一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、包括所述抗原组合物的生物制剂及其制备方法，该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗、药物或活细胞制剂。本发明提供的一种新的治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病的免疫培育EBV-CTLs的方法，该方法采用生物信息学方法，基于中国人群在HLA-A、B和DR位点等位基因表达特点，分析不同EBV病毒株，尤其包括中国广东来源的病毒株，三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中可能表位的存在序列，并制备包括这些序列在内的肽段组合作为抗原，结合特定细胞因子组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有数量和种类更多的抗原特异性T细胞，尤其适用于中国人群，该方法培养周期短、针对性强、对肿瘤细胞杀伤作用强。
【专利说明】一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、生物制剂 及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方 法，尤其涉及一种适合于中国人群鼻咽癌治疗的抗原组合物。还涉及包括所述抗原组合物 的用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂，该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗 或药物。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌是中国两广地区的特有疾病，与遗传、环境和生活习惯等有相关性，尤其与 EBV (Epstein-Barr virus，EBV)关系密切。EBV为疱瘆病毒科嗜淋巴病毒属的成员，为95% 以上的成人所携带，与鼻咽癌的发生有密切关系，约在90 %鼻咽癌样本中都能检测到EBV 基因组存在，是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通 过体外悬浮培养而建株，在建株细胞涂片中用电镜观察到疱瘆病毒颗粒，故而得名。
[0003] 中国南方（广东、广西）及东南亚是全球鼻咽癌高发区，发病率是低发地区的100 倍。造成这种巨大差异的原因被认为可能与以下两个方面相关：人种遗传差异性和EB病毒 株地区分布差异性。人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA)，即人类主要组织相 容性复合体（major histocompatiability complex，MHC)，是一组决定移植组织是否相容、 与免疫应答密切相关、紧密连锁的基因群，是人体多态性最丰富的基因系统。不同HLA等位 基因的表达频率在高加索人群和中国广东人群中存在着较大的差异。如在高加索人群中， HLA-A位点最常表达的等位基因为A2，而在广东人群中A11分子的表达频率约为50 %，占绝 对优势。这种差异使得高加索人群和中国广东人群在识别EBV抗原的最小单位一表位上， 存在着相当大的差异。目前已经报道的EBV相关表位中，多数为A2、A24限制性。使得这些 结果无法直接广泛应用于中国人群。另一方面，在广东及东南亚地区发现得许多EBV病毒 株中，与欧美地区的优势病毒株B95-8相比较，在一些中国人优势HLA分子限制性表位序列 中存在突变，使得免疫系统无法处理、提呈病毒抗原来引发针对EBV的免疫反应，从而使得 这些病毒引起的感染和肿瘤无法被清除。
[0004] EBV在感染宿主细胞后，可以大规模复制新的病毒颗粒，也可以长期静息于记忆性 B细胞中，也可以转化宿主细胞，因此形成了所谓不同的隐匿阶段，表达不同的抗原。在EBV 阳性的鼻咽癌和何杰金淋巴瘤中，EBV处于所谓II型隐匿阶段，仅表达三种病毒抗原，分别 为EBNA-1、LMP1和LMP2。如果能在体外筛选并扩增那些可以识别这三种抗原的特异性T淋 巴细胞，即EBV-CTLs，将这些细胞输注给患者，恢复或提高患者原有针对EBV的细胞免疫反 应，就可以在体内杀伤肿瘤细胞，达到治疗鼻咽癌的目的。
[0005] EBV-CTLs已经被试验性用于移植后淋巴细胞增殖性疾病，淋巴瘤和鼻咽癌的治 疗。但目前所采用的培养方法，或者需要用EBV转化的自体淋巴细胞系作为刺激细胞，培养 的时间长达数月，无法实现对患者的及时治疗；或者采用已经报道的表位进行选择性分离、 刺激培养，由于目前已知的表位限定于少数高加索人群高频表达HLA分子限制性，使得多 数中国人无法应用。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。
[0007] 本发明提供了一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物。
[0008] 本发明还提供了一种包括所述抗原组合物的用于免疫治疗EBV相关疾病的细胞 类生物制剂及其制备方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 本发明的第一个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物，所述 抗原组合物为不同EBV病毒株来源的三种蛋白EBNA-1、LMPl和LMP2中特定序列组成的肽 段组合。
