包含细胞培养基、表皮生长因子和牛血清白蛋白的用于改善皮肤状态的化妆品组合物的制作方法

本发明涉及用于改善皮肤状态的化妆品组合物，其含有细胞培养基、表皮生长因子和牛血清白蛋白；通过使用所述化妆品组合物来改善皮肤状态的方法；以及预防或治疗皮肤疾病的方法。

背景技术：

表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)是促进胶原蛋白合成的通常组分，因此其表现出改善皱纹的效果。然而，由于过度使用egf会造成刺激癌细胞生长和转移的问题，所以为了安全起见，egf的用量受到了限制。因此，需要开发即使具有少量egf也能使其效果最大化的组合物。

同时，构成皮肤细胞的细胞为某种动物细胞，例如角质形成细胞(keratinocyte)和成纤维细胞(fibroblast)。用于培养以上细胞的培养基的典型组合物包含dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，杜氏改良的伊氏培养基)和胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)。

已知血清在细胞的生长促进、营养供给和保护细胞免受氧化和毒素中发挥作用。当细胞培养中不含血清时，细胞培养本身几乎不能实现，因此血清公认是细胞生长和增殖必不可少的组分。此外，已知血清含有的血清白蛋白占总血清蛋白质的约55％至60％，并且白蛋白吸引水分以维持血液中的水含量，从而提高皮肤弹性。目前，使用最广泛的血清组分是fbs和fcs(fetalcalfserum，胎牛血清)。

然而，最近报道fbs可引起人疯牛病。这可能威胁测试者的安全，并且因为直接从牛胎儿取得血清，所以还存在动物保护方面的问题。此外，由于fbs价格昂贵，因此存在增加培养基成本的缺点。

因此，持续需要开发不含fbs的对活体安全并且表现出改善皮肤状态(例如，改善皱纹、皮肤再生和创伤愈合)的优异效果的组合物。

发明的公开内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供对活体安全并且表现出改善皮肤状态(例如，改善皱纹、皮肤再生和创伤愈合)的优异效果的化妆品组合物，以及用于使用所述化妆品组合物改善皮肤状态的方法。

本发明的另一个目的是提供具有与以上化妆品组合物相同组成的药物组合物，以及使用所述药物组合物预防或治疗皮肤疾病的方法。

技术方案

根据本发明的目的，提供了用于改善皮肤状态的化妆品组合物，其包含以下有效成分：

a)细胞培养基；

b)0.4至0.8ng/ml表皮生长因子(egf)；和

c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)。

根据本发明的另一个目的，提供了用于使用以上化妆品组合物改善皮肤状态的方法。

根据本发明的另一个目的，提供了所述化妆品组合物在制备用于改善皮肤状态的化妆品中的用途。

根据本发明的另一个目的，提供了用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，其包含：

a)细胞培养基；

b)0.4至0.8ng/ml表皮生长因子(egf)；和

c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

根据本发明的另一个目的，提供了用于使用所述药物组合物预防或治疗皮肤疾病的方法。

根据本发明的另一个目的，提供了所述药物组合物在制备用于预防或治疗皮肤疾病的药物中的用途。

发明的有益效果

本发明的组合物不仅对改善皮肤状态如改善皱纹、皮肤再生和创伤愈合等有效，而且还可用于预防或治疗皮肤疾病如特应性皮炎、变态反应等。

附图说明

从以下结合附图对本发明的描述中，本发明的以上和其他目的和特征将变得明显。

图1是示出人成纤维细胞用实施例1以及比较例1和2的组合物进行处理之后的根据时间的细胞增殖率的图。

图2是示出人成纤维细胞用实施例1以及比较例1和2的组合物进行处理之后的iii型胶原蛋白合成能力的图。

图3和4分别提供人成纤维细胞用实施例1以及比较例1和2的组合物进行处理之前和之后的细胞图像，以及示出量化为细胞迁移速率的创伤愈合能力的图。

图5和6分别提供人成纤维细胞用实施例6以及比较例3和4的组合物进行处理之前和之后的细胞图像，以及示出量化为细胞迁移速率的创伤愈合能力的图。

图7和8分别提供人成纤维细胞用实施例7以及比较例5和6的组合物进行处理之前和之后的细胞图像，以及示出量化为细胞迁移速率的创伤愈合能力的图。

图9和10分别提供人成纤维细胞用实施例1至3以及比较例1和2的组合物进行处理之前和之后的细胞图像，以及示出量化为细胞迁移速率的创伤愈合能力的图。

图11和12分别提供人成纤维细胞用实施例1、4和5以及比较例1和2的组合物进行处理之前和之后的细胞图像，以及示出量化为细胞迁移速率的创伤愈合能力的图。

本发明最佳实施方式

下文中，将更详细地描述本发明。

本发明提供用于改善皮肤状态的化妆品组合物，其包含：a)细胞培养基；b)0.4至0.8ng/ml表皮生长因子(egf)；和c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

