专利名称：金纳米棒在雄性避孕中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及金纳米棒在雄性避孕中的用途，具体地，在雄性宠物动物和人类男性避孕中的用途。
背景技术：
目前，国内外已经研究出多种具有光热转换型的纳米材料，例如团聚的金纳米颗粒(Zharov, Galitovskaya et al. 2005 ；Huang, Jain et al. 2008),金纳米壳(Hirsch,Stafford et al. 2003 ；Loo, Lowery et al. 2005 ；Kim,Park et al. 2006),金纳米笼(Chen,Wang et al. 2007 ；Yavuz, Cheng et al. 2009 ；Chen, Glaus et al. 2010),树枝状空心的AuAg (Hu, Huang et al. 2008),碳纳米管(Chakravarty, Marches et al. 2008),金包碳纳米管(Kim, Galanzha et al. 2009),硫化铜纳米颗粒(Li, Lu et al. 2010)和金纳米棒(Sauand Murphy 2004 ；Alkilany, Nagaria et al. 2009 ；Choi, Kim et al. 2011)。通过文 献报道，在实际合成过程中通过改变反应条件，能够精确的调节金纳米棒的长短径比例，使金纳米棒在近红外光区有很好的光吸收和光热转化的能力，且在 800nm时的光热转化效率最高。同时由于容易合成不同尺寸的金纳米棒，很容易对金纳米棒进行表面修饰，以及金纳米棒有很高的稳定性(Huang, Barua et al. 2009 ；Zhou, Shao et al. 2010)。所以金纳米棒在光热治疗实体瘤方面已有很好的研究成果(Jang, Park et al. 2011 ；Huang, El-Sayedet al. 2006；Tong, Zhao et al. 2007 ；von Maltzahn, Centrone et al. 2009 ；Chen, Kuo etal. 2010 ；Kuo, Chang et al. 2010)。许多科学家已经关注于金纳米棒的光热治疗方面的研究，认为肿瘤细胞死亡的机制是高的温度导致了蛋白质的变性(Lepock 2003 ；He, Wolkerset al.2004)。然而关于金纳米棒的光热效应在其他方面的研究与应用有待发展。我们关注一个重要的问题就是随着人类文明的前进，越来越多的宠物走进了人们的家庭。美国有研究表明一半以上的家庭都宠物(Olson and Moulton 1993)。尽管没有关于宠物数量的具体数字，但美国的社会评估认为每年8-10百万只动物进入收容站，每年有4-5百万只动物被处死(Kutzler and Wood 2006)。被抛弃的猫狗可能会给人或其他动物传播疾病。然而面对这些过量的动物，传统的避孕措施主要是手术方法(Howe 2006)。因此必须开发一种简单、高效、快捷、省钱的雄性避孕方法。很多研究发现高热能够破坏睾丸的功能，甚至导致雄性不育。也有一些用高热来避孕的理念和研究，但避孕效果并不是很理想(Mieusset,Bujan et al. 1987 ；Salisz,Kasset al. 1991 ；Lerchl, Keck et al. 1993 ;Mieusset，Bengoudifa et al. 2007 ；Paul, Murrayet al. 2008) 0目前尚未有研究人员将金纳米棒的光热效应与高热避孕结合起来研究。同时，是否能通过调节近红外光的照射强度和金纳米棒的浓度来实现可控的雄性的避孕，且目前国内外尚无相关的研究报道。
发明内容
为解决现有技术中的上述问题，本发明的目的是利用金纳米棒的光热效应与高热避孕结合起来，实现快捷高效的雄性避孕。同时，通过调节近红外光的剂量来控制金纳米棒的光热效应，从而实现可控的雄性避孕效果。因此，在第一个方面，本发明提供了金纳米棒在制备用于雄性避孕的药物中的用途，其特征在于所述金纳米棒在近红外区，尤其是在808nm处具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰。在一个实施方案中，所述金纳米棒与近 红外光照射结合使用。在一个优选的实施方案中，所述金纳米棒产生的光热效应通过调节金纳米棒的浓度或近红外光的剂量来控制。在本发明中，根据本发明的药物可以用于脊椎动物，包括宠物动物如宠物犬、猫等，以及人。在第二个方面，本发明提供了一种对需要避孕的雄性脊椎动物进行可控避孕的方法，该方法将金纳米棒施用于所述脊椎动物，并结合近红外光照射所述脊椎动物以足以达到避孕的照射剂量和照射时间，其中所述金纳米棒在近红外区，尤其是在808nm处具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰。在本发明的方法中，所述金纳米棒产生的光热效应通过调节金纳米棒的浓度或近红外光的剂量来控制。在本发明的方法中，所述脊椎动物包括宠物动物如宠物犬、宠物猫等，以及人。有益效果本发明首次将比较成熟的金纳米棒的光热效应的应用和高热避孕结合起来，发现了金纳米棒和睾丸温度的变化之间关系，通过系统研究实验小鼠的多个生理指标，实现了用金纳米棒的可控的光热效应，从而实现可控的避孕效果。结果表明本发明的方法是一种简单、高效、快捷、廉价的避孕方法。
