专利名称：一种通关藤多糖提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种从中药通关藤中提取得到的多糖提取物及其制备方法，以及它在制备抗肿瘤和免疫调节药物方面的应用。
背景技术：
中药通关藤为萝蘑科牛奶菜属植物通关藤ifersofeflia tenacissima (Roxb) Wightet Arn的干燥藤茎，传统具有止咳平喘、散结止痛等功效，现代药理和临床作用已证实其具有抗肿瘤、免疫调节、保肝利尿等作用。目前以通关藤单味药材的水提取物为原料制成的上市制剂消癌平注射剂作为抗肿瘤的一线药物在临床广泛使用，是现今治疗各种癌症的必用药物之一，疗效确切。通过国内外有关通关藤的研究现状检索及动态分析显示，目前通关藤药材的抗肿瘤活性成分文献普遍公认为C21甾体皂苷。有关通关藤多糖研究报道少见，特别是主要包含由4种多糖组分的具有抗肿瘤和免疫调节活性的通关藤多糖提取物研究未见报道。中国发明专利ZL02114987.9在制备通关藤注射液时，采用乙醇提取，以乙酸乙酯萃取，制得总皂苷，再将乙醇提取后药渣水提取，醇沉制得总多糖；发明专利ZL200310121000.9制备通关藤注射液时，采用水提取药材，经大孔吸附树脂，收集水洗脱 部分，浓缩并醇沉制备多糖，收集乙醇洗脱部分制备总皂苷；上述二个发明专利制备的多糖提取物与本发明相比较，已授权的发明专利均采用水提醇沉法制得总多糖，该方法为制备粗多糖的常规方法，制得的多糖为粗多糖，杂质多，纯度低，是在保证皂苷提取的同时制备多糖，多糖的提取率较低，且因其为粗多糖，其中含有的多糖组分是否均具有药理活性尚不明确，而本发明的通关藤多糖提取物主要是由4种多糖组分组成，经药理学实验证实4种多糖组分以及由它们组成的多糖提取物均具有抗肿瘤及免疫调节的药理活性，4种多糖组分按重量百分比计，为占总多糖提取物的50% 100%，纯度高，杂质含量少，组分明确，抗肿瘤及免疫调节作用明确。
发明内容
本发明的目的，是提供一种多糖组分明确，且纯度较高的通关藤多糖提取物。本发明的另一目的是提供一种上述多糖提取物的制备方法。本发明的又一目的是提供一种以上述多糖提取物为原料，用于制备药剂学上可接受的口服制剂、注射制剂、吸入剂或局部皮肤制剂的应用。本发明还有一目的是提供的上述多糖提取物，在抗肿瘤和免疫调节作用方面的用途。采用的技术方案是:
一种通关藤多糖提取物，其特征在于该提取物主要由4种多糖组分组成，且按重量百分含量计，4种多糖组分的总含量为50 100%。其中组分I和组分II的平均分子量范围在5000 400000Da之间，组分III和组分IV的平均分子量范围在5000 500000Da之间。
一种通关藤多糖提取物的制备方法，包括以下步骤:
(1)取通关藤药材粉碎，加水提取I 5次，每次0.5 6小时，加水量为3 20倍，合并提取液，浓缩至60°C下相对密度为1.02 1.35浸膏，加乙醇使醇度达40% 90%，静置6 72小时，回收乙醇，浓缩，干燥，加水溶解，采用已知的sevage法或三氯乙酸法或酶解法除去蛋白，制得粗多糖，备用；
(2)取粗多糖的水溶液，经纤维素离子交换柱，分别依次以水洗脱I 7倍柱体积，制得多糖组分I ;以0.05mol/L氯化钠洗脱I 10倍柱体积，制得多糖组分II ;以0.lmol/L氯化钠洗脱I 8倍柱体积，制得多糖组分III ；以0.2mol/L氯化钠洗脱I 7倍柱体积，制得多糖组分IV，合并收集得到的上述溶液，过滤，经透析袋透析，除去氧化钠，浓缩，干燥，即得。上述纤维素离子交换柱中的交换剂主要为阴离子交换纤维素如DEAE。