当施用至人皮肤时，根据本发明的组合物激活或促进皮肤中存在的成纤维细胞增加，并且促进胶原蛋白合成以改善皮肤状态，表现出改善皱纹、抑制皮肤老化、改善皮肤弹性、创伤(如疤痕)愈合、皮肤再生等的效果。

本发明的化妆品组合物可以用于保护皮肤免于功能退化或皮肤细胞损失，或用于改善皮肤状态；或者预防或治疗皮肤疾病。

这样的保护皮肤免于功能退化或皮肤细胞损失或者改善皮肤状态可包括抑制皱纹产生、抑制皮肤老化、改善皮肤弹性、皮肤再生、损伤或创伤愈合、角膜再生等。

所述皮肤疾病可包括炎性皮肤疾病，例如特应性皮炎、变态反应、皮肤湿疹、痤疮、银屑病等。

因此，本发明提供了用于使用这样的化妆品组合物改善皮肤状态的方法。

此外，本发明提供了该化妆品组合物在制备用于改善皮肤状态的化妆品中的用途。

所述方法可包括将化妆品组合物施用至需要改善皮肤状态的对象的皮肤的步骤。

本发明的化妆品组合物包含细胞培养基。

细胞培养基可以是能够培养哺乳动物细胞(例如成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、干细胞、肌细胞、生殖细胞和免疫细胞)的培养基。

在本发明中，可使用选自以下的细胞培养基：dmem/f-12、dmem和memα。

细胞培养基可以为不含fbs的培养基。在本发明中，其可以在不含昂贵并且可引起安全问题的fbs作为营养成分的情况下促进优异的细胞生长和增殖。

本发明的化妆品组合物包含作为细胞因子的egf。

可以包含如下量的egf：0.4至0.8ng/ml，优选0.4至0.6ng/ml，0.6至0.8ng/ml，0.4至0.5ng/ml，0.5至0.8ng/ml，0.6至0.7ng/ml或0.5至0.7ng/ml。

与常规的含有血清的培养基相比，通过向细胞培养基添加egf，本发明的组合物使细胞培养能够具有优异的细胞生长速率。

特别地，即使包含0.4至0.8ng/ml的少量的egf，本发明的组合物对细胞生长也无任何不利影响。此外，本发明的组合物可以促进胶原蛋白合成并且显示出皮肤再生效果，如创伤愈合。这是包含egf和bsa的本发明的化妆品组合物共同的协同效应。

本发明的化妆品组合物包含作为营养成分的bsa。

可以包含如下量的bsa：10至1,000μg/ml，优选10至100μg/ml，10至500μg/ml，100至500μg/ml，500至1,000μg/ml，50至200μg/ml或80至120μg/ml。

本发明的化妆品组合物还可包含选自以下的成分：氨基酸、维生素、碳源、无机盐，及其组合。

氨基酸可以为常规动物细胞培养基中使用的氨基酸成分，并且可选自，例如：甘氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-天冬酰胺-一水合物、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐-一水合物、l-半胱氨酸2hcl、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-组氨酸盐酸盐-一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠二水合物、l-缬氨酸、l-组氨酸、l-酪氨酸二钠盐，及其混合物。

在本发明中，氨基酸作为待用于细胞生长的蛋白质合成的来源。

基于组合物的总重量，包含的氨基酸的量可以为0.111至0.161wt％，例如1.110至1.606g/l。通过包含以上范围内的氨基酸，组合物可以帮助细胞的生长和维持并且提高制剂的稳定性。

维生素可以为常规动物细胞培养基中使用的维生素成分，并且可选自，例如：生物素、d-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素b12、氯化胆碱、无旋光肌醇(i-inositol)、抗坏血酸，及其混合物。