图I.金纳米棒的性质表征。(A)透射电镜图片显示溴化十二烷基三甲基铵包被的金纳米棒(左图)和聚乙二醇包被的金纳米棒(右图)的形状与大小；(B)紫外可见光光谱图表明溴化十二烷基三甲基铵包被的金纳米棒(黑线)和聚乙二醇包被的金纳米棒(红线)的表面等离子共振吸收峰。图2.聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光处理后，睾丸温度与近红外线照射剂量和聚乙二醇包被的金纳米棒浓度的变化关系。⑷在近红外光照射IW ·αιΓ2，IOmin时，睾丸温度变化与磷酸盐缓冲盐水或20D聚乙二醇包被的金纳米棒(该浓度和用量下的金纳米棒在808nm处的紫外可见吸收光谱值为2. 000即为20D)之间的关系；(B)在近红外光照射O. 8W · cm_2，IOmin时，睾丸温度变化与磷酸盐缓冲盐水，20D聚乙二醇包被的金纳米棒或I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒之间的关系。数据显示平均值土标准差(mean土 SD)。图3.在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · CnT2和O. 8W · cnT2，IOmin处理后，小鼠生理指标的评价结果。
(A)聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，在不同时间点各组小鼠的体重变化(左IW · cm 2，右O. 8W · cm 2)；(B)聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，上面的图片是小鼠睾丸的红外(IR flash thermal)图，下面的是7天后小鼠睾丸图(左IW · cnT2,右O. 8W · cnT2)；(C)聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，睾丸和附睾指数的变化情况(左 IW · cm 2，右 O. 8W · cm 2)。数据显示平均值土标准差(mean土 SD)。*P < O. 05，**P < O. 01图4.在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · cnT2，IOmin处理后的睾丸形态学。(A)聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，在不同时间点，各组小鼠睾丸切片苏木素伊红染色(1W · Cm-2)。标尺为100 μ m ; (B)聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，在不同时间点，各组小鼠睾丸切片苏木素伊红染色(O. 8W · cm-2)。标尺为100 μ m。图5.免疫印迹方法显示聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · an2, IOmin处理后睾丸中凋亡蛋白的变化。(A)考马斯亮蓝染色聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理7天后睾丸中总蛋白(左 IW · cnT2,右 O. 8W · cnT2)；(B)免疫印迹方法分析聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，凋亡蛋白变化(左 IW · cm 2,右 O. 8W · cm 2)。图6.免疫印迹方法显示聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · cnT2, IOmin处理后睾丸中血睾屏障相关蛋白的变化。免疫印迹方法分析聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，血睾屏障相关蛋白变化(左IW · cnT2，右O. 8W · cnT2)。图7.在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · cnT2，IOmin后，小鼠激素水平。聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射处理后，用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测了各时间点的小鼠卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，睾酮⑴的水平(上lW.cnT2，下 O. 8ff. cm 2)。图8.在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · cnT2，IOmin处理后，小鼠的生育率检测。⑷在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cm_2，IOmin, 7天后小鼠生育率为零(左)。在20D聚乙二醇包被的金纳米棒或I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射O. 8W · cm—2，10min，7天后小鼠生育率为10% (右)。(B)在20D聚乙二醇包被的金纳米棒或聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射O. 8W · cm2, IOmin, 60天后小鼠生育率约为50% 图9是近红外光照射方法方案I的操作示意图。