上述多糖提取物，能用于制备药剂学上可接受的口服制剂，或注射制剂，或吸入齐U，或局部皮肤制剂。上述多糖提取物，能制备成抗肿瘤或免疫调节药物。上述制得的通关藤多糖提取物在制备药剂学上可接受的药物制剂应用，可以是采用本领域共知的方法，制备片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸、糖浆剂、水针剂、缓释剂、大输液、冻干针剂、气雾剂、喷雾剂、凝胶、橡胶膏、巴布剂等任意一种现有的剂型。含有上述多糖提取物制成的药物，它可以在治疗各种癌症及其调节免疫功能方面应用，也可作为癌症治疗过程中配合放疗、化疗的辅助用药及手术后治疗用药。与现有技术相比，本发明的有益效果是:
(I)本发明提供的通关藤多糖提取物的药效物质基础明确，是由具有抗肿瘤和免疫调节作用的4种多糖组分组成，4种多糖组分的纯度较高，最高纯度可达100%，解决了目前中药多糖以粗多糖为主，存在杂质多，其活性组分不明确的问题。(2)本发明提供的多糖提取物中含有的4种多糖组分，是通过药效试验跟踪筛选出的具有抗肿瘤和免疫调节作用的多糖组分，由它们组成的通关藤多糖提取物药效作用明确，不含有非活性的其他多糖组分，解决了中药提取物活性成分和非活性成分无法预知的问题。(3)本发明提供的多糖提取物的制备方法适合工业化生产，其中4种多糖组分的纯度经过凝胶柱色谱和紫外-可见光谱等方法检测证实了其纯度可达50% 100%，且本发明的制备方法经多批次放大实验证实，方法稳定可行，重复性好，多糖提取率高，适合工业化生产。(4)本发明提供的多糖提取物，因其多糖组成明确，为此从根本上解决了中药提取物质量不可控的问题。
图1是多糖组分I的洗脱曲线图。图2是多糖组分II的洗脱曲线图。
图3是多糖组分III的洗脱曲线图。
图4是多糖组分IV的洗脱曲线图。
具体实施例方式用以下实施例对本发明作具体说明，但本发明并不限于下面实施例所包含的内容。实施例1
一种通关藤多糖提取物的制备方法是:
通关藤药材粉碎后,加水8倍量提取3次，每次2小时，合并上清液，滤过，滤液减压浓缩到60°C下相对密度为1.10 1.15，加95%乙醇使醇度达到80%，搅拌，静置过夜，离心，真空干燥5小时，采用Sevage法脱蛋白，经Deae-52纤维素柱上样，分别依次以水洗脱2倍柱体积，获得多糖组分I ;以0.05mol/L氯化钠洗脱4倍柱体积，获得多糖组分II ;以0.1mol/L氯化钠洗脱3倍柱体积，获得多糖组分III ；以0.2mol/L氯化钠洗脱2倍柱体积，获得多糖组分IV，合并上述溶液，滤过，经透析袋透析，除去氯化钠，浓缩，真空干燥，即得。实施例2
一种通关藤多糖提取物的制备方法是:
通关藤药材粉碎后,加水10倍量提取2次，每次1.5小时，合并上清液，滤过，滤液减压浓缩到60°C下1.20 1.25，加95%乙醇使溶液乙醇浓度达到85%，搅拌，静置36小时，离心，喷雾干燥，采用三氯乙酸法脱蛋白，经Deae-650C纤维素柱上样，分别依次以水洗脱3倍柱体积，获得多糖组分I ;以0.05mol/L氯化钠洗脱5倍柱体积，获得多糖组分II ;以0.1mol/L氯化钠洗脱2倍柱体积，获得多糖组分III ；以0.2mol/L氯化钠洗脱3倍柱体积，获得多糖组分IV，合并上述溶液，滤过，经透析袋透析，除去氯化钠，浓缩，喷雾干燥，即得。实施例3
通关藤多糖提取物片剂的制备:
通关藤多糖提取物 200g 微晶纤维素60g
低取代羟丙基纤维素 35g 硬脂酸镁1.5g
1%羟丙甲纤维素适量
取上述通关藤多糖提取物，加入上述辅料混匀，加入1%羟丙甲纤维素溶液湿法制粒，过20目筛，60°C干燥2小时，以20目筛整粒，加入硬脂酸镁混匀，压片，制成1000片，即得。实施例4
通关藤多糖提取物胶囊的制备:
通关藤多糖提取物 IOOg 淀粉40g
交联聚维酮 5g
微粉娃胶Ig
10%聚维酮Km适量
取上述通关藤多糖提取物，加入上述辅料混匀，加入10%聚维酮K3tl湿法制粒，过24目筛，60°C干燥2小时，以24目筛整粒，加入微粉硅胶混匀，装胶囊，制成1000粒，即得。实施例5通关藤多糖提取物颗粒剂的制备:
通关藤多糖提取物 300g 甘露醇50g
