本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸭沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用。
背景技术：
沙门氏菌是肠杆菌科成员，超过2500个血清型，在自然界分布广泛，几乎所有动物都能发生感染。
雏鸭很容易感染沙门氏菌，尤其是出壳后几天到三周龄的雏鸭，死亡率达10～60%。沙门氏菌在自然界中分布很广，大多数鸭场普遍存在，特别是环境卫生较差的鸭场，因此，鸭群接触传染源的机会很多。另外，有研究发现沙门氏菌可在许多健康鸭只的盲肠内寄居，当饲养管理不善、环境卫生恶劣、天气骤变、长途运输等应激时，造成鸭只抵抗力下降或肠道菌群紊乱，促使沙门氏菌进入内脏器官而引起发病，因而有“条件性疾病”之称。
规模化养殖场如果感染沙门氏菌，除去引起发病死亡之外，往往长期带毒并间歇排毒，当人接触这些健康带菌动物、或食用被沙门氏菌污染的畜禽产品时就很容易发生感染，轻则造成自限性腹泻，重则可引起系统性疾病（如伤寒热），由此可见，沙门氏菌是相当重要的人畜共患病。
沙门氏菌血清型如此繁多，所以在疫苗免疫方面，虽然多价灭火疫苗应用范围很广，效果也不错，但是，依然有很多养殖地区的血清型跟免疫的疫苗对不上，导致免疫效果不理想，这也是目前市场普遍存在的问题。因此，研制出有效的当地疫苗具有重大的现实意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是当地疫苗血清型不符，为解决上述问题，本发明提供一种鸭沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种鸭沙门氏菌灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
（1）从当地肉鸭养殖场内选取感染鸭沙门氏菌的肉鸭，分离出鸭沙门氏菌；
（2）将步骤（1）分离得到的鸭沙门氏菌进行扩大培养，灭活，4℃保存备用；
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.8-1.2份，吐温-80 1.5-2.5份，蜂胶 1.5-2.5份，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为（2-4）：（6-8）。
所述步骤（2）具体步骤为：将步骤（1）分离得到的鸭沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后， 4℃保存备用。
所述步骤（3）中的佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1份，吐温-80 2份，蜂胶2份。
所述步骤（4）中鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3：7。
一种鸭沙门氏灭活疫苗，该鸭沙门氏灭活疫苗是用权利要求1-4任一所述的鸭沙门氏灭活疫苗的制备方法制备而得的。
一种鸭沙门氏灭活疫苗的应用，权利要求5所述的鸭沙门氏灭活疫苗在预防或治疗鸭沙门氏菌感染疾病中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
（1）本发明提供的鸭沙门氏菌灭活疫苗使用蜂胶佐剂吸收性更好，产生免疫效果更快更好，司盘-80、吐温-80乳化性好，疫苗稳定性好，适合储存、运输。
（2）本发明的提供的鸭沙门氏菌灭活疫苗针对性强，对当地流行的沙门氏菌菌株免疫效果好，制备工艺操作简单，成本较低，易于储存，适用于有实验室的规模性养殖场。
具体实施方式
实施例1：
一种鸭沙门氏菌灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
（1）从当地肉鸭养殖场内选取感染鸭沙门氏菌的肉鸭，分离出鸭沙门氏菌；
（2）将步骤（1）分离得到的鸭沙门氏菌进行扩大培养，灭活，4℃保存备用；
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.8-1.2份，吐温-80 1.5-2.5份，蜂胶 1.5-2.5份，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为（2-4）：（6-8）。
步骤（2）具体步骤为：将步骤（1）分离得到的鸭沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后， 4℃保存备用。
步骤（3）中的佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1份，吐温-80 2份，蜂胶2份。
步骤（4）中鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3：7。
一种鸭沙门氏灭活疫苗，该鸭沙门氏灭活疫苗是用权利要求1-4任一所述的鸭沙门氏灭活疫苗的制备方法制备而得的。
一种鸭沙门氏灭活疫苗的应用，权利要求5所述的鸭沙门氏灭活疫苗在预防或治疗鸭沙门氏菌感染疾病中的应用。
实施例2：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.8g，吐温-80 1.5g，蜂胶 1.5g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为2：6。
实施例3：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.85g，吐温-80 1.6g，蜂胶 1.6g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为2：7。
