性地诱导荧光素酶报告基因表达，在肝脏中则无明显表达1、VNPpLuc ；2、VNPpNirBLuc。IE. nirB启动子控制下的绿色荧光蛋白在厌氧环境中的持续表达分析在细菌接
7种后M小时，用荧光显微镜检测细菌VNPpNirBeGFP和VNPpeGFP (阴性对照)中GFP的表达1、VNPpNirBeGFP ；2, VNPpeGFP0IF肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗在动物体内不会导致额外的肝脏或脾脏重量变化:l>VNPpLuc ；2, VNPpNirBLuc0图2.细菌携带的不同拷贝数质粒载体PBR322或pUC18在体内稳定性分析。图3.低拷贝载体在体内具有很好的稳定性和肿瘤靶向性表达，治疗基因TRAIL和 Endostatin可以在肿瘤缺氧区显著地被诱导表达。3A. pBR322质粒携带TRAIL基因在肿瘤、肝脏和脾脏中都稳定不丢失，基因的表达也不会影响VNP的肿瘤靶向性实心黑色圆表示每克组织中的VNP的数量，黑色空心圆表示每克组织中携带有TRAIL基因的VNP的数量，数值误差由标准偏差表示，肿瘤中的细菌含量与肝脾中的具有极显著的差异，fp<0.001。3B.肿瘤内TRAIL表达的western blot检测GAPDH蛋白作为内参照，定量图分析采用灰度分析(采用软件Image J，购于美国NIH)方法比较TRAIL表达量与GAPDH表达量的比值1、空白对照样品；2、VNPpLuc处理后的肿瘤样品；3、VNPpTRAIL处理后的肿瘤样品； 4、TRAIL蛋白质条带；5、GAPDH蛋白质条带。3C.肿瘤内Endostatin表达的western blot检测GAPDH蛋白作为内参照，定量图分析采用灰度分析(采用软件Image J，购于美国NIH)方法比较Endostatin表达量与GAPDH表达量的比值1、VNPpLuc给药组肿瘤样品；2、VNPpEndostatin给药组肿瘤样品1 ；3、VNPpEndostatin给药组肿瘤样品2 ；4、VNPpEndostatin给药组肿瘤样品3 ；5、 Endostatin蛋白质条带；6、GAPDH蛋白质条带。3D.免疫组化检测TRAIL和Endostatin在肿瘤厌氧区诱导表达情况特征区域 (显微镜放大400倍)。肿瘤切片用抗体或IgG对照分别进行标记染色，选择厌氧坏死区和肿瘤新生区的边界来比较分析。每个实验重复三次1、VNPpTRAIL处理的IgG对照；2、 VNPpTRAIL处理的样品；3、VNPpEndostatin处理的样品。图4.细菌介导TRAIL基因治疗鼠黑色素瘤B16F10的疗效和细胞凋亡分析。
4A.腹腔给药VNPpTRAIL或VNPpLuc与TRAIL蛋白联用抗肿瘤效果的差异分析TRAIL基因治疗VNPpTRAIL组比细菌与TRAIL蛋白联用组有极显著的肿瘤抑制效果，
㈨/。每组8只动物。4B.肿瘤体积翻倍时间比较1、VNPpTRAIL ；2、VNPpLuc+TRAIL 蛋白。4C.肿瘤生长延滞时间比较1、VNPpTRAIL ；2、VNPpLuc+TRAIL 蛋白。4D.细菌VNPpTRAIL或VNPpLuc腹腔给药对肿瘤生长抑制效果比较VNPpTRAIL给药组比VNPpLuc对照组表现出显著的肿瘤生长抑制，VNPpTRAIL组比VNPpLuc组有显著的抗肿瘤效果，*P < 0. 05。每组7只动物。4E.细菌VNPpTRAIL或VNPpLuc腹腔给药对肿瘤模型小鼠存活的比较VNPpTRAIL 给药组比VNPpLuc对照组存活时间显著延长。4F.各治疗组肿瘤实物和肿瘤重量比较每组三只动物，基因治疗组VNPpTRAIL与对照组有极显著的差异，^pCft OW。基因治疗组VNPpTRAIL与VNPpLuc对照组有显著的差异， *p < 0. 05 :1、对照组；2、VNPpLuc 处理组；3、VNPpTRAIL 处理组。4G.肿瘤组织冰冻切片的TUNEL分析各组小鼠肿瘤冰冻切片进行TUNEL分析，分别采用DAB染色或不染(作为对照组)。100倍和400倍的图像表明，VNPpTRAIL组比其它组有更多的肿瘤细胞凋亡，黑色箭头指示凋亡细胞。1、对照组；2、VNPpLuc治疗组；3、 VNPpTRAIL 治疗组。图5.细菌介导Endostatin基因治疗小鼠黑色素瘤B16F10的疗效及其抑制血管生成效果。5A.腹腔给药细菌VNPpEndostatin或VNPpBR对肿瘤生长的疗效 VNPpEndostatin治疗组比VNPpBR治疗组以及未治疗对照组具有更显著的肿瘤生长抑制疗效，VNPpEndostatin治疗组比VNPpBR治疗组有显著的抑制肿瘤生长的效果，**p < 0. 01。 每组7只小鼠。5B.