具体实施例方式在一个方面，本发明提供了金纳米棒在制备用于雄性避孕的药物中的用途，其中所述金纳米棒在近红外区具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰。在另一个方面，本发明提供了一种对需要避孕的雄性脊椎动物进行可控避孕的方法，该方法将金纳米棒施用于所述脊椎动物，并结合近红外光照射所述脊椎动物以足以达到避孕的照射剂量和照射时间。在本发明中，金纳米棒的施用方法可以采用雄性性腺或性器官部位处局部注射、经静脉注射，或与本领域中已知的靶向脊椎动物雄性性腺或性器官的靶向递送载体结合后局部注射或经静脉注射。本领域技术人员要理解的是，在 本发明中，术语“近红外区”是指780 IlOOnm的近红外短波区。尽管本发明的金纳米棒在 SOOnm时的光热转化效率最高，但只要在上述的近红外光区有很好的光吸收和光热转化的能力的金纳米棒，均可以实现本发明的目的和技术效果。因此，在本发明中，金纳米棒的选择不受限制，只要能够在780 IlOOnm的近红外短波区具有良好的光吸收和光热转化能力即可，并且优选在790 830nm，更优选在约800nm (如约790nm、795nm、800nm、805nm、8 IOnm)附近，最优选在大约808nm处具有良好的光吸收和光热转化能力(在本发明中，大约的含义表示所指的数值±5%的范围)。术语“纵向表面等离子共振吸收峰”是指在紫外可见光光谱中所测量到的纵向表面等离子共振吸收峰。在本发明中，“近红外光”的波长选择优选与金纳米棒的光热转换性质相对应，即其应与金纳米棒的最强纵向表面等离子共振吸收峰所对应的波长基本相同。对于其“照射剂量”和“照射时间”，可以根据具体的近红外光发射装置和金纳米棒的应用浓度来适当调节。例如，当所使用的近红外光发射装置无法改变照射剂量或照射时间难以精确控制时，可以适度调整金纳米棒的浓度(在本发明中，金纳米棒的浓度可以用在所选择的近红外区波长例如808nm处的紫外可见吸收光谱值来表征)来调节所需的避孕效果；而当金纳米棒的浓度为最适浓度或不适于改变时，可以通过调节近红外光的照射剂量和照射时间来调节所需的避孕效果。此外，“照射剂量”和“照射时间”还应考虑所应用的物种，例如，犬、猫、鼠或人等，以及该物质的体重或体表面积、照射部位的大小和面积等等。关于“照射剂量”和“照射时间”的选择和调整可以参照本发明实施例中所采用的具体剂量和时间，一般来说，“照射剂量”和“照射时间”的常用范围，对于小鼠参考值为金纳米棒的O. 50D 100D，近红外光功率为O. I 3W · cnT2，时间为5 30分钟。该组合能够达到温度在37 45°C的范围内应该都是可以的。本领域技术人员可以基于小鼠的数据，估算其他物种的大体照射剂量和照射时间范围。在本发明中，近红外光的照射部位可以选择雄性脊椎动物的性器官部位，照射面积覆盖性器官的表面积即可。应注意的是，在本发明中，术语“宠物动物”是指人们为了消除孤寂或出于娱乐目的而豢养的动物，其一般是脊椎动物，优选哺乳纲动物，如犬、猫和人等，不包括宠物鸟类或禽类。在本发明的一个实施方案中，金纳米棒具有均匀的粒径和长径比(例如，I 4)。但是，如上所述，只要金纳米棒在近红外区具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰，均可以实现本发明。因此，本领域技术人员要理解的是尽管本发明优选具有均匀的粒径和长径比的金纳米棒，但其不是实现本发明的决定因素。在本发明中，金纳米棒可以被聚乙二醇或以聚乙二醇为重复单元的聚合物包被。
在本发明中，金纳米棒可以进行适当的修饰以用于稳定化。根据已有文献和专利报道，金纳米棒可以用相对较多的物质进行稳定，其中包括十六烷基三甲基溴化铵、硫辛酸、或末端被巯基修饰的聚乙二醇等，这些都是基于硫或氮等原子与金纳米棒中的金原子发生原子之间共价或非共价键的化学物理作用来进行的，尤其是硫原子与金原子的相对作用能力非常强。基于此，含有硫原子的小分子或者高分子链很多都可以用来对金纳米棒进行稳定，且并不改变金纳米棒在808nm处得吸收，从而可以用来进行体内的光热效应的实验(Gole and Murphy 2008 ；Huang,Neretina et al. 2009)。因此，本发明的金纳米棒可以选择具有生物相容性的常用金纳米棒修饰材料(例如，含硫原子或氮原子，或优选含有巯基端基的材料)进行稳定化，如硫辛酸稳定的不同分子量的聚乙二醇或聚氨基酸等。在本发明的具体实施方案中，金纳米棒可以被聚乙二醇或以聚乙二醇为重复单元的聚合物包被。在此要说明的是，本发明所希望保护的金纳米棒并不仅限于本发明所提出的聚乙二醇包被的金纳米棒，之所以选择聚乙二醇包被的金纳米棒，更多的考虑是其生物安全性，尤其是在人体中应用的安全性，而其他不同分子量和不同组分包被的金纳米棒也存在同样的光热效应和实际应用潜力。
