本发明涉及一种天然防腐剂，以及其应用，和该防腐剂的制备方法。
背景技术：
目前人们使用的较多的是合成防腐剂，但经长期的研究发现，一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性，长期使用会对人体造成极大的伤害。例如，对羟基苯甲酸酯会使肿瘤细胞增殖，增加动物子宫重量，影响睾丸和附睾的精子数量及形态等。并且，长期使用合成防腐剂，细菌会产生一定的耐药性。因此，天然防腐剂代替合成防腐剂已经成为一个研究热点。
而目前使用的天然防腐剂多为粗制品，其颜色较深，气味较浓，抗菌谱也较窄。同时，有些中药联合使用后抗菌效果不如单味药。如黄芪和黄芩混合配比后对大肠杆菌、绿脓杆菌和沙门氏杆菌抑菌作用弱于单独使用。
在化妆品中使用天然防腐剂来代替合成防腐剂已成为一个重要的发展方向，具有很大的市场空间，如何制备出符合化妆品添加要求即高浓度又颜色浅的提取液，同时为广谱抗菌的防腐剂是目前急需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种具有广谱抗菌作用的天然防腐剂，包含山苍子，广藿香和香茅，其中，所述山苍子的重量配比为10～20份、所述广藿香的重量配比10～20份、所述香茅的重量配比10～20份。
本发明还提供了一种上述天然防腐剂在抗菌中的作用，其中，所述菌的种类为金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，白色念珠菌和/或黑曲霉。
本发明还提供了一种上述天然防腐剂的提取方法，其特征在于，包括如下特征：
(1)将10～20份山苍子，10～20份广藿香，10～20份香茅加入20～30倍80wt％～95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)在-10℃下陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得所述天然防腐剂提取物。
采用本发明的技术方案，能克服传统制备工艺制备的中药提取液颜色深，有效成分保留少，杂质多，抗菌谱窄等问题。通过中药间合理的配伍应用，使提取物具有广谱抗菌的作用。并且用渗漉的方法减少挥发性物质的损失，通过陈化出去部分杂质，从而更好的保留小分子物质，在满足化妆品使用要求和美感上有重要贡献。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
(1)取3g山苍子，2g份广藿香，4g份香茅，加入270g 80wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC(GTCC为由辛酸/癸酸和甘油酯化而成的高纯度油脂)；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
实施例2
(1)取2g山苍子，4g广藿香，3g香茅，加入225g 90wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
实施例3
(1)取4g山苍子，3g广藿香，2g香茅，加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例1
(1)9g山苍子中加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例2
(1)9g广藿香中加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例3
(1)9g香茅中加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例4
(1)取5g山苍子，3g广藿香，1g香茅，加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例5
(1)取1g山苍子，5g广藿香，3g香茅，加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
对比实施例6
(1)取3g山苍子，1g广藿香，5g香茅，加入180g 95wt％的乙醇渗漉法提取；
(2)渗漉提取24小时，过滤，取滤液；
(3)低温减压浓缩除去溶剂，置换成GTCC；
(4)-10℃陈化12小时，分层后过滤，取上清液，即得天然防腐剂提取物。
抑菌试验步骤：
(1)试验菌株
金黄色葡萄球菌(ATCC 8739)，大肠杆菌(ATCC 6538)，绿脓杆菌(ATCC9027)，白色念珠球菌(ATCC 10231)，黑曲霉菌(ATCC 16404)。
(2)培养基
