蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，是一种蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术：

病毒性传染病的发病率很高，死亡率也很高,其传播造成了严重的社会影响和经济损失。在人类已发现众多病毒中,流感被认为是迄今为止危害最大的传染性疾病，其波及范围之广，造成的经济损失之大位于传染性疾病之首。每年在世界各地发生的流感大流行，严重影响着人们的生活和工作，甚至危及生命。近年来，新型流感病毒的不断出现，又使人类面临更大的威胁。虽然疫苗接种是预防病毒感染最有效的方法，但流感病毒不仅致病力强，而且具有高度的变异性，人类无法获得持久的免疫力，因而抗病毒药物对于保护高危人群和控制病毒感染起着重要作用。随着现代分子生物学技术的发展，抗流感药物的研究取得了较大进展，然而到目前为止，无论是已上市的抗病毒药物还是一些待开发的候选药物，均存在不足之处，难以获得较理想的抗病毒作用，寻找和发现新的抗流感药物任重而道远。

抗流感药物研究现状

当今抗流感药物的研究主要从血凝素(Hemagglutini，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、M2蛋白(Matrix protein2，M2)三个流感病毒特异性靶点入手。虽然国内外已针对上述三个靶点设计合成了不少化合物，并通过广泛研究，从中发现了一些有效药物，但数量还很有限。如M2蛋白阻滞剂金刚烷胺(Amantadine)和金刚乙胺(Rimantadine)，NA抑制剂扎米那韦(Zanamivir)和奥司他韦(Osehamivi)。还有一类是核苷类抗病毒药物，目前最常用的是利巴韦林(Ribavirin，病毒唑)，具有广谱强效性，在临床上广泛用于治疗流感。目前许多国家的医疗机构都将上述几种药物作为流感大流行时期的储备药物。尽管已被公众所接受，利巴韦林在临床使用中不仅可引发多种一般性不良反应，还有可能导致溶血性贫血、低血压等严重不良反应；金刚烷胺和金刚乙胺在体内外均可迅速产生耐药和交叉耐药，已逐渐失去其原有的临床价值；扎米那韦和奥司他韦也已在临床分离到耐药株。已有的证据显示，目前用于抗流感的药物最终都会产生耐药性，而且这些药物还被报道存在严重的不良反应。

抗流感药物的发展趋势

在过去的20年，随着对流感发病过程的深入探索，对于流感病毒在复制中与宿主细胞间交互作用的认识已经逐步积累起来，这种知识积累的进步不仅促进了我们对于流感病毒生物学特征的理解，并且也为探索抗病毒策略提供了新的途径。

当前，大部分抗流感策略都聚焦于药物对特定病毒蛋白活性的抑制作用，如对M1、M2、NS1等蛋白的抑制作用。值得一提的是，有些药物其抗病毒作用可改变病毒复制所必须的宿主细胞活动，这可能对于治疗一些严重的病毒感染是十分有利的。已有研究显示，相比单纯抗病毒药物，同时具有抗病毒活性和免疫调节双重作用的药物可更有效地保护A/H5N1感染小鼠。研究者认为，这类药物的作用在自然界可能更常见，并且可能具有广谱的抗病毒作用。最重要的是，它们可能不像针对宿主的抗病毒药物那样易产生耐药性。因而，结合病毒感染后机体免疫系统的反应特点，寻找可针对病毒复制-宿主反应发挥双重效应的有效成分，可能是发现新型抗流感药物的理想策略。如某些干扰素具有免疫调节活性，并且它可作用于宿主细胞膜上的相应受体，激活该细胞核中基因表达产生多种抗病毒蛋白，这些蛋白可通过抑制病毒多肽链的合成发挥抗病毒作用。

在已报道的多种抗流感策略中，针对流感病毒RNA聚合酶的研究也受到高度关注。RNA聚合酶是由PB2、PB1和PA三个亚基组成的异源多聚体，负责病毒RNA复制、转录等多种生物学功能，该酶比较稳定，不容易发生变异，因而针对这一靶点的研究，对发现新型抗流感药物具有重要意义。由于到目前还没有获得构成病毒聚合酶复合体的蛋白的高分辨率结构数据，从而阻碍了基于结构设计获得RNA聚合酶抑制剂的途径。目前，针对天然产物中抗流感活性成分的研究，可能是发现RNA聚合酶抑制剂更有效的途径。2-FDG是Itzhak报道的具有抑制流感病毒复制酶活性的核苷类化合物，能够特异性地作用于聚合酶PB1亚基活性位点，Tsai发现4，2-双杂环衍生物是一种非核苷类的聚合酶抑制剂，具有中等的抗流感病毒活性，IC50值为29mg/mL至37mg/mL。