鹿糖150g
朽1檬香精0.5g
取上述通关藤多糖提取物，加入甘露醇、50g蔗糖混匀，余下蔗糖加水制成50%的糖浆作为粘合剂对上述辅料及多糖提取物制粒，过16目筛，60°C干燥2小时，喷以柠檬香精乙醇溶液，以16目筛整粒，制成颗粒剂1000袋，即得。实施例6
通关藤多糖提取物口服液的制备:
通关藤多糖提取物 250g 羟苯甲酯Sg
阿司巴甜Ig
薄荷香精0.5g
注射用水10000ml
取上述通关藤多糖提 取物及辅料，加入80%注射用水溶解，搅拌，加入0.1氢氧化钠溶液调节pH至6.0 7.0之间，补充注射用水至全量，滤过，流通蒸汽灭菌30分钟，灌装至IOml安瓿中，封口，制成1000瓶，即得。实施例7
通关藤多糖提取物注射剂的制备:
通关藤多糖提取物 30g 注射用水5000ml
取上述通关藤多糖提取物，加入处方量的80%注射用水溶解，搅匀，加入0.1氢氧化钠溶液调节pH至6.0 7.0之间，补充注射用水至全量，加0.5%针用活性炭搅拌30分钟，粗滤，再以0.22 μ m滤膜过滤，以5mL为I个剂量单位灌装，制成1000支，置121 °C条件下灭菌15分钟，即得。实施例8
通关藤多糖提取物冻干粉针的制备:
通关藤多糖提取物 50g 甘露醇25g
注射用水2000ml
取上述通关藤多糖提取物及甘露醇，加入处方量的80%注射用水溶解，搅匀，加入
0.1氢氧化钠溶液调节pH至6.0 7.0之间，补充注射用水至全量，加1.0%针用活性炭搅拌30分钟，粗滤，再以0.22 μ m滤膜过滤，灌装至5ml西林瓶中，冻干，制成1000支，即得。实施例9
通关藤多糖提取物大输液的制备:
通关藤多糖提取物 80g
氯化钠900g
注射用水100000ml取上述通关藤多糖提取物及氯化钠，加入处方量70%注射用水溶解，搅匀，加入0.1氢氧化钠溶液调节PH至6.0 7.0之间，补充注射用水至全量，加1.0%针用活性炭搅拌30分钟，粗滤，再以0.22 μ m滤膜过滤，灌装至IOOml注射液瓶中，置121°C条件下灭菌20分钟，制成1000瓶，即得。通关藤多糖提取物是由4种多糖组分组成，由以下实验证实:
粗多糖的洗脱:取制备得到的粗多糖溶液，上Deae-52纤维素柱，依次采用水、
0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱，每0.5倍柱体积收集I份洗脱液，备用。多糖组分的检测:采用苯酚-硫酸法对洗脱液在490nm处进行检测。分别取上述洗脱液各2mL，稀释并定容至50mL。各取出lmL，加入10 mL具塞试管中，各加入5%苯酚溶液
1.4mL，充分摇匀，再加浓硫酸7mL，充分摇匀，加水至刻度，置40°C水浴中放置15min，取出，冷却至室温。在490nm波长处测定吸收度值，分别测定水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化钠洗脱Deae-52纤维素柱获得的洗脱液的含量。结果见图1_4。图1-4纤维素柱洗脱曲线显示，粗多糖经水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化钠洗脱后，每种溶剂的洗脱曲线均为对称曲线，证实每种洗脱剂洗脱获得的多糖为同一类化学性质的多糖组分，为此，本发明的多糖提取物是由纤维素柱纯化分级制得的4种同类化学性质的多糖组分组成，其中组分I和组分II的平均分子量范围在5000 400000Da之间，组分III和组分IV的平均分子量范围在5000 500000Da之间。通关藤多糖提取物的抗肿瘤及免疫调节的疗效由以下药效学实验证实:
实验I 对S18tl荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节作用