[0011] 其中，所述肽段组合包括至少三条肽段，优选为3-90条肽段、更优选为89条肽 段，所述单个肽段长度优选为15-25个氨基酸、更优选为20-25个氨基酸，相邻两肽段具有 10-15个、更优选为10-12个连续氨基酸残基之间的重叠。
[0012] 本发明的第二个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂，所述生 物制剂包括上述的抗原组合物。该生物制剂可以是预防和治疗这类疾病的疫苗、药物或活 细胞制剂。
[0013] 其中，所述EBV相关疾病包括鼻咽癌、慢性活动性EBV感染、嗜血细胞综合症、造血 干细胞移植或器官移植后EBV感染、淋巴增殖性疾病、以及与EBV高度相关的淋巴瘤和胃癌 等。
[0014] 本发明的第三个方面是提供一种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂的制备 方法，步骤包括：
[0015] 步骤1，将免疫细胞与所述抗原在液态细胞培养基中共同培养，从而获得具有相应 抗原特异性免疫细胞培养物；
[0016] 步骤2,从步骤1中获得的培养物中分离并扩增培养具有抗原反应性细胞；
[0017] 其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞和抗原外，还包括克隆抗体、细胞因 子和免疫佐剂。
[0018] 优选地，所述免疫细胞选自：异体细胞或自体细胞的任意一种，或不经基因改性的 免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种，或抗原提呈细胞或淋巴细胞的任意一种。
[0019] 优选地，所述免疫细胞选自：外围血单个核细胞、骨髓细胞、造血前趋细胞或干细 胞的任意一种或多种、或它们的衍生细胞，更优选为外围血单个核细胞。
[0020] 优选地，所述具有抗原反应性细胞选自：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T淋巴细胞和 /或树突状细胞，更优选为⑶3+T淋巴细胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴细胞。
[0021] ⑶8+T和⑶4+T淋巴细胞识别的抗原有很大不同，⑶8+T细胞识别MHC I类分子提 呈的8-10个氨基酸长度的表位，而⑶4+T淋巴细胞则可以识别MHC II类分子提呈的15个 氨基酸长度或更长的表位。CD8+T细胞被认为是抗肿瘤的主要效应细胞，通过释放穿孔素/ 颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，或通过死亡信号途径，诱导肿瘤细胞的凋亡。CD4+抗原特异性T 细胞，被认为是⑶8+T细胞抗肿瘤的重要组成成分，它主要通过旁分泌、自分泌的形式，辅助 CD8+T细胞及其它的免疫细胞，如抗原提呈细胞，提高对肿瘤的免疫排斥作用达到治疗肿瘤 的目的。采用供者来源EBV-CTL用于移植后淋巴增殖性疾病的临床试验中，提示CD4+T细 胞比例高者，可以获得更好的临床反应。
[0022] 本发明采用了不同细胞因子的组合，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、 IL-12、IL-15中的任意一种或多种，其中更优选了 GM-CSF、IL-2、IL-7的组合，使得培养得 到的EBV-CTLs中含有更多数量和种类的抗原反应性细胞。
[0023] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0024] 本发明提供的一种新的治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病的免疫培育EBV-CTLs的 方法，该方法采用生物信息学方法，基于中国人群在HLA-A、B和DR位点等位基因表达特点， 分析不同EBV病毒株，尤其包括中国广东来源的病毒株，三种蛋白EBNA-1、LMPl和LMP2中 可能表位的存在序列，并制备包括这些序列在内的肽段组合作为抗原，结合特定细胞因子 组合，使得培养得到的EBV-CTLs中含有数量和种类更多的抗原特异性T细胞，尤其适用于 中国人群，该方法培养周期短、针对性强、对肿瘤细胞杀伤作用强。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为合成肽段位于LMP1、LMP2和EBNAl序列中的位置，其中灰色为原有蛋白序 列，黑色为B98-8序列来源肽段，空白段为⑶1和⑶2序列来源肽段。
[0026] 图2为不同细胞因子组合条件下，EBV-CTLs对抗原的反应性，其中黑色块代表未 去贴壁细胞组，灰色块代表去贴壁细胞组。
[0027] 图3为不同供者来源的EBV-CTLs对抗原肽段的反应性。
[0028] 图4为AOlO来源EBV-CTLs对自体LCL的杀伤作用。
[0029] 图5为本发明所述方法制备的EBV-CTLs同时包含抗原反应性⑶4和⑶8阳性细 胞的分布图。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0031] 本发明的第一个方面是提供一种用于免疫治疗鼻咽癌在内的EBV相关疾病药物 的制备方法，步骤包括：
[0032] 步骤1，将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中共同培养，从而获得具有相应抗原 特异性免疫细胞培养物；其中，所述抗原为不同EBV病毒株来源处于III型隐匿阶段所表达 的三种蛋白EBNA-I、LMPl和LMP2中特定序列组成的肽段组合；