2009年世界卫生组织(WHO)发布世界公共健康流感工作议程中提到要加大从天然药物中寻找具有抗病毒活性的抗流感药物的力度，大量研究发现中药民族药在防治流感方面具有独特的优势和广阔的发展前景，特别是中药黄酮类物质，具有抗病毒、抗炎、调节免疫多方面的作用，是多数中药发挥抗流感作用的活性部位。据曹锦花报道，黄芩及其有效成分黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩素和汉黄芩苷等黄酮类化合物都具有抗病毒作用。Nagai等报道，黄芩中提取的黄酮类化合物通过抑制病毒包涵体/溶酶体膜的融合，能减少流感病毒感染小鼠的病毒复制；当黄芩黄酮类加到流感病毒感染的MDCK细胞时，能减少病毒的释放。赵文华等对连翘抗流感病毒作用的物质基础进行了研究，结果发现黄酮类、苯乙醇苷类及木脂素类成分是连翘抗流感病毒作用的主要物质基础。另据报道，银翘散中的抗流感病毒有效部位主要为黄酮类成份，半枝莲、黄芩、余甘子等总黄酮提取物均具有抗流感病毒作用。

蓟黄素为一种黄酮类化合物，2002年张启伟等从滨蒿(Artemisia scoparia Waldst.et Kit.)中提取分离得到，1992年蒋洁云也曾从滨蒿的同属植物茵陈蒿(A.capillaris Thunb.)中分离得到，Park(1995年)和Ingrid(2003年)等研究发现，蓟属植物如大蓟和乌苏里江蓟中也含有此种化合物。其化学结构式如下：

据以往的研究报道，蓟黄素对射线和氮芥损伤均有良好的保护作用，对致癌物质环磷酰胺也表现出良好的解毒效果，能显著抑制Hela细胞和Ehrlieh腹水癌细胞增殖。但有关蓟黄素的抗病毒作用及其在制备抗病毒药物中的应用在国内外均未见有报道，也未检索到有相关的文献。

技术实现要素：

本发明提供了一种蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决有关蓟黄素的抗病毒作用及其在制备抗病毒药物中的应用在国内外均未见有报道的问题。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述蓟黄素为从滨蒿或者蓟属植物中提取得到；或，蓟黄素为经化学合成的方法得到。

上述蓟黄素的剂型为片剂或胶囊剂。

上述片剂为蓟黄素片，每片蓟黄素片中蓟黄素按重量计为10毫克至100毫克；或，胶囊剂为蓟黄素硬胶囊，每粒蓟黄素硬胶囊中蓟黄素按重量计为10毫克至100毫克。

本发明首次提出了蓟黄素具有明确的抗流感病毒作用，可显著抑制流感病毒感染所致的细胞病变，对流感病毒A/FortMonmouth/1/1947和A/jinnan/15/2009的半数抑制浓度与Amantadine(金刚烷胺)和Ribavirin(利巴韦林)相当；同时蓟黄素可显著抑制流感病毒特异性蛋白M2蛋白的表达，并降低流感病毒RNA的表达水平，蓟黄素40μg/mL浓度对流感病毒M2蛋白表达及流感病毒RNA的表达的抑制作用强度与Ribavirin(利巴韦林)10μM浓度相当，说明蓟黄素抗流感病毒作用强度接近目前临床常用的抗病毒药物，应用于制备抗流感病毒药物有良好的前景。

附图说明

附图1为Western blot检测蓟黄素药物对流感病毒M2蛋白的表达。

附图2为Real-time PCR检测蓟黄素对流感病毒M2RNA的表达。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

实施例1，该蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用。

实施例2，作为上述实施例的优化，蓟黄素为从滨蒿或者蓟属植物中提取得到；或，蓟黄素为经化学合成的方法得到。

实施例3，作为上述实施例的优化，蓟黄素的剂型为片剂或胶囊剂。

实施例4，作为上述实施例的优化，片剂为蓟黄素片，每片蓟黄素片中蓟黄素按重量计为10毫克至100毫克；或，胶囊剂为蓟黄素硬胶囊，每粒蓟黄素硬胶囊中蓟黄素按重量计为10毫克至100毫克。

上述蓟黄素在制备抗病毒药物中的应用如下：

蓟黄素可为市售，蓟黄素片或蓟黄素硬胶囊可按现有方法进行制备，将蓟黄素、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁按质量比为1:0.3:1:0.2混合均匀后，压片或装入硬胶囊壳得到蓟黄素片或蓟黄素硬胶囊；每片蓟黄素片或每粒蓟黄素硬胶囊中蓟黄素均按重量计为10毫克至100毫克，临床用量为每次1片至2片蓟黄素片或1粒至2粒蓟黄素硬胶囊，每天2次至3次。