动物:昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g 瘤株:腹水型小鼠肉瘤S18(l。药品:阳性对照药环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司提供)；通关藤多糖组分I IV、通关藤多糖提取物，自制。实验方法:无菌条件下操作，取接种7天的S18tl肉瘤腹水型荷瘤小鼠，消毒动物腹部皮肤，用5mL —次性无菌注射器穿入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水，所抽腹水放入无菌三角烧瓶内，置于冰盒上。另取少量腹水进行细胞计数，用生理盐水稀释100倍，调整瘤细胞浓度为IX IO7个/mL。取小鼠，每鼠0.2mL的S18tl腹水瘤细胞悬液接种于右前肢腋窝皮下，24h后称重，随机分组，每组10只。灌胃给药，连续10天，其中空白组和荷瘤对照组每日0.4mL生理盐水，环磷酰胺组、通关藤多糖组分I IV、通关藤多糖提取物，每日按下表的剂量给药。给药10天 后停止给药，停药次日处死小鼠，称取小鼠体重，解剖瘤体、脾、胸腺，分别称重。计算抑瘤率、胸腺指数、脾指数等指标，实验重复3次，结果见表1-2。表I 对S18。荷瘤小鼠抑瘤作用结果__
权利要求
1.一种通关藤多糖提取物，其特征在于该提取物主要由4种多糖组分组成，且按重量百分含量计，4种多糖组分的总含量为50 100%，其中组分I和组分II的平均分子量范围在5000 400000Da之间，组分III和组分IV的平均分子量范围在5000 500000Da之间。
2.一种通关藤多糖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取通关藤药材粉碎，加水提取I 5次，每次0.5 6小时，加水量为3 20倍，合并提取液，浓缩至60°C下相对密度为1.02 1.35浸膏，加乙醇使醇度达40% 90%，静置6 72小时，回收乙醇，浓缩，干燥，加水溶解，采用sevage法或三氯乙酸法或酶解法除去蛋白，制得粗多糖，备用； (2)取粗多糖的水溶液，经纤维素离子交换柱，分别依次以水洗脱I 7倍柱体积，制得多糖组分I ;以0.05mol/L氯化钠洗脱I 10倍柱体积，制得多糖组分II ;以0.lmol/L氯化钠洗脱I 8倍柱体积，制得多糖组分III ；以0.2mol/L氯化钠洗脱I 7倍柱体积，制得多糖组分IV，合并收集得到的上述溶液，过滤，经透析袋透析，除去氧化钠，浓缩，干燥，即得。
3.根据权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于以此提取物为原料，用于制备药剂学上可接受的口服制剂，或注射制剂，或吸入剂，或局部皮肤制剂。
4.根据权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于制备抗肿瘤或免疫调节药物上的应 用。
全文摘要
一种通关藤多糖提取物，其特征在于该提取物主要由4种多糖组分组成，且按重量百分含量计，4种多糖组分的总含量为50～100%，其中组分I和组分Ⅱ的平均分子量范围在5000～400000Da之间，组分Ⅲ和组分Ⅳ的平均分子量范围在5000～500000Da之间。本发明提供的多糖提取物，因其多糖组成明确，为此从根本上解决了中药提取物质量不可控的问题。其中4种多糖组分的纯度经过凝胶柱色谱和紫外-可见光谱等方法检测证实了其纯度可达50%～100%，且本发明的制备方法经多批次放大实验证实，方法稳定可行，重复性好，多糖提取率高，适合工业化生产。
文档编号A61K31/715GK103239469SQ20131014850
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者张慧, 裴志东, 康廷国, 翟延君, 初正云, 王添敏 申请人:辽宁中医药大学