实施例4：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.9g，吐温-80 1.8g，蜂胶 1.8g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为2：8。
实施例5：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 0.95g，吐温-80 2g，蜂胶 2g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3：6。
实施例6：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1.0g，吐温-80 2.1g，蜂胶 2.1g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3：7。
实施例7：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1.05g，吐温-80 2.2g，蜂胶 2.2g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3：8。
实施例8：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1.1g，吐温-80 2.3g，蜂胶 2.3g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为4：6。
实施例9：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1.15g，吐温-80 2.4g，蜂胶 2.4g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为4：7。
实施例10：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1.2g，吐温-80 2.5g，蜂胶 2.5g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为4：8。
实施例11：
（1）选取当地肉鸭养殖场疑似感染沙门氏菌病的肉鸭，取一小块病变严重的组织器官（约0.5g），置于LB肉汤中，37℃ 160 r/ min摇床摇6h，取LB肉汤变混浊的样品，接种到科玛嘉沙门氏菌显色培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，取红色或紫红色菌落，纯化培养得到一株细菌，经染色、鉴别培养基、生化实验鉴定为沙门氏菌。
（2）将步骤（1）得到的沙门氏菌接种到普通营养琼脂平板上，挑选边缘整齐、表面有光泽、湿润、光滑的单株菌落接种到LB肉汤中，37℃下200rpm震荡10h，经过细菌计数后加入质量分数为0.4%的福尔马林灭活， 24h后进行无菌检验，无菌检验合格后，4℃保存备用。
无菌检验方法：分别取灭活菌液少量接种于LB平板上，37℃培养24h，应无细菌生长。
（3）配制佐剂：所述佐剂由以下重量份数的原料组成：司盘-80 1g，吐温-80 2g，蜂胶 2g，按重量配比称取司盘-80、吐温-80和蜂胶，混合均匀；
（4）将灭活的鸭沙门氏菌稀释至其浓度大于5×109 CFU/mL，再将步骤（3）制备的佐剂加入到菌液中，混合均匀，即可得到灭活鸭沙门氏菌疫苗；
其中，鸭沙门氏菌菌液与佐剂的质量比为3:7。
稳定性实验：
取实施例9-11的鸭沙门氏菌灭活疫苗分别进行稳定性实验：
1. 常温稳定性试验
取实施例9-11的鸭沙门氏菌灭活疫苗置于常温0d，30d，60d，120d和180d观察。观察结果表明，外观如初，无变色、结晶等情况发生，说明该发明样品在常温下稳定性良好。
2. 4℃观察试验
取实施例9-11的鸭沙门氏菌灭活疫苗置于4℃温度下，分别在制备后第0d，7d，15d，21d和30d观察，观察结果表明，外观如初，无变色、结晶等情况发生，说明该发明样品在4℃温度下稳定性良好。
3. 抗冷冻稳定性
将实施例9-11的鸭沙门氏菌灭活疫苗置于-10℃冰箱内保存10d，恢复至室温观察。结果表明，实施例9-11的鸭沙门氏菌灭活疫苗，外观如初，无变色、结晶等情况发生，说明该发明样品在-10℃温度下稳定性良好。
临床疗效试验：
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：
1. 试验方案
选择健康7日龄雏鸭100只，随机分为5组：
A组，20只，按照实施例1制备的鸭沙门氏菌灭活疫苗，0.5ml/只，腿部肌肉免疫；
B组，20只，按照实施例2制备的鸭沙门氏菌灭活疫苗，0.5ml/只，腿部肌肉免疫；
C组，20只，按照实施例3制备的鸭沙门氏菌灭活疫苗，0.5ml/只，腿部肌肉免疫；
D组，20只，用生理盐水注射0.5ml/只，A-D组免疫后7天，用沙门氏菌感染；
E组，20只，空白实验对照，不免疫不感染。
2. 评价指标
2.1 临床症状 每天定时观察并记录鸡的临床症状，如食欲、呼吸、精神状态等；
2.2 病理检查 对死亡鸭进行解剖，观察病理变化。
2.3 疗效判定 治愈、好转、有效、死亡。
3. 结果
3.1 临床症状
健康雏鸭免疫后，精神症状、采食状况均无明显变化。感染沙门氏菌后发病鸭主要表现为精神沉郁、羽毛松乱、食欲不振、饮水增加、肛门粘有色稀粪，严重感染者出现死亡现象。
3.2 病理变化
发病雏鸭剖检可见，肝脏肿大、边缘钝圆有细小的灰白色坏死点，肠道粘膜充血、出血，表面有白色坏死点，部分盲肠肿大。
3.3 临床疗效
临床疗效结果见表1，由表1可知，A、B、C组均使用鸭沙门氏菌灭活疫苗免疫后攻毒，得到的保护率为95%、95%、100%；D组阳性对照，死亡率达到40%，E组空白对照。由此说明使用本发明制备的疫苗免疫，对控制当地鸭沙门氏菌感染有很好的效果。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。