将市售的蓟黄素或得到的蓟黄素片或蓟黄素硬胶囊进行药效学试验，其药效学试验如下：

一.蓟黄素对流感病毒的抑制作用

实验材料：流感甲型病毒(H1N1亚型A/FortMonmouth/1/1947病毒株)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2015.11)，-80℃保存。阳性对照药：利巴韦林Ribavirin(RBV)，Sigma公司(北京大学提供)；金刚烷胺(Amantadine)，Sigma公司。样品蓟黄素片或蓟黄素硬胶囊,由新疆药物研究所药理室提供，实验时将片剂粉碎或取胶囊内容物配成所需要浓度的溶液或混悬液给药，给药浓度或剂量均按蓟黄素原料计。样品用DMSO配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL,再用培养液依次作2倍稀释，实验时取8个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL；Ribavirin(利巴韦林)用细胞维持液配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL，再用培养液作2倍稀释，实验时取9个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL；Amantadine(金刚烷胺)用细胞维持液配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL，再用培养液作2倍稀释，实验时取8个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL。

实验原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品对病毒致细胞病变程度(CPE)的抑制作用。

蓟黄素样品对病毒致细胞病变的影响：MDCK细胞接种96孔培养板，置5％CO2，37℃培养24小时。MDCK细胞加入流感病毒，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物的维持液。同时设病毒对照和细胞对照，37℃培养，待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时，观察各组细胞病变程度(CPE)，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC50)，实验结果见表1所示。

结论：从表1可以看出，本次试验条件下，蓟黄素对流感病毒A/FortMonmouth/1/1947有较好的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信；实验结果表明，蓟黄素对流感病毒A/FortMonmouth/1/1947抑制活性与阳性对照药Ribavirin(利巴韦林)、Amantadine(金刚烷胺)相当。

二.蓟黄素对流感病毒耐药株的抑制作用

实验材料：流感甲型病毒(H1N1亚型A/jinnan/15/2009病毒株，达菲耐药株)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2015.10)，-80℃保存。阳性对照药：利巴韦林Ribavirin(RBV)，Sigma公司(北京大学提供)；金刚烷胺(Amantadine)，Sigma公司。样品蓟黄素片或蓟黄素硬胶囊,由新疆药物研究所药理室提供，实验时将片剂粉碎或取胶囊内容物配成所需要浓度的溶液或混悬液给药，给药浓度或剂量均按蓟黄素原料计。样品用DMSO配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL,再用培养液依次作2倍稀释，实验时取8个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL；Ribavirin(利巴韦林)用细胞维持液配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL，再用培养液作2倍稀释，实验时取9个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL，0.78μg/mL；Amantadine(金刚烷胺)用细胞维持液配成20mg/mL母液，临用前溶于细胞维持液，配成200μg/mL，再用培养液作2倍稀释，实验时取8个浓度：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL。

实验原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。

蓟黄素样品对病毒致细胞病变的影响：MDCK细胞接种96孔培养板，置5％CO2，37℃培养24小时。MDCK细胞加入流感病毒，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物的维持液。同时设病毒对照和细胞对照，37℃培养，待病毒对照组病变程度(CPE)达4+时，观察各组细胞病变程度(CPE)，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC50)；实验结果见表2所示。

结论：从表2可以看出，本次试验条件下，蓟黄素对流感病毒A/jinnan/15/2009(H1N1，达菲耐药株)有较好的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，试验系统成立，试验结果可信；实验结果表明，蓟黄素对流感病毒A/jinnan/15/2009抑制活性与阳性对照药Ribavirin(利巴韦林)、Amantadine(金刚烷胺)相当。

三.蓟黄素对流感病毒特异性蛋白M2的抑制作用

试验方法：

细胞内RNA的提取：胰酶消化MDCK细胞，计数，将MDCK 9*105个/孔，接种于6孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养。24小时后弃去培养基用5*10-5A/Fort Monmouth/1/1947病毒液感染吸附细胞2h，感染完成后加入维持液稀释的药物继续培养24小时，设置病毒对照组，细胞对照组，阳性药组(利巴韦林RBV，10μM)，蓟黄素(40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL)。使用RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白。

