一种生物活性材料、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物活性材料、其制备方法及应用。所述生物活性材料为丝素蛋白膜，其纵切面呈多层结构，其横切面呈多孔褶皱结构。其制备方法，包括以下步骤：(1)将丝素蛋白溶液，控制浓度、pH值及温度，获得前体溶液；(2)将前体溶液，在-200℃至40℃之间进行温度控制，让大分子进行自组装，最终温度在5℃以下，获得凝固的自组装生物大分子材料；(3)将自组装生物大分子材料，进行冻干处理，并进行交联处理，获得所述生物活性材料。本发明提供的生物活性材料，用作胞外基质仿生支架，促进和引导细胞定向增殖和/或组织再生的效果良好。
【专利说明】一种生物活性材料、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料领域，更具体地，涉及一种生物活性材料、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]组织工程是综合应用细胞生物学、材料学和工程学的原理，以人工材料为支架，结合细胞植入，研究开发具有修复、改善损伤组织结构和功能生物替代物的一门科学。在组织工程中，诱导组织再生修复的支架材料的构建是其中关键的一环，支架材料主要可分为可吸收性和不可吸收性两种。①不可吸收性材料，比如，聚四氟乙烯(PTFE)，这种材料力学性能良好，但其临床应用操作费时而且困难，放置4?6周后需二次手术摘除，给患者造成二次创伤，现在已较少应用。②可吸收性降解材料，比如，多聚乳酸(PLA)和胶原蛋白材料。
[0003]可吸收性降解材料，具有患者使用后不需取出，促进了愈合速度并减少了患者的痛苦的优点。但这些材料植入体内后，尚不具备定向调控组织再生修复的能力，促进愈合速度的能力有待提闻。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种生物活性材料、其制备方法及应用，其目的在于提供一种具有特殊三位微观结构的生物活性材料，用于仿生组织再生微环境，从而定向诱导组织再生修复，由此解决现有的组织工程支架材料不能定向诱导组织再生修复、促进愈合速度的能力不佳的技术问题。
[0005]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种生物活性材料，所述生物活性材料为丝素蛋白膜，其纵切面呈多层结构，其横切面呈多孔褶皱结构。
[0006]优选地,所述生物活性材料,还包括质量分数不超过I %的药物或生物活性因子，所述药物优选抗炎药物，所述生物活性因子优选促进组织再生修复的生长因子。
[0007]按照本发明的另一方面，提供了一种所述生物活性材料的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)将质量分数在4%至30%之间的丝素蛋白溶液，调节pH值在2至10之间；控制温度在0°c至30°C之间，获得前体溶液；
[0009](2)将步骤⑴获得的前体溶液，在-200°C至40°C之间进行温度控制，温度控制为单向降温或梯度升降温，变温速度0.01度/秒至10度/秒，让大分子自行组装，控制最终温度在5°c以下，获得凝固的自组装生物大分子材料；
[0010](3)将步骤⑵中获得的凝固的自组装生物大分子材料，进行冻干处理，并对冻干后的生物大分子材料进行交联的处理，获得所述生物活性材料。
[0011]优选地，所述的制备方法，其步骤(2)在控制生物大分子溶液温度过程中，当生物大分子溶液处于溶液状态或半凝固状态时，向其注入药物或生物活性因子。
[0012]优选地，所述的制备方法，其步骤(2)当温度控制为梯度升降温时，交替次数不超过5次。
[0013]按照本发明的另一方面，提供了一种所述生物活性材料应用，其应用于促进和引导细胞定向增殖和/或组织再生。
[0014]优选地，所述生物活性材料应用，其应用于创面修复。
[0015]优选地，所述生物活性材料应用，其应用于引导缺损组织重建。
[0016]按照本发明的另一方面，提供了一种胞外基质仿生支架，包括所述的生物活性材料。
[0017]总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果:
[0018](I)本发明提供的生物活性材料，具有规整的通体微孔结构以及较高的比表面积，能在体内降解，相对于现有的可吸收性降解材料，由于其特殊的三维微观结构，能促进和引导细胞定向增殖，更加有效的帮助组织再生，从而能加速创面愈合或引导缺损组织重建，帮助创面修复。
[0019](2)本发明提供的生物活性材料，能负载抗炎药物或生物活性因子，可智能释放生长活性因子引导组织再生，从而广泛用于应用于个人护理、细胞培养、创面及组织缺损的修复和重建领域。
[0020](3)本发明提供的生物活性材料，被酶解为天然的氨基酸，不像聚乳酸和聚乙交酯制成的膜在降解过程中会产生大量的酸，从而伤害修复的组织。具有良好生物相容性、无毒性、无刺激性切无细胞毒性。