腹腔给药细菌VNPpEndostatin或VNPpBR对肿瘤动物模型生存率的影响 VNPpEndostatin治疗组比VNPpBR治疗组更显著地延长肿瘤动物模型的生存率。5C.各治疗组肿瘤实物图。5D.各治疗组肿瘤重量分析=VNPpEndostatin治疗组比VNPpBR治疗组肿瘤重量有极显著差异，icft㈨/。每组3只小鼠。1、对照组；2、VNPpBR治疗组；3、VNPpEndostatin治疗组。5E.各治疗组肿瘤体积翻倍时间比较1、对照组；2、VNPpBR治疗组；3、 VNPpEndostatin 治疗组。5F.各治疗组肿瘤生长延滞时间比较1、对照组；2、VNPpBR治疗组；3、 VNPpEndostatin 治疗组。5G.肿瘤血管的免疫组化分析给药后19天处死动物，对照组、VNPpBR治疗组和 VNPpEndostatin治疗组各组肿瘤切片用⑶31及其IgG对照抗体进行免疫组化染色，每组有 3只动物。5H.肿瘤内VEGF含量分析比较各组肿瘤组织勻浆后，ELISA检测上清中VEGF含量。VNPpEndostatin治疗组比对照组更显著地抑制VEGF表达广ρ < 0. 01，VNPpEndostatin 治疗组比.VNPpBR.治疗组显著抑制VEGF的表达Zp < 0. 05。1、对照组；2、VNPpBR治疗组； 3、VNPpEndostatin治疗组，每组4只动物。图6.白藜芦醇增强细菌介导的TRAIL基因治疗疗效，诱导更多的肿瘤细胞凋亡。6A.腹腔给药细菌VNPpTRAIL，VNPpLuc以及与白藜芦醇联用的肿瘤抑制疗效评价用白藜芦醇进行腹腔给药，连续给药15天，每日一次，白藜芦醇能显著增强黑色素瘤对 TRAIL基因治疗的敏感性，VNPpTRAIL+RSV联合治疗组比VNPpTRAIL治疗组具有更加显著的抗肿瘤效果，*P <0.05。6B.腹腔给药细菌VNPpTRAIL，VNPpLuc以及与白藜芦醇联用对肿瘤动物模型存活的影响VNPpTRAIL+RSV联合治疗组比VNPpTRAIL治疗组能更显著地延长动物的存活时间。6C.联用治疗组的肿瘤体积翻倍时间显著延长1、VNPpTRAIL+RSV联用组；2、 VNPpLuc+RSV联用组；3、RSV (白藜芦醇)单独治疗组；4、VNPpTRAIL治疗组；5、VNPpLuc治疗组；6、对照组-JpCO.OOL·6D.联用治疗组的肿瘤生长延滞的时间显著延长1、VNPpTRAIL+RSV联用组；2、 VNPpLuc+RSV联用组；3、RSV (白藜芦醇)单独治疗组；4、VNPpTRAIL治疗组；5、VNPpLuc治疗组；6、对照组-JpCO.OOL·
6E.各治疗组肿瘤组织细胞凋亡的western blot分析白藜芦醇和细菌介导的TRAIL基因治疗联用促进更多的CaspaseU的活化和肿瘤细胞的凋亡。1、RSV治疗组；2、VNPpTRAIL 治疗组；3、VNPpTRAIL+RSV 联用治疗组；4、Caspase-8 酶原；5、活化的 Caspase-8 ；6>Caspase-3 g|J|C -J^Caspase-3 ；8> α _ ^tigg06F各治疗组肿瘤组织切片的TUNEL分析白藜芦醇可以增强肿瘤细胞凋亡。在光学显微镜下进行计数TUNEL阳性细胞(棕黑色所示，放大400倍)随机调选三个视野、约有400个细胞QOO倍放大)，对每个视野的阳性细胞进行计数。每只动物的肿瘤组织有4 张切片，每组有3只动物。VNPpTRAIL+RSV联用治疗组比.VNPpTRAIL组有极显著的诱导肿瘤细胞凋亡的效果，icft㈨/。1、RSV处理组；2、VNPpTRAIL处理组；3、VNPpTRAIL+RSV联用组。图7.雷公藤内酯醇(Trip)促进VNPpTRAIL的抗肿瘤疗效。7A.雷公藤内酯醇促进VNPpTRAIL抑制肿瘤生长VNPpTRAIL+Trip治疗组相对于 VNPpLuc+Trip治疗组或VNPpTRAIL治疗组具有显著的抑瘤效果，< 0. 05，每组8只动物。7B.不同给药组荷瘤小鼠的生存情况比较雷公藤内酯醇可显著延长VNPpTRAIL 和VNPpLuc细菌治疗组荷瘤小鼠的生存，每组8只动物。图8.细菌介导的由厌氧启动子PnirB和组成型原核启动子Ptrc驱动的TRAIL基因治疗在小鼠B16F10肿瘤模型的治疗效果比较分析。8A. Ptrc启动子和PnirB启动子对TRAIL细菌基因治疗抗肿瘤功能的影响不同细菌治疗组VNPpBR (空载对照)，VNPpTrc-TRAIL或VNPpnirB-TRAIL抑制肿瘤生长情况比较。建模后第22天，VNPpnirB-TRAIL治疗组较VNPpTrc-TRAIL或VNPpBR(空载对照)治疗组有显著的抑瘤效果，*P <0. 05,每组6只动物。8B. Ptrc启动子和PnirB启动子在TRAIL细菌基因治疗中对动物体重的影响不同细菌治疗组VNPpBR (空载对照)，VNPpTrc-TRAIL或VNPpnirB-TRAIL给药后第6天，处死小鼠，对小鼠体重进行称量，并进行统计学分析。VNPpTrc-TRAIL治疗组小鼠体重明显低于 VNPpnirB-TRAIL治疗组，Y < 0. 05，每组3只动物。8C. Ptrc启动子和PnirB启动子在TRAIL细菌基因治疗中对肝脏重量的影响 VNPpTrc-TRAIL治疗组小鼠肝脏明显重于VNPpnirB-TRAIL治疗组，呈现肿大状态，