Western blotting实验：将处理好的样品和预染Marker上样于配置好的PAGE胶上样孔中；恒压60V，样品经浓缩胶30min后，将电压调至120V；电泳结束后，将上层浓缩胶除去，分离胶在电转缓冲液中漂洗；将PVDF膜，滤纸集凝胶放入电转缓冲液中浸泡10min；恒压110V，湿转74min；电转结束，取出PVDF膜，靠近胶面的膜面朝上充分浸入5％脱脂奶粉的封闭液中，封闭1；将一抗(actin,NS1,M2)用3％牛奶(1:1000，1:400)稀释至适当浓度，孵育1h20min；TBST洗膜3次，每次10min；准备二抗(鼠抗1：5000)并与膜接触，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；凝胶成像仪曝光显影，Western blot检测蓟黄素药物对流感病毒M2蛋白的表达见图1所示。

实验结果：从图1可以看出，与病毒对照组相比，蓟黄素40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL剂量的M2蛋白条带灰度明显减弱，结果说明蓟黄素可以显著抑制流感病毒M2蛋白表达。

四.蓟黄素对流感病毒RNA的抑制作用

试验方法：

细胞内RNA的提取：胰酶消化MDCK细胞，计数，将MDCK 9*105个/孔，接种于6孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养。24小时后弃去培养基用5*10-5A/Fort Monmouth/1/1947病毒液感染吸附细胞2h，感染完成后加入维持液稀释的药物继续培养24小时，设置病毒对照组，细胞对照组，阳性药组(利巴韦林，10μM)，蓟黄素(40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL)。使用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA。

Real–time PCR：

1.设计并合成特异引物：

M2上游引物：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’，

M2下游引物：3’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG5’；

GAPDH上游引物：5'-AGTCAAGGCTGAGAACGGGAAACT-3’，

GAPDH下游引物：3'-TCCACAACATACTCAGCACCAGCA-5’

2.荧光定量使用TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒，1)反应体系：SuperMix 7.5μL，Enzyme Mix 0.3μL，Forward Primer(10μM)0.3μL，Reverse Primer(10μM)0.3μL，Template(100pg to 1μg of genomic RNA)1μL，Water 5.3μL。2)反应条件：50℃5min，94℃30s，35cycles of：94℃5s、60℃30s。

3.Q-PCR相对定量结果计算方法：采用SybrGreen ER荧光检测系统对目的基因进行相对定量分析，采用看家基因GAPDH作为内参照对Ct值进行归一化处理，基因表达差异计算方法采用△△Ct法，Real-time PCR检测蓟黄素对流感病毒M2RNA的表达见图2所示，图2中CST-10、CST-20和CST-40分别表示不同剂量的蓟黄素，与Con组相比，**p<0.01,*p<0.05。

实验结果：从图2可以看出，与病毒对照组相比；蓟黄素40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL剂量可以显著降低流感病毒M2RNA的表达水平，具有显著的统计学差异(p<0.01，p<0.05)，结果说明蓟黄素可显著抑制流感病毒RNA的表达。

对滨蒿总黄酮部位进行了大量研究，体内、外抗病毒实验表明，滨蒿总黄酮部位对流感病毒具有明显的抑制作用：其对甲型流感病毒临床分离株致细胞病变(CPE)的半数抑制浓度(IC50)为74.6μg/mL，选择指数(SI)为16.8，对乙型流感病毒致CPE的IC50为98.5μg/mL，SI为12.7；作用机理的研究表明，滨蒿总黄酮部位不仅可同时作用于NA、M2蛋白和HA三个靶点，发挥直接抗病毒作用，而且对小鼠的免疫功能也有调节作用，以0.4g/kg剂量口服给药对流感病毒鼠肺适应株PR8感染的小鼠肺炎模型具有明显的保护作用，其死亡保护率为54.5％，生命延长率为38.2％，肺指数抑制率为25.9％；此剂量还可显著降低流感病毒感染小鼠血清中IFN-γ、IL-6及IL-8的含量。

综上所述，本发明首次提出了蓟黄素具有明确的抗流感病毒作用，可显著抑制流感病毒感染所致的细胞病变，对流感病毒A/FortMonmouth/1/1947和A/jinnan/15/2009的半数抑制浓度与Amantadine(金刚烷胺)和Ribavirin(利巴韦林)相当；同时蓟黄素可显著抑制流感病毒特异性蛋白M2蛋白的表达，并降低流感病毒RNA的表达水平，蓟黄素40μg/mL浓度对流感病毒M2蛋白表达及流感病毒RNA的表达的抑制作用强度与Ribavirin(利巴韦林)10μM浓度相当，说明蓟黄素抗流感病毒作用强度接近目前临床常用的抗病毒药物，应用于制备抗流感病毒药物有良好的前景。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

表1

注：TC₅₀：药物半数有毒浓度；IC₅₀：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC₅₀/IC₅₀。

表2

注：TC₅₀：药物半数有毒浓度；IC₅₀：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC₅₀/IC₅₀。