以下通过实施例对本发明做进一步说明。实施例仅用来说明本发明的实施方法和效果，并不以任何形式限制本发明。实施例I :金纳米棒的制备一、制备金纳米棒的材料材料α-羟基-ω -甲氧基聚乙二醇(Mn = 5000，HO-PEG-OCH3)，购自 FlukaChemicals 公司。甲苯，购于国药集团化学试剂有限公司。二环己基碳二亚胺(DCC，CAS :538-75-0,Mw = 206. 33g moΓ1)，购于上海共价化学
公司并直接使用。DL-α-硫辛酸((±) - a-Lipoic acid, CAS 1077-28-7, Mw = 206. 33g πιοΓ1)，购自Sigma-Aldrich公司，直接使用。4- 二甲氨基吡啶(DMAP，CAS : 1122-58-3，Mw = 122. 17g moF1),购于Sigma-Aldrich公司，直接使用。二氯甲烷(CH2Cl2)，购于国药集团化学试剂有限公司。四水合氯金酸(HAuCl4· 4H20, CAS : 16916-25-4，Mw = 393. 833g mo Γ1)，购于国药集团化学试剂有限公司，配制成IOmM(4. 12mg ml/1)溶液使用。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，CAS:57-9-0, Mw = 364. 46g moF1)，购于Sigma-Aldrich 公司，配制成 IOOmM (36. 446mg mL :)溶液使用。硼氢化钠(NaBH4,CAS : 16940-66-2，Mw = 37. 83g πιοΓ1)，购于 Sigma-Aldrich 公司，配制成IOmM (0. 3783mg mL—1)溶液使用，并保持4摄氏度储存。硝酸银(AgNO3,CAS :7761-88-8,Mw = 169. 88g moF1),购于 Sigma-Aldrich 公司，配制成10mM(l. 6988mg ml/1)溶液使用。L-朽1 樣酸(L-Ascorbic acid, CAS :50-81-7, Mw = 176. 12g moF1),购于Sigma-Aldrich 公司，配制成 IOmM (17. 612mg mL :)溶液使用。透析袋(截留分子量为14000Da)，购自上海绿鸟公司。
二、金纳米棒的制备方法I. α-硫辛酸基-ω-甲氧基聚乙二醇的合成HO-PEG-OCH3 (I. Og, O. 200mmol)使用甲苯共沸除水并干燥过夜后，用干燥的CH2Cl2溶解。向溶液中加入 α-硫辛酸(60mg,0. 291mmol), DCC (60mg，O. 291mmol)，DMAP (28mg,0. 228mmol)，并在室温下搅拌2天。过滤除掉不溶物后，使用旋转蒸发仪浓缩体系并用乙醚沉淀两次得到产物0-硫辛酸基-(0-甲氧基聚乙二醇(LA-PEG-OCH3),产率为70%。2.聚乙二醇包被的金纳米棒的 合成种子的制备加入250 μ L氯金酸溶液至7. 5mL溴化十二烷基三甲基铵溶液中充分混合。再加入600 μ LNaBH4溶液，超声处理2min直至溶液变为红棕色。金纳米棒的制备将40mL溴化十二烷基三甲基铵溶液加入IOOmL反应瓶，依次加入I. 7mL氯金酸溶液，250 μ L硝酸银溶液和270 μ L柠檬酸溶液，搅拌均匀并通过超声使之变为澄清溶液。加入840 μ L种子溶液，在室温静置lh。反应后得到的溶液在HOOOrpm下进行两次离心，除去过量的溴化十二烷基三甲基铵，将离心后的颗粒收集并浓缩体系至10mL，加入4mg LA-PEG-OCH3并在室温下搅拌反应48h。用超纯水对体系透析(截留分子量14000Da)48h除去游离的溴化十二烷基三甲基铵，既得产物聚乙二醇包被的金纳米棒。三、金纳米棒的性质表征I.紫外可见光光谱图溴化十二烷基三甲基铵包被的金纳米棒和聚乙二醇包被的金纳米棒溶液放入石英比色皿中，用Shimadzu UV 2501分光光度计测得紫外可见光光谱图。2.透射电镜图吸一滴溴化十二烷基三甲基铵包被的金纳米棒或聚乙二醇包被的金纳米棒溶液，滴到230目的铜网上，晾干，使用JEOL 2010高分辨率透射电镜(200KV)拍照。实施例2 :睾丸的温度变化与近红外光照射剂量和聚乙二醇包被的金纳米棒浓度关系分析一、实验小鼠ICR小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，在中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心饲养，实验动物遵循标准操作规程，并经中国科学技术大学实验动物伦理审查。二、具体近红外光照射操作方法(如图9中所示的方案I)I用戊巴比妥钠麻醉8周大雄性ICR鼠，2每侧睾丸原位注射体积约35 μ L磷酸盐缓冲盐水或聚乙二醇包被的金纳米棒，3用自制的小铁条架卡住阴囊，防止睾丸收入腹腔，4将小鼠四肢固定起来，5用近红外光照射睾丸，光斑面积为两平方厘米，I.持续照射lOmin，同时用红外照相机拍下照片，分析睾丸温度变化。三、运用温度成像分析软件(Infrared Cameras Inc.)分析睾丸处的温度变化实施例3 :在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射1W. cm_2和O. 8ff. cm_2，IOmin处理后，小鼠生理指标的评价结果。一、具体近红外光照射操作方法