<0. 05，每组3只动物。8D. Ptrc启动子和PnirB启动子在TRAIL细菌基因治疗中对脾脏重量的影响 VNPpTrc-TRAIL治疗组小鼠脾脏明显重于VNPpnirB-TRAIL治疗组，呈现肿大状态，
<0. 05，每组3只动物。
具体实施例方式实施例表1.基因克隆和重组质粒构建所用引物。
权利要求
1.一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是由厌氧靶向性细菌介导的原核生物厌氧诱导的原核细菌亚硝基还原酶启动子PnirB作为治疗基因启动子的基因治疗，使得治疗基因能够在体内外低氧或者乏氧的环境中特异性表达，其中， PnirB启动子是指原核细菌的nirB启动子。
2.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是nirB启动子驱动的治疗基因的克隆方法将nirB启动子驱动的治疗基因克隆在含有原核复制子的质粒中；nirB启动子驱动的治疗基因在厌氧靶向性细菌中稳定存在的克隆方法将nirB启动子及其控制下的治疗基因克隆在较低拷贝质粒中，实现nirB启动子及其控制下的治疗基因在体内环境中在厌氧靶向性细菌中的稳定存在和稳定表达。
3.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是含有nirB启动子驱动的治疗基因表达菌株的制备方法将克隆有nirB启动子驱动的治疗基因的质粒载体转化在厌氧靶向性细菌中。
4.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是含有nirB启动子驱动的治疗基因的表达菌株递送到体内的方法将含有nirB 启动子驱动的治疗基因的表达菌株通过腹腔注射、静脉注射及口服的方法传送到体内，实现其在在厌氧组织中高效表达治疗基因、在其它正常组织中不表达治疗基因，其中口服给药具有给药方便，低毒副作用的特点。
5.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物与化学药物或者中药联合治疗厌氧组织疾病药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的一种治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与抗肿瘤化疗药物或辅助治疗化学药物或中药联合治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求1所述的一种治疗基因在肿瘤组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与白藜芦醇联合治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的一种治疗基因在肿瘤组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物与雷公藤内酯醇联合治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一种实现治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，该方法主要由原核生物厌氧诱导的原核细菌亚硝基还原酶启动子PnirB作为治疗基因启动子，厌氧靶向细菌，低拷贝质粒等组成，使得治疗基因能够在体内外低氧或者乏氧的环境中特异性表达。利用该治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法能够更有效地治疗包括肿瘤在内的厌氧组织疾病，或者与其他化学药物及中药联合使用治疗包括肿瘤在内的厌氧组织疾病，也可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK102477440SQ20101056501
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者华子春, 陈健翔, 韦栋平 申请人:南京大学