[0021](4)本发明提供的所述生物活性材料的制备方法，原材料便宜易得，制备方法简单，易于控制，适合工业大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明提供的生物活性材料结构电镜照片，其中图1A为所述生物活性材料的纵截面电镜照片，图1B为所述生物活性材料的横截面照片，图1C为所述生物活性材料的，图1D为横截面纳米纤维结构；
[0023]图2是实施例4人表皮细胞培养在胞外基质生物活性材料表面黏附和增殖的电镜照片；
[0024]图3是实施例4人表皮细胞培养在胞外基质生物活性材料表面黏附和增殖的荧光照片；
[0025]图4是实施例5成骨细胞在实施例1制备的生物活性材料表面增殖的电镜照片。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0027]本发明提供的生物活性材料，为丝素蛋白膜，具有三维立体千层饼状微观结构，为规整的通体微孔结构，如图1所示，其纵切面呈多层结构，如图1A所示，其横切面呈多孔褶皱结构，如图1B、图1C所示，图1B、图1C为相互垂直的两横截面。优选地，所述生物活性材料的横截面具有纳米纤维结构，如图1D所示。
[0028]所述生物活性材料，还可负载药物、生物活性因子等活性成分。优选的，所述生物活性材料还包括质量分数不超过I %的药物或生物活性因子。所述药物优选抗炎药物，所述生物活性因子，优选促进组织再生修复的生长因子，包括促进纤维组织和结缔组织再生修复的生长因子，例如:成纤维生长因子，骨再生生长因子。
[0029]所述生物活性材料，其制备方法包括以下步骤:
[0030](I)将质量分数在4%至30%之间的丝素蛋白溶液，调节pH值在2至10之间；控制温度在0°c至30°C之间，获得前体溶液；
[0031](2)将步骤(I)获得的前体溶液，在-200°C至40°C之间进行温度控制，温度控制为单向降温或梯度升降温，变温速度0.01度/秒至10度/秒，让大分子自行组装，控制最终温度在5°c以下，获得凝固的自组装生物大分子材料。梯度升降温即逐渐降温后逐渐升温，交替进行多次。如需负载药物或生物活性因子，可在控制生物大分子溶液温度过程中，当生物大分子溶液处于溶液状态或半凝固状态时，向其注入药物或生物活性因子。当温度控制为升降温交替时，交替次数不超过5次。
[0032]其中梯度升降温的温度控制方法，为在迅速在多个温度梯度上切换，并维持一定时间，根据前体溶液的黏度及表面张力等情况，温度控制过程可能在升温和降温之间多次交替。温度梯度之间温差不超过10度，因此最大变温速度为10度/秒。
[0033](3)将步骤⑵中获得的凝固的自组装生物大分子材料，进行冻干处理，并对冻干后的生物大分子材料进行交联的处理，获得所述生物活性材料。
[0034]本发明提供的生物活性材料，可作为胞外基质仿生支架，应用于促进和引导细胞定向增殖和/或组织再生，尤其是创面修复、引导缺损组织重建等方面。创面修复，包括体内、体外手术或外力所致创面，例如:烧伤创面、整形外科创面、体内体外手术切口创面。引导缺损组织重建，例如:牙周组织缺损、骨组织缺损。
[0035]以下为实施例:
[0036]实施例1
[0037](I)用量筒准确量取40ml浓度为10%的丝素蛋白溶液，用HCL调节pH值至6，控制温度在20°C，获得前体溶液。
[0038]所述丝素蛋白溶液按照如下方法制备:选取干净除杂的蚕丝于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脱胶两次，每次I小时，浴比1:50。脱胶后的丝素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脱胶后的丝素纤维10克溶于10ml的溴化锂溶液中，在70°C恒温磁力搅拌溶解。将上述获得的丝素溶液进行透析、脱盐、纯化，调节浓度，得到丝素蛋白溶液。
[0039](2)将步骤(I)获得的前体溶液，倒入10cm*10cm模具中，在精密电机的带动下，缓慢浸入液氮中，在_196°C至25°C之间进行温度控制，温度控制为单向降温，变温速度1.5度/秒，控制最终温度在-196，获得凝固的自组装生物大分子材料。单向降温3分钟，当生物大分子溶液处于溶液状态后迅速将成纤维细胞生长因子(FGF)注入丝素溶液的0.2mm深处，使其通过界面扩散效应以及分子间氢键作用，实现扩散。
[0040](3)待溶液完全凝固后，将步骤(2)中获得的凝固的自组装生物大分子材料，进行冻干处理:负压冻干48小时；然后对冻干后的生物大分子材料利用戊二醛进行交联的处理:用戊二醛浸泡24h后用压膜机将膜压，再自然晾干，获得所述生物活性材料。
[0041]实施例2
[0042](I)用量筒准确量取40ml浓度为4%的丝素蛋白溶液，用NaOH溶液调节pH值至
10;控制温度在30°C，获得前体溶液。
[0043]所述丝素蛋白溶液按照如下方法制备:选取干净除杂的蚕丝于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脱胶两次，每次I小时，浴比1:50。脱胶后的丝素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脱胶后的丝素纤维10克溶于10ml的溴化锂溶液中，在70°C恒温磁力搅拌溶解。将上述获得的丝素溶液进行透析、脱盐、纯化，调节浓度，得到丝素蛋白溶液。