I.用戊巴比妥钠麻醉8周大雄性ICR鼠，2.每侧睾丸原位注射体积约35 μ L磷酸盐缓冲盐水或聚乙二醇包被的金纳米棒，3.用自制的小铁条架卡住阴囊，防止睾丸收入腹腔，4.将小鼠四肢固定起来，5.用近红外光IW · cnT2和O. 8W · cnT2照射睾丸,光斑面积为两平方厘米，6.持续照射lOmin，同时用红外照相机拍下照片，分析睾丸温度变化，7.取下装置，将小鼠放入饲养笼子，8.在各时间点(7，30，60天)观察，实验。
二、在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cm_2和O. 8W · cm_2，IOmin处理后，测定体重、睾丸系数、附睾系数变化情况在7，30，60天时，称量小鼠的体重，睾丸系数=(睾丸重量/小鼠体重)*100%附睾系数=(附睾重量/小鼠体重)*100%然后作图。三、在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · an2, IOmin处理后，睾丸形态学检验(一)石蜡包埋切片I.将切取的睾丸组织浸泡在苦味酸固定剂(饱和苦味酸甲醛乙酸=15 : 5: I)，室温12小时，水洗过夜，2.将烘箱温度调至80°C融解石蜡，3.乙醇梯度脱水75% 乙醇、30minX2，95% 乙醇、15minX2，100% 乙醇，、100%IOminX 2,4. 二甲苯 5-lOmin，5.放入烘箱中已经预先融化的100%石腊三遍,每次30min,6.在80°C恒温金属浴上将取出的睾丸组织置于100%石蜡模具内，倒入石蜡包埋后并贴上标签，于室温凝固，7.切片 4μ m。(二)石蜡切片苏木素伊红染色(HE染色)I.将石蜡切片置于60°C烘箱中烤切片4_6h，2. 二甲苯脱蜡 8minX2，3.梯度乙醇水化100%乙醇5min，95%、90%、70%乙醇各2min，蒸馏水2min，4.苏木素染色5min,流水冲洗15min以上返蓝，5.梯度乙醇脱水70%、80%、90%乙醇各2min，6.伊红染色5s (可根据染色结果和要求调整时间)，7. 95%、100%、100% 乙醇各 2min，8. 二甲苯透明 5minX2，9.采用中性树胶封片。四、在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cnT2和O. 8W · cnT2, IOmin处
理后，激素检验
I.采用摘眼球取血的方式采血约lmL，2.室温静置 4_6h，3.离心，4500rpm, 5min,4.取上清，直接冻存到_80°C，5.由合肥欣乐生物有限公司采用 夹心法ELISA (FSH，LH, T)，6. t-检验统计分析结果。五、免疫印迹方法检测聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射1W. cm_2和O. 8W.cm-2, IOmin处理后，凋亡和血睾屏障相关基因的蛋白水平表达试剂配制DRIPA buffer 裂解液50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，150mM NaCl, I % Triton X-100，
I% sodium dodecyl sulfate，I % sodium deoxycholate,ImMEDTA并根据需要添加蛋白酶抑制剂EDTA-freeprotease inhibitor cocktail (Roche)及ImMphenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)憐酸酶抑制剂5mMsodium orthovanadate2)蛋白电泳分离胶和浓缩胶
10%分离胶5%浓缩胶
ddH〗。3.2 mL2. 5 mL
30% 丙烯酰胺 2.64 mL0,415 mL
30% Tris2 mL ( 1.5 M pH 8.8) 0.315 mL (1.0 M pH 6.8)
30% SDS80 uL25 uL
10% APS80 uL25 uL
