含氮杂环酯类化合物在制备抗柯萨奇病毒B3型的药物中的应用的制作方法

本发明属于抗病毒药物技术领域，具体涉及含氮杂环酯类化合物在制备抗柯萨奇病毒B3型的药物中的应用。

背景技术：

柯萨奇病毒(Coxsaekievirus，CV)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，其感染可引起多种疾病，如手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、流行性肌炎痛、疱疹性咽峡炎等。已报道的CV共有29个血清型，根据其对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，可将其分为A和B两组，即CVA(CVA1-22,24)和CVB(CVB1-6)。以CVBs的感染最为常见，其中CVB3是CVB六个血清型中致病性最强的一种，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。据美国疾病预防控制中心(CDC)统计数据发现，CVB(1-6型)每年可导致约500万人患肠道系统疾病，其中10％-20％是由CVB3引起的急性心肌炎。近年来CVB3引起手足口病的趋势也在上升，在我国也有很多CVB3引发疾病流行的报道。目前对于柯萨奇病毒感染无特效药物，临床尚无有针对性的治疗手段。很多研究者找到了众多在体内外具有抑制CVB3活性的化合物，但是这些基本还处于实验室试验的初级阶段，距离在临床上的实际应用还比较遥远。因此开发特异有效的抗CVB3药物势在必行。

酯类化合物是一类重要的精细化工产品，广泛应用于药物、材料、食品、增塑剂、溶剂等化工行业。本申请人所在项目组自主合成了两种具有新型结构的含氮杂环酯类化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这几种芳香酯化合物的制备方法。未对其生物学活性进行评价。

技术实现要素：

本发明的目的是提供含氮杂环酯类化合物WY209或WY210在制备抗柯萨奇病毒B3型的药物中的应用，所述的含氮杂环酯类化合物WY209、WY210，其结构式如式(I)、式(II)：

本发明在细胞水平发现WY209和WY210具有抗CVB3病毒的活性，具体表现为可以强烈抑制CVB3病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率。强烈抑制CVB3病毒在细胞内的复制增殖，降低子代病毒产量，保护细胞免受CVB3感染引发的凋亡。

进一步地，本发明的第二个目的是提供一种抗柯萨奇病毒B3型的药物，包含有效剂量的作为活性成份的如式(I)或(II)所示的化合物WY209或WY210，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

进一步地，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

由此表明化合物WY209和WY210有制备抗CVB3感染的特异治疗药物的潜力，具有临床应用前景。

本发明的两种新型含氮杂环酯类化合物WY209和WY210的制备，参照文献Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具体以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终酯化产物。

本发明具有以下优点：

1、这些化合物合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

2、从结构相似的化合物中寻找抗CVB3药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步制备药物开发提供有价值的导向作用。

附图说明

图1是化合物WY209和WY210对于CVB3作用的Hep-2细胞存活率的影响。

图2是WY209和WY210对于CVB3引起的Hep-2细胞CPE的抑制效应。

图3是WY209和WY210对于CVB3引起的Hep-2细胞凋亡的抑制作用。

图4是WY210对于CVB3子代病毒产量的抑制作用。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

【实施例1】对WY209和WY210抗CVB3活性进行评估

1、试验方法：

1.1化合物对于宿主Hep-2细胞的毒性

将Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₂值/细胞对照组平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2化合物对于CVB3的抑制活性

将Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的CVB3病毒液感染细胞1h，加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对CVB3的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式计算药物对CVB3的抑制率。用SPSS 11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3药物的治疗指数(SI)

SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

2、试验结果

表1含氮杂环酯类化合物WY209和WY210细胞毒性及抗CVB3活性

化合物细胞毒性及抗CVB3活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物对于CVB3作用的Hep-2细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到WY209和WY210对于CVB3有强的抑制活性，相当于阳性对照化合物利巴韦林。其中WY210有更好的抑制效果，WY209抗CVB3活性有所下降，但毒性也明显降低，因此两种化合物有相似的治疗指数。化合物WY209和WY210抑制CVB3引起的Hep-2细胞CPE效应如图2所示。CVB3感染的Hep-2细胞变圆，从细胞板壁脱离，WY209和WY210(40μg/mL)处理对于其病变效应有强的抑制作用，分别达到77％和90％的抑制率。

【实施例2】WY209和WY210对于CVB3引起的Hep-2细胞凋亡的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的Hep-2细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50CVB3感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY209和WY210的细胞维持液。大约48h后，收集细胞，运用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。

2、试验结果

实验结果如图3所示，40μg/mL WY209和WY210可以有效抑制CVB3导致的细胞凋亡。在病毒对照组细胞凋亡率为81.02％，正常未处理细胞凋亡率2.26％的情况下，40μg/mL WY209和WY210处理的细胞凋亡率分别有10.33％和12％。可见WY209和WY210可以有效保护CVB3导致的细胞凋亡。

【实施例3】WY210对于CVB3子代病毒产量的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的Hep-2细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID₅₀CVB3感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含40μg/mL WY210的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID₅₀方法测定CVB3病毒滴度。

2、试验结果

如图4所示，40μg/mL WY210处理的Hep-2细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了化合物对于CVB3子代病毒产量强烈的抑制作用。

综上所述，具有新型结构的酯类化合物WY209和WY210具有较强的抑制CVB3活性，其中WY210具有更佳的抑制效果，强烈抑制CVB3病毒在细胞内的复制增殖。有潜力制备一种临床上有效对抗CVB3感染的药物。