[0033] 步骤2,从步骤1中获得的培养物中分离并扩增培养具有抗原反应性细胞；
[0034] 其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞和抗原外，还包括细胞因子和免疫佐 剂。
[0035] 优选地，所述免疫细胞选自：异体细胞或自体细胞的任意一种，或不经基因改性的 免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种，或抗原提呈细胞或淋巴细胞的任意一种。
[0036] 优选地，所述免疫细胞选自外围血单个核细胞。
[0037] 其中，所述肽段组合包括至少三条肽段，优选为3-90条肽段，所述单个肽段长度 优选为15-25个氨基酸、更优选为20-25个氨基酸，相邻两肽段具有10-15个、更优选为 10-12个连续氨基酸残基之间的重叠。
[0038] 所述具有抗原反应性细胞优选为⑶3+T淋巴细胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴细胞。
[0039] 所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一种或多种， 其中更优选了 GM-CSF、IL-2、IL-7的组合。
[0040] 1、抗原的设计与合成：
[0041] 本发明以中国人与高加索人HLA分子表达差异为出发点，分别找出中国人在 HLA-A、B和DR三个基因座中优势表达的5-7个等位基因，这些等位基因的表达频率之和，超 过了该位点所有等位基因表达频率总和的80%以上（请见下表1)。这些等位基因代表了 绝大多数人的表达情况。随后以此为基础，采用生物信息学方法，预测这些等位基因限制条 件下，来源于B95-8、⑶1和⑶2三种病毒株中EBNA-1、LMP1和LMP2三种抗原中可能存在的 表位。其中，GDl和GD2都是近年来自于广东地区分离测序得到的病毒株，最能反映当地流 行的病毒株基因特征。最后，合成一系列重叠肽段，这些肽段长度在20个氨基酸左右，相邻 两个肽段的重叠部分为10-12个氨基酸，覆盖所有预测表位分布区域，共需合成肽段LMPl 27段、LMP2 41段、以及EBNAl 21段（请见图1)。
[0042] 表1中国人HLA-A、B、DR位点优势等位基因
[0043]
【权利要求】
1. 一种用于免疫治疗EBV相关疾病的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物为不 同EBV病毒株来源的三种蛋白EBNA-1、LMP1和LMP2中特定序列组成的肽段组合。
2. 根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中单个肽段长度 为15-25个氨基酸。
3. 根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述肽段组合为89条肽段，相邻两 肽段具有10至15个连续氨基酸残基之间的重叠。
4. 一种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括权利 要求1所述的抗原组合物。
5. 根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为疫苗、药物或活细胞 制剂。
6. 根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于，所述EBV相关疾病包括鼻咽癌、慢性 活动性EBV感染、嗜血细胞综合症、造血干细胞移植或器官移植后EBV感染、淋巴增殖性疾 病、以及与EBV高度相关的淋巴瘤和胃癌等。
7. -种用于免疫治疗EBV相关疾病的生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤包括： 步骤1，将免疫细胞与权利要求1所述抗原在液态细胞培养基中共同培养，从而获得具 有相应抗原特异性免疫细胞培养物； 步骤2,从步骤1中获得的培养物中分离并扩增培养具有抗原反应性细胞； 其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞和抗原外，还包括克隆抗体、细胞因子和 免疫佐剂。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述免疫细胞选自：异体细胞或自体 细胞的任意一种，或不经基因改性的免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种，或抗原 提呈细胞或淋巴细胞的任意一种。
9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述免疫细胞选自：外围血单个核细 胞、骨髓细胞、造血前体细胞或干细胞的任意一种或多种、或它们的衍生细胞。
10. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述具有抗原反应性细胞为CD3 +T 淋巴细胞，包括⑶8+T和⑶4+T淋巴细胞。
11. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-2、 IL-4、IL-7、IL-12、IL-15中的任意一种或多种。
【文档编号】A61P31/22GK104491857SQ201410817936
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】王亚栋, 郎婧, 李晓祥 申请人:深圳市中美康士生物科技有限公司