TEMED3.2 uL2.5 uL3)还原型 5 X SDS 上样缓冲液(loading buffer) Tris · HCl (pH 6. 8) 250mM, β一疏基乙醇5%，SDS 10%，溴酚蓝O. 5%，甘油50%，4) Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mM Tris,250mM Glycine (pH 8. 3) ,0. 1% SDS,5)转移缓冲液Tris 3. 03g/L, Glycine 18. 8g/L, SDS lg,6) 10X丽春红染液丽春红S 2g,三氯乙酸30g,磺基水杨酸30g,蒸懼水至100ml，使用时稀释10倍，7)TBST 缓冲液20mM Tris-HCl (pH 7. 5)，150mM NaCl，0. 5% Tween-20,8)封闭液5%脱脂奶粉(用TBST配制)。实验步骤I.蛋白样品准备I)睾丸组织获取蛋白睾丸中加入RIPAbuffer，并用组织匀浆器手动匀浆(注意低温操作)，2)冰上裂解 30min，3)加入5X上样缓冲液于100°C金属浴上煮lOmin，4) 15，OOOg离心lmin，取上清分装于I. 5ml离心管中并置于_80°C保存。
2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳I)配制10%分离胶(8% -15% ),灌入固定好的玻璃板后,用水封盖30min直至分离胶聚合凝固，2)倒掉水后，并用滤纸吸干玻璃板中的残留的水，按上述配方配制5%的浓缩胶，加到分离胶上(避免气泡)，立即插入梳子，3)待凝胶凝固后，小心拔掉梳子，将玻璃板固定在电泳槽中，加满Tris-甘氨酸电泳缓冲液，4)上蛋白样，电泳，恒压120V电泳至上样缓冲液蓝线离开胶板结束。
3.免疫印迹分析I)将SDS-PAGE电泳好的胶剥离胶板放入转移缓冲液中，并裁剪和分离胶大小一致的硝酸纤维素膜置于胶上，两侧放上滤纸，夹上转膜夹，形成“三明治”结构，2)将夹子放入转移槽中，添加转移缓冲液进行电转移350mA稳流电转移，约I. 5小时，3)转完后将膜用IX丽春红染液染色，水冲洗掉没染上的染液即可看到膜上蛋白，裁剪并标记蛋白Marker,4) 5%脱脂奶粉封闭lh/4°C封闭过夜(于脱色摇床上，下面洗涤/孵育也是)5) TBST buffer洗膜三次，每次5_10分钟，弃上清，6)添加一抗室温孵育2小时或4°C孵育过夜，7) TBST buffer洗膜三次，每次5_10分钟，弃上清，8)添加相应二抗室温孵育I小时，9) TBST buffer洗膜三次，每次10-15分钟，弃上清，10)将硝酸纤维素膜转移到X-光片夹，11)在暗室中于硝酸纤维素膜上添加适量反应底物，并在红灯下取出X-光片剪裁适当大小置于膜上，关上X-光片夹，12)取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻将其放到定影液中终止显影，13)胶片可洗涤、晾干后保存于室温。六、在聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光照射IW · cm_2和O. 8W · cm_2，IOmin处理后，小鼠的生育率检测I.在聚乙二醇包被的金纳米棒照射IW · cnT2和O. 8W · cm2, IOmin处理后7天,60
天，将雄鼠分为单只/笼，2.将每只雄鼠按照I : 2的比例，放入10周大的ICR雌鼠交配，3.持续交配7天，4.将雌雄鼠分开，5.记录雌鼠的怀孕数和生仔数，6.雄鼠生育率=(怀孕雌鼠数/雌鼠总数)*100%，7.同时观察记录小鼠的活动行为是否正常。七、统计分析采用Student’ s t_test检验变量间显著差异性,数值以mean土SD显示。
P值小于O. 05作为统计显著性阈值。通过上面的结果表明，聚乙二醇修饰的金纳米棒具有很好的生物相容性，同时聚乙二醇修饰修饰不影响金纳米棒的光热转化效率。—、合成和表征聚乙二醇修饰的金纳米棒的特性。紫外可见光光谱图显示从紫外光谱的表征中，可以看到溴化十二烷基三甲基铵稳定的金纳米棒具有金纳米棒所特有的808nm附近的纵向表面等离子共振吸收峰，证明了金纳米棒的成功合成以及预示着其存在近红外 光热转换性质，而通过不同的合成方法可以改变其金纳米棒的外貌(长径比)以及纵向表面等离子共振吸收峰的位移，而只要在808nm处存在较强的吸收，该金纳米棒即存在光热效应。通过聚乙二醇进行表面配体置换修饰，得到具有较好的生物安全性的金纳米棒以进行动物体内实验，在反应后，通过透析的方式可以完全除去溴化十二烷基三甲基铵，而该过程肉眼观察未发现颗粒聚集的现象。同样通过紫外可见光光谱图，发现聚乙二醇置换反应后的金纳米棒其表面等离子共振最大吸收峰位移几乎没有变化，说明了聚乙二醇的置换不会影响金纳米棒的光热转换性质。同时还表明聚乙二醇的置换不会造成颗粒聚集等副反应，聚乙二醇对颗粒的稳定具有较好作用。另外，通过透射电子显微镜(TEM)，可以清楚的看到金纳米棒具有完整的棒状结构，并且颗粒大小十分均勻，其长宽分别约为40nm和IOnm,与理论设计相符。二、睾丸的温度变化与近红外照射剂量和聚乙二醇修饰的金纳米棒之间的关系。通过睾丸内注射磷酸盐缓冲盐水或或20D聚乙二醇包被的金纳米棒之后近红外光照射IW · cnT2，IOmin和睾丸内注射磷酸盐缓冲盐水、20D聚乙二醇包被的金纳米棒或1.50D聚乙二醇包被的金纳米棒之后近红外光照射0.8W· cm_2，10min。用红外照相机(ICI7320, Infrared Camera Inc.)照相记录，并运用温度成像分析软件(InfraredCameras Inc.)分析睾丸处的温度变化。