TSB固体培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO42.5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂15g/L，蒸馏水溶解，调节pH为7.2±0.2，115℃高压灭菌20min；TSB液体培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO42.5g/L，酵母提取物3g/L，蒸馏水溶解，调节pH为7.2±0.2，115℃高压灭菌20min；
SDB固体培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO43g/L，酵母提取物5g/L，琼脂15g/L，蒸馏水溶解，115℃高压灭菌20min；SDB液体培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO43g/L，酵母提取物5g/L，蒸馏水溶解，115℃高压灭菌20min。
(3)菌悬液制备及接种
取甘油保藏的金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌100μL涂布于TSB固体培养基上，37℃培养2d，用生理盐水重悬，得到菌悬液，并用平板培养法计数，将测试菌浓度调整为105～106CFU/mL。
白色念珠球菌和黑曲霉菌100μL涂布于SDB固体培养基上，30℃培养2d，用生理盐水重悬，得到菌悬液，并用平板培养法计数，将测试菌浓度调整为105～106。
(4)样品抑菌作用的测定
杯碟法
在培养皿中倒入TSB或SDB固体培养基，待凝固后，在此培养基上均匀涂布测试菌100μL。在培养基上等距离放2个无菌牛津杯[内径(6.0±0.1)mm，外径(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯内分别注入200μL待 测样品，用生理盐水或含一定量的DMSO的生理盐水作为对照。37℃或30℃恒温箱中培养2d后，用直尺测量各种药品的抑菌圈直径，取其平均值。
微孔板法
在微孔中加入100μL待测样品(初始浓度)，再加入含测试菌浓度1.0×105CFU/mL为2×TSB或2×SDB液体培养基100μL，混匀，即待测样品的测试浓度为初始浓度的50wt％。30℃或37℃恒温箱中培养2d后，观察有无菌生长。结果判断的前提是生长对照良好，空白对照无菌生长清晰。
(5)最低抑菌浓度(MIC值)的测定
①最低抑制金黄色葡萄球菌浓度(MIC)、最低抑制大肠杆菌浓度(MIC)、最低抑制绿脓杆菌浓度(MIC)、最低抑制白色念珠球菌浓度(MIC)的测定方法如下：
(1)药液制备
将待测样品用生理盐水稀释成实验浓度。
(2)菌液制备用2×TSB或2×SDB液体培养基稀释菌悬液，使其最终菌浓度为l05CFU/mL。
(3)培养及结果判读在微孔中加入菌液100μL和药液100μL，同时设不加菌的阴性对照和不加药液的正常生长对照，每种药做3个平行，取平均值。置37℃或30℃湿盒孵育，48h后观察结果，采用直接法读取数据。结果判断的前提是生长对照良好，空白对照无菌生长清晰，其它孔随药物浓度梯度升高而菌的生长受到抑制。
②最低抑制黑曲霉浓度(MIC)测定
采用杯碟法，在培养皿中倒入SDB固体培养基，待凝固后，在此培养基上加入黑曲霉菌(105CFU/ml)100μL，均匀涂布。在培养基上等距离放3个无菌牛津杯[内径(6.0±0.1)mm，外径(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯内分别注入200μL不同浓度的样品(用生理盐水稀释)。同时设不加测试样品的正常生长对照和生理盐水对照。结果判断的前提是生长对照和生理 盐水对照生长良好，其它随药物浓度梯度升高而菌的生长受到抑制。
本发明与单味中药相比，产品抑菌结果如表1所示：
表1
本发明与不同比例中药相比，产品抑菌结果如表2所示：
表2
由表1可知，山苍子对大肠杆菌和黑曲霉菌的抗菌效果较弱；广藿香对金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌无抗菌效果；香茅对绿脓杆菌抗菌效果较弱，对大肠杆菌无抗菌效果。由表2可知，采用对比实施例的配方，产品的抑菌效果远小于本发明实施例的效果。本发明的组方抑菌功效显著，具有广谱的抗菌功效，其抑菌效果要好于单味药的效果，克服了单味药对某些菌株的局限性。同时，此发明的三种中药的比例可以最大限度的抑制细菌的增长。适合作为天然防腐剂使用，工艺方案保持了抑菌功效，并大幅减弱了产品的颜色，产品稳定，适合添加到化妆品中作为防腐剂使用。
综上所述，采用本发明实施例的技术方案，能克服传统制备工艺制备的中药提取液颜色深，有效成分保留少，杂质多，抗菌谱窄等问题。
本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。