[0044](2)将步骤(I)获得的前体溶液，倒入10cm*10cm模具中，在_80°C至(TC之间进行温度控制，温度控制为梯度升降温，交替3次，变温梯度为10度，控制最终温度在-80，获得凝固的自组装生物大分子材料。当生物大分子溶液处于0°环境时，向其注入抗炎药物。
[0045](3)待溶液完全凝固后，将步骤(2)中获得的凝固的自组装生物大分子材料，进行冻干处理:负压冻干48小时；然后对冻干后的生物大分子材料利用甲醇进行交联处理:用甲醇浸泡24h后用压膜机将膜压至0.2mm厚，再自然晾干，获得所述生物活性材料。
[0046]实施例3
[0047](I)将丝素蛋白粉配置成浓度为30%的溶液，用量筒准确量取40ml浓度为30%的丝素蛋白溶液，用HCL溶液调节pH值至2 ;控制温度在10°C，获得前体溶液。
[0048]所述丝素蛋白粉按照如下方法制备:选取干净除杂的蚕丝于0.5% Na2CO3水溶液中，100°C脱胶两次，每次I小时，浴比1:50。脱胶后的丝素置于80°C的干燥箱中干燥至干。取脱胶后的丝素纤维10克溶于10ml的溴化锂溶液中，在70°C恒温磁力搅拌溶解。将上述获得的丝素溶液进行透析、脱盐、纯化，冻干，获得丝素蛋白粉。
[0049](2)将步骤(I)获得的前体溶液，倒入10cm*10cm模具中，在精密电机的带动下，缓慢浸入液氮中，在5至40°C之间进行温度控制，温度控制为单向降温，变温速度0.01度/秒，控制最终温度在5°，获得凝固的自组装生物大分子材料
[0050](3)待溶液完全凝固后，将步骤(2)中获得的凝固的自组装生物大分子材料，利用甲醇进行交联处理:用甲醇浸泡24h后用压膜机将膜压至0.2mm厚，再自然晾干，获得所述生物活性材料。
[0051 ] 实施例4用于创面修复
[0052]将实施例1中制备的生物活性材料，采用MTT方法，接种人表皮细胞(Epidermalcells)，在96孔板上，铺上生物材料和细胞培养基，接种细胞密度为I X 14,在37°C下，培养24小时。采用相应的处理后，分别利用电镜和荧光观察细胞增殖情况。电镜照片，如图2所示,突光标记的活细胞照片如图3所示。数据显示表皮细胞在材料表面沿着纳米材料的拓扑结构大量增殖，显示了材料良好的生物相容性和诱导细胞增殖的能力。
[0053]实验结果表明，本发明提供的生物活性材料，能促进和引导细胞定向增殖和/或组织再生，因此能加速创面愈合，进一步地，能应用于创面修复。
[0054]实施例5用于诱导骨组织再生
[0055]将MG63细胞接种于铺在24孔板的实施例1制备的生物活性材料面，每孔接种密度为IX104，经过三天的培养，进行冲洗和固定。利用电镜观察细胞在材料表面的增殖情况。如图4所示，成骨细胞在材料表面大面积的增殖，形成了骨组织，并具有一定生物矿化效果。表明该材料具有诱导成骨细胞再生和增值的能力，因此能应用于引导缺损组织重建，尤其是缺损骨组织的重建。
[0056]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种生物活性材料，其特征在于，所述生物活性材料为丝素蛋白膜，其纵切面呈多层结构，其横切面呈多孔褶皱结构。
2.如权利要求1所述的生物活性材料，其特征在于，还包括质量分数不超过I%的药物或生物活性因子，所述药物优选抗炎药物，所述生物活性因子优选促进组织再生修复的生长因子。
3.如权利要求1或2所述的生物活性材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将质量分数在4%至30%之间的丝素蛋白溶液，调节pH值在2至10之间；控制温度在0°C至30°C之间，获得前体溶液； (2)将步骤(I)获得的前体溶液，在-200°C至40°C之间进行温度控制，温度控制为单向降温或梯度升降温，变温速度0.01度/秒至10度/秒，让大分子进行自组装，控制最终温度在5°C以下，获得凝固的自组装生物大分子材料； (3)将步骤(2)中获得的凝固的自组装生物大分子材料，进行冻干处理，并对冻干后的生物大分子材料进行交联处理，获得所述生物活性材料。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵在控制生物大分子溶液温度过程中，当生物大分子溶液处于溶液状态或半凝固状态时，向其注入药物或生物活性因子。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)当温度控制为梯度升降温时，交替次数不超过5次。
6.一种如权利要求1或2所述的生物活性材料应用，其应用于促进和引导细胞定向增殖和/或组织再生。
7.如权利要求6所述的生物活性材料应用，其特征在于，其应用于创面修复。
8.如权利要求6所述的生物活性材料应用，其特征在于，其应用于引导缺损组织重建。
9.一种胞外基质仿生支架，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的生物活性材料。
【文档编号】A61L27/22GK104383598SQ201410733818
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】马兆成 申请人:湖北赛罗生物材料有限责任公司