在本发明中，维生素发挥维持细胞活性的作用。

基于组合物的总重量，包含的维生素的量可以为0.0027至0.0060wt％，例如0.027至0.060g/l。通过包含以上范围内的维生素，组合物可以帮助维持细胞活性。

碳源可以为常规动物细胞培养基中使用的碳源成分，并且可选自例如：d-葡萄糖(右旋糖)、丙酮酸钠、次黄嘌呤na、胸苷、亚油酸、硫辛酸、腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧胞苷hcl、2′-脱氧鸟苷，及其混合物。

在本发明中，碳源作为能量来源，并且特别地，在碳酸氢钠的情况下可以发挥维持培养基的ph的作用。

基于组合物的总重量，包含的碳源的量可以为0.120至0.463wt％，例如1.201至4.625g/l。通过包含以上范围内的碳源，组合物不缺乏能量来源并且因此可以帮助细胞生长，并且可以提高制剂稳定性。

无机盐可以为常规动物细胞培养基中使用的无机盐成分，并且可选自，例如：氯化钙(cacl2)(无水)、硫酸铜五水合物(cuso4-5h2o)、硫酸亚铁七水合物(feso4-7h2o)、氯化镁(无水)、硫酸镁(mgso4)(无水)、氯化钾(kcl)、氯化钠(nacl)、无水磷酸氢二钠(na2hpo4)、磷酸氢钠一水合物(nah2po4-h2o)、硫酸锌七水合物(znso4-7h2o)、硝酸铁九水合物(fe(no3)3·9h2o)、碳酸氢钠(nahco3)，及其混合物。

在本发明中，无机盐发挥调节细胞功能的作用。

基于组合物的总重量，包含的无机盐的量可以为0.984至1.092wt％，例如9.838至10.923g/l。通过包含以上范围内的无机盐，组合物可以帮助调节细胞功能并且不会在配置成药物或化妆品中造成困难。

为了改善皮肤状态的目的，可将本发明的化妆品组合物直接施用至皮肤。

可将化妆品组合物配置成本领域常规制备的化妆品制剂。可将化妆品组合物配置成例如溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉末、肥皂、含有表面活性剂的清洁剂、油剂、粉底(powderfoundation)、乳剂底(emulsionfoundation)、蜡底(waxfoundation)和喷雾等，但本发明不限于此。更具体地，可将化妆品组合物配置成软洗液(softlotion)、营养洗液、营养霜、按摩霜、香精、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜(pack)、喷雾或粉末。

当本发明的化妆品组合物的剂型为糊剂、霜剂或凝胶时，其可包含选自以下的载体成分：动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅石、滑石、氧化锌，及其混合物。

当本发明的化妆品组合物的剂型为粉末或喷雾时，其可包含选自以下的载体成分：乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末，及其混合物。特别地，当剂型为喷雾时，其还可包含氟氯烃、丙烷/丁烷、二甲醚等。

当本发明的化妆品组合物的剂型为溶液或乳液时，其可包含选自以下的载体成分：溶剂、溶剂合物、乳化剂，及其混合物。其实例包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油(1，3-butylglycoloil)、甘油脂肪族酯、聚乙二醇、山梨聚糖脂肪酸酯，及其混合物。

当本发明的化妆品组合物的剂型为混悬剂时，其可包含选自以下的载体成分：稀释液(例如水、乙醇或丙二醇)、混悬剂(例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂、黄芪胶，及其混合物。

当本发明的化妆品组合物的剂型为含有表面活性剂的清洁剂时，其可包含选自以下的载体成分：脂肪族醇硫酸酯、脂肪族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐(isethionate)、咪唑啉盐衍生物、甲基牛磺酸、肌氨酸盐/酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺基甜菜碱(alkylamidobetaine)、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯，及其混合物。

本发明的化妆品组合物中的术语“载体成分”是指可包含在化妆品制剂中的已知化合物或组合物，并且无毒、与皮肤接触时无超过人体可以适应的水平的不稳定或刺激性。

除载体成分之外，本发明的化妆品组合物还可包含选自以下的辅助剂：抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、增湿剂(moisturizer)、色素、芳香剂、uv阻隔剂、着色剂、表面活性剂、及其组合。辅助剂没有限制，只要其为常规用于制备化妆品组合物的辅助剂即可。

此外，本发明提供了用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，其包含：a)细胞培养基；b)0.4至0.8ng/ml表皮生长因子(egf)；和c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

