ATP合成酶β亚基在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，具体涉及ATP合成酶β亚基在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。更具体地说，涉及大肠埃希菌ATP合成酶β亚基在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。本发明通过主动免疫和被动免疫试验发现大肠埃希菌ATP合成酶β亚基蛋白能够提高动物抵抗细菌，尤其是耐药细菌的能力，从而克服动物对细菌感染的问题。本发明所提供的蛋白质，比现有的主要使用抗生素作为抗细菌药物的应用上，具有更高的安全性和操作性，并保证良好的效果。
【专利说明】ATP合成酶β亚基在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及ATP合成酶β亚基在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用，更具体地，涉及大肠埃希菌ATP合成酶β亚基(ATP synthasesubunit beta, AtpB)在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。
【背景技术】
[0002]近年来 细菌耐药日趋严峻，成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60%~70%。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此，控制目前已经广泛存在的耐药菌已成为一个重要的社会和科学问题。
[0003]耐药菌的防治尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。目前尚无发现利用小分子物质提高动物对耐药菌抵抗能力的报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术的不足，提供一种小分子物质在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。
[0005]本发明是通过以下技术方案予以实现的:
本发明通过主动免疫和被动免疫试验发现ATP合成酶β亚基蛋白能够提高动物抵抗细菌，尤其是耐药细菌的能力，从而克服动物对细菌感染的问题。所以，本发明公开了 ATP合成酶β亚基基因在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用，所述ATP合成酶β亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本发明公开了 ATP合成酶β亚基蛋白在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用，所述ATP合成酶β亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0007]本发明公开了 ATP合成酶β亚基的抗体在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。所述的ATP合成酶β亚基的抗体为ATP合成酶β亚基单克隆抗体、ATP合成酶β亚基多克隆抗体或ATP合成酶β亚基基因工程抗体。优选地，所述ATP合成酶β亚基多克隆抗体的制备方法包括如下步骤:S1.抗原的制备:将ATP合成酶β亚基蛋白(AtpB)溶解于水中，加入弗氏完全佐剂后，超声处理即的抗原；所述的ATP合成酶β亚基蛋白的终浓度为Mg~lmg。S2.抗体的制备:将步骤SI制备得到的抗原注射免疫动物后，取血，析出血清后，离心，取上清液即得AtpB抗血清，AtpB抗血清中含有ATP合成酶β亚基多克隆抗体。更优选地，所述抗原分三次免疫动物，首次免疫采用高剂量(80~Il(^g)的抗原，后两次采用低浓度(40~6(^g)的抗原注射。每次注射间隔12~16天。[0008]ATP合成酶β亚基单克隆抗体和ATP合成酶β亚基基因工程抗体的制备方法可以参考本【技术领域】的常规方法进行制备得到。
[0009]作为优选方案，如上所述ATP合成酶β亚基为大肠埃希菌ATP合成酶β亚基。
[0010]作为优选方案，本发明所述的抗细菌感染剂为抗抗生素耐药细菌感染剂；所述的抗生素包括丁胺卡那、氨苄青霉素、巴洛沙星、头孢他啶、盐酸克林霉素、庆大霉素、四环素和/或罗红霉素。
[0011]作为优选方案，本发明所述的免疫保护剂为提高动物对耐药菌抵抗能力的免疫保护剂。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明通过大肠埃希菌ATP合成酶β亚基蛋白主动或被动免疫动物，以提高机体的免疫力，而不是使用化学疗法杀灭病原菌，因此，本发明消除了使用抗生素存在的潜在危害。本发明更不是通过加大抗生素的使用量来杀灭耐药菌，从而消除了使用大量抗生素存在的潜在危害。总之本发明为防治耐药菌提供了一条完全创新、安全的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为AtpB基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果，其中M为DNA分子量标准。
[0014]图2为重组AtpB基因双酶切鉴定结果，其中M为DNA分子量标准。
[0015]图3为AtpB表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，其中M为蛋白质分子量标准。
[0016]图4为AtpB纯化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，其中M为蛋白质分子量标准。
[0017]图5为AtpB蛋白免疫后从第一天到第14天昆明鼠的死亡情况。
【具体实施方式】
[0018]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0019]实施例1:大肠埃希菌ATP合成酶β亚基蛋白的制备和纯化
首先扩增得到大肠埃希菌ATP合成酶β亚基基因全长，然后将全长的ATP合成酶β亚基基因编码序列构建入大肠埃希菌原核表达系统中，以表达和提纯目的蛋白。大肠埃希菌ATP合成酶β亚基AtpB基因编码序列如SEQ ID NO:1所示，大肠埃希菌ATP合成酶β亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。具体步骤如下:S1.大肠埃希菌ATP合成酶β亚基基因的扩增
根据NCBI公布的大肠埃希菌的全基因组序列，设计一对引物:
正向引物 F: 5’ -GGCAAGCTTATGGCTACTGGAAAGATT-3’(如 SEQ ID NO: 3 );
反向引物 R:5’-GCGCTCGAGTTAAAGTTTTTTGGCT-3’(如 SEQ ID Ν0:4)。
[0020]为便于克隆和表达载体的构建，在引物上分别引入限制性内切酶位点历和通01。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
[0021]以热变性法获得的大肠埃希菌的全基因组为模板，进行PCR反应，反应体系如下:
【权利要求】
1.ATP合成酶β亚基基因在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用，所述ATP合成酶β亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.ATP合成酶β亚基蛋白在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用，所述ATP合成酶β亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
3.ATP合成酶β亚基的抗体在制备免疫保护剂、疫苗或抗细菌感染剂上的应用。
4.根据权利要求1至3任一项所述应用，其特征在于，所述ATP合成酶β亚基为大肠埃希菌ATP合成酶β亚基。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述ATP合成酶β亚基的抗体为ATP合成酶β亚基单克隆抗体、ATP合成酶β亚基多克隆抗体或ATP合成酶β亚基基因工程抗体。
6.根据权利要求1至3任一项所述应用，其特征在于，所述的抗细菌感染剂为抗抗生素耐药细菌感染剂；所述的 抗生素包括丁胺卡那、氨苄青霉素、巴洛沙星、头孢他啶、盐酸克林霉素、庆大霉素、四环素和/或罗红霉素。
7.根据权利要求1至3任一项所述应用，其特征在于，所述的免疫保护剂为提高动物对耐药菌抵抗能力的免疫保护剂。
【文档编号】A61K38/43GK103690938SQ201310696629
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】彭宣宪, 李惠, 程志学 申请人:中山大学