建立起睾丸温度变化与近红外光照射剂量和聚乙二醇包被的金纳米棒浓度之间的关系，为做到睾丸温度可控调节打下基础。例如图2A显示在近红外光IW · cm_2处理时，睾丸平均温度为35°C (磷酸盐缓冲盐水+近红外光)，450C (20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光)。图2B显示在近红外光O. 8W · cm—2处理时，睾丸平均温度为30°C (磷酸盐缓冲盐水+近红外光)，40°C (20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光)，370C (I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光)。三、体重、睾丸系数、附睾系数、睾丸形态学、睾酮含量等在20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光处理后的变化情况。聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光处理后，在7，30，60天来获取体重、睾丸系数、附睾系数、睾丸形态学、激素比较。发现在20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，IW · cm-2, IOmin处理后，各时间点检查发现雄鼠体重、附睾系数无明显变化。在7天时睾丸系数明显下降，睾丸形态学表明该处理使得睾丸完全坏死，在60天时睾丸消失。然而睾酮含量没有明显的变化。在20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光和I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，O. 8W · cm_2, IOmin处理后,各时间点检查发现雄鼠体重、附睾系数无很明显变化。在7，30，60天时睾丸系数明显下降，睾丸形态学表明该处理使得睾丸部分坏死。睾酮含量没有很明显的变化。表明睾丸破坏程度是可以通过控制近红外光照射剂量和聚乙二醇包被的金纳米棒浓度来实现。四、聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光处理后，雄鼠的生育率变化情况。
通过20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，Iff · cm2, IOmin处理7天,和正常雌鼠的交配实验。以及通过20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光和I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，O. 8W ·αιΓ2, IOmin处理7天,和正常雌鼠的交配实验,发现在20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，IW ·αιΓ2，IOmin处理后雄鼠生育率为零。20D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光和I. 50D聚乙二醇包被的金纳米棒+近红外光，O. 8W · cm_2，IOmin处理后生育率下降到10%。这些研究结果表明，可以通过聚乙二醇包被的金纳米棒的光热效应来可控的调节雄鼠的生育率，来实现快速高效的避孕效果。综上所述，本发明首次将金纳米棒 的光热效应和高热避孕结合起来，实现了用金纳米棒的可控的光热效应来实现可控的避孕效果。参考文献Alkilany, A. M. , P. K. Nagaria, et al. (2009). " Cellular Uptake andCytotoxicity of Gold Nanorods Molecular Origin of Cytotoxicity and SurfaceEffects" Small 5(6) :701-708Chakravarty, P.，R. Marches, et al. (2008). " Thermal ablation of tumorcells with antibody-functionalized single-walled carbon nanotubes. " Proc NatlAcad Sci USA 105(25) :8697-702.Chen, C. L，L.R.Kuo，et al. (2010). " In situ real-time investigationof cancer cell photothermolysis mediated by excited gold nanorod surfaceplasmons. " Biomaterials 31(14) :4104-4112.Chen, J. Y.，C. Glaus, et al. (2010). " Gold Nanocages as PhotothermalTransducers for Cancer Treatment. " Small 6(7) :811-817.Chen，J. Y.