本发明的药物组合物的有效成分与上述化妆品组合物相同。

本发明的药物组合物可预防或治疗选自以下的炎性皮肤疾病：特应性皮炎、变态反应、皮肤湿疹、痤疮、银屑病、及其组合。

因此，本发明提供了使用所述药物组合物来预防或治疗皮肤疾病的方法。

此外，本发明提供了所述药物组合物在制备用于预防或治疗皮肤疾病的药物中的用途。

所述方法可包括将本发明的药物组合物施用至有此需要的对象的皮肤的步骤。对象可以为哺乳动物，具体地为人。

除有效成分之外，本发明的药物组合物还可根据需要包含可药用载体。

可药用载体可为常规用于制药中的载体，其可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、橡胶阿拉伯胶(rubberacacia)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟甲基苯甲酸酯、羟丙基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但是不限于此。

此外，本发明的药物组合物还可包含选自以下的一种或更多种可药用添加剂：润滑剂、保湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂，及其组合。

基于本发明的药物组合物的总重量，包含的载体的量可以为约1wt％至约99.99wt％，优选约90wt％至约99.99wt％，并且包含的可药用添加剂的量可以为约0.1wt％至约20wt％。

本发明的药物组合物可以经口施用或胃肠外施用，并且优选地，以表面方式直接施用至皮肤。

本发明的药物组合物的剂型可以为皮肤外用制剂的形式，例如，经皮施用的注射剂、软膏剂、溶液剂、霜剂、喷雾剂、贴剂等。

考虑到多种因素来确定本发明的药物组合物的合适剂量，例如配制方法，施用方法，患者的年龄、体重、性别、病理状况，食物，施用时间，施用途径，排泄速率和响应性。因此，剂量不应被解释为在任何方面限制本发明的范围。

本发明的方式

下文中，将基于以下实施例更详细地描述本发明。虽然以下实施例旨在说明本发明，但是本发明的范围不限于此。

实施例1

通过将0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有下表1所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

实施例2

通过将0.4ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有下表1所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

实施例3

通过将0.6ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有下表1所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

实施例4

通过将0.8ng/ml的egf和10μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有下表1所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

实施例5

通过将0.8ng/ml的egf和1,000μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有下表1所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

[表1]

不含fbs的dmem/f12培养基的组成

实施例6

通过将0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem培养基(其具有下表2所示的组成)中来制备用于改善皮肤状态的组合物。

[表2]

不含fbs的dmem培养基的组成

实施例7

通过将0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的memα培养基(其具有下表3所示的组成)来制备用于改善皮肤状态的组合物。

[表3]

不含fbs的memα培养基的组成

比较例1和2

通过分别仅将1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的dmem/f12培养基(其具有如表1所示的组成)来制备组合物。

比较例3和4

通过分别仅将1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的dmem培养基(其具有如表2所示的组成)来制备组合物。

比较例5和6

通过分别仅将1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的memα培养基(其具有如表3所示的组成)来制备组合物。

根据以上实施例和比较例的组合物总结在下表4中。

[表4]

实验例1：细胞增殖率的对比

将在培养皿中培养的人真皮成纤维细胞(韩国细胞系库)用0.05％(w/v)胰蛋白酶进行处理并且从培养皿分离。将3x10³分离的人真皮成纤维细胞与100μl的不含fbs的dmem/f12培养基(其具有表1所示的组成)混合，然后置于96孔板的各个孔中。在37℃和5％co2的条件下于恒温箱中培养一天之后，当细胞完全附着在96孔板的底部时，将存在的培养基移除。然后，分别用实施例1、比较例1或比较例2的组合物处理孔。使用无egf和bsa的不含fbs的dmem/f12培养基作为阴性对照。

将混合物在37℃和5％co2的条件下于恒温箱中孵育24小时、48小时和72小时，然后使用抽吸机将添加剂移除，并且用无菌磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline，pbs)将剩余培养液从96孔板中完全移除。

为验证细胞增殖，将10μl的cck-8反应溶液(dojindo)添加至各个孔并且在37℃下反应2小时。此后，使用model680微量培养板读数器(bio-rad，ca，美国)在450nm处测量吸光度。

基于在不含细胞因子的培养基(即阴性对照)中生长的细胞的吸光度值的各个孔的吸光度值的对比结果示于图1中。

如图1所示，经实施例1的组合物处理的组未显示细胞毒性，表明细胞增殖率优异。特别地，验证了在培养72小时之后，该细胞增殖率的提高超过了经比较例2的组合物(向其中添加了20ng/ml高浓度的egf)处理的组。