，D. L Wang，et al. (2007). " Immuno gold nanocages with tailoredoptical properties for targeted photothermal destruction of cancer cells. " NanoLett 7(5) :1318-1322.Choi, W. I. , J. Y. Kim，et al. (2011). " Tumor Regression In Vivo byPhotothermal Therapy Based on Gold-Nanorod-Loaded,FunctionalNanocarriers. " AcsNano 5(3) :1995-2003.He，X.，W. F. Wolkers, et al. (2004). " In situ thermal denaturation ofproteins in dunning AT-Iprostate cancer cells !implication for hyperthermic cellinjury. " Ann Biomed EnR 32 (10) :1384-98.Hirsch, L. R.，R. J. Stafford, et al. (2003). " Nanoshel I-mediatednear-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonanceguidance. " Proc Natl Acad Sci USA 100(23) :13549-54.Howe，L. M. (2006) .Surgic&l methods of contr&ception dsterilization. " TherioRenoloRy 66(3) :500-509.Hu, K. -W.，C.-C. Huang，et al. (2008). " A new photothermal therapeuticagent :core-free nanostructured Au x Agl-χ dendrites. " Chemistry 14(10)2956-64.Huang, H. C.，S. Barua, et al. (2009). " Simultaneous Enhancement ofPhotothermal Stability and Gene Delivery Efficacy of Gold Nanorods UsingPolyelectrolytes. " Acs Nano 3(10) :2941-2952.Huang, X. H.，I. H. El-Sayed，et al. (2006). " Cancer cell imaging andphotothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. 〃 J AmChem Soc 128(6) :2115-2120.Huang, X. H.，P. K. Jain, et al. (2008). " Plasmonic photothermaltherapy(PPTT)using gold nanoparticles. " Lasers Med Sci 23(3) :217-228.
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权利要求
1.金纳米棒在制备用于雄性避孕的药物中的用途，其特征在于所述金纳米棒在近红外区具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰。
2.权利要求I所述的用途，其特征在于所述金纳米棒在808nm处具有最强的纵向表面等离子共振吸收峰。
3.权利要求I或2所述的用途，其特征在于所述金纳米棒与近红外光照射结合使用。
4.权利要求3所述的用途，其特征在于所述金纳米棒所产生的光热效应通过调节金纳米棒的浓度或近红外光的剂量来控制。
5.权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述近红外光的波长与金纳米棒的最强纵向表面等离子共振吸收峰相对应。
6.权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于所述金纳米棒被聚乙二醇或以聚乙二醇为重复单元的聚合物包被。
7.权利要求1-6中任一项所述的用途，所述药物用于脊椎动物。
8.权利要求7所述的用途，所述脊椎动物为宠物动物或人。
全文摘要
本发明涉及金纳米棒用于雄性避孕的用途。本发明首次将金纳米棒的光热效应的应用和高热避孕结合起来，实现采用金纳米棒的可控的光热效应实现可控的避孕效果，是一种简单、高效、快捷、廉价的避孕方法。
文档编号A61K47/34GK102813673SQ20121027446
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者孙斐, 王均, 李文清, 孙春阳, 王峰, 王育才, 翟仪稳 申请人:中国科学技术大学