实验例2：胶原蛋白合成效果的评估

将从人皮肤组织中分离的人真皮成纤维细胞(韩国细胞系库)在含有10％fbs和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基(gibco)中在5％co2条件下培养，然后将经培养细胞的3×10⁵个细胞接种到6孔板。第二天，用pbs洗涤经培养的细胞一次，然后用不含fbs的dmem/f12培养基替换培养基。用实施例1、比较例1或比较例2的组合物处理细胞并且培养24小时。

反应完成之后，收集细胞培养液并且进行iii型胶原蛋白的elisa分析(cusabiobiotechco.，中国，武汉)以测定各自胶原蛋白的合成浓度。根据试剂盒中包含的该公司提供的指导进行elisa分析。结果示于图2中。

如图2所示，经实施例1的组合物处理的组显示出最佳的胶原蛋白合成能力，其类似于经比较例2的组合物(向其中添加了20ng/ml的高浓度的egf)处理的组。

实验例3：人真皮成纤维细胞迁移的验证

为了研究本发明的组合物的创伤愈合能力，验证了人真皮成纤维细胞的迁移能力。

首先，将6×10⁴细胞/ml人真皮成纤维细胞(韩国细胞系库)接种至ibidi培养插管(ibidigmbh，m，德国)室(由通过70μm隔膜分隔的两个储存器组成)。然后，将室中的细胞在5％co2和37℃的条件下培养12小时。

经培养的细胞分别用实施例1、比较例1和比较例2的组合物进行处理。图3提供通过倒置显微镜(olympus)获得的拍摄图像，其示出了组合物处理之前与9小时之后的细胞迁移度。

使用t-scratch软件(computationalscience&engineeringlaboratory，ethzurich，瑞士)对图像进行分析以计算各个处理组的细胞迁移速率，其为基于设置为100％的阴性对照结果的细胞覆盖区的比率(％)。结果示于图4中。

如图3和4所示，经实施例1的组合物处理的组显示出最佳的创伤愈合能力，其类似于经比较例2的组合物(其中添加20ng/ml的高浓度的egf)处理的组。

此外，使用实施例6以及比较例3和4的组合物以如上述的相同方式进行的创伤愈合能力的验证结果示于图5和6中。此外，使用实施例7以及比较例5和6的组合物以如上述的相同方式进行的创伤愈合能力的验证结果示于图7和8中。

如图5和6以及图7和8所示，分别经实施例6和7的组合物(通过将egf和bsa同时添加至不含fbs的dmem培养基或不含fbs的memα培养基制备)处理的组显示出最佳的创伤愈合能力，其类似于经比较例4和6的组合物(其中单独添加20ng/ml的egf)处理的组。

同时，为了验证依赖于本发明的组合物中egf的量的创伤愈合能力，使用实施例1至3以及比较例1和2的组合物以如上述相同的方式进行实验。结果示于图9和10中。如图9和10所示，与阴性对照组相比，分别经含有0.4至0.8ng/ml的egf的实施例1至3的组合物处理的所有组显示出高达50％的改善效果，其类似于经比较例2的组合物(其中单独添加20ng/ml的egf)处理的组。

此外，为了验证依赖于本发明的组合物中bsa的量的创伤愈合能力，使用实施例1、4和5以及比较例1和2的组合物以如上述相同的方式进行实验。结果示于图11和12中。如图11和12所示，与阴性对照组相比，分别经含有10至1,000μg/ml的bsa的实施例1、4和5的组合物处理的所有组显示出高达40％的改善效果，其类似于经比较例2的组合物(其中单独添加20ng/ml的过量的egf)处理的组。

这些结果证明，与含有单独过量egf的组合物相比，含有egf与bsa组合的本发明的组合物显示出更优异的胶原蛋白合成效果和细胞再生效果。

因此，本发明的组合物未显示细胞毒性，并且即使当含有少量egf时也提高了胶原蛋白合成。这样的组合物通过提高的创伤愈合能力和皱纹改善效果而显示出优异的皮肤再生效果。此外，这样的组合物不仅通过降低生产成本至约1/20而具有更优异的价格竞争性，而且显著降低由过量使用egf引起的癌症发生率，并且因此其可以安全地施用至活体。