本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种喜树碱磷酸酯类化合物、其制备方法及应用。
背景技术：
喜树碱是Wall等于1966年首先从中国特有的珙桐科植物喜树(camptotheca acuminata)中分离得到的一种具有显著细胞毒活性的喹啉类生物碱(J.Nat.Prod.2004,67,129-135)，对骨癌、肝癌、膀胱癌和白血病等多种恶性肿瘤表现出较好的抑制作用，但在临床使用时发现，喜树碱在发挥其抗肿瘤活性时会产生骨髓抑制、呕吐和腹泻等较严重的副作用，同时因其分子结构中喹啉环上氮的特殊碱性而水溶性较差，不能直接人体非肠道给药。为进一步改善其水溶性和降低其毒副作用，20世纪70年代初期对喜树碱的水溶性钠盐进行了Ⅰ期临床试验，虽然观察到了一定的抗癌活性和大大提高了该类药物的水溶性，却因其严重而且不可预见的毒副作用使得进一步临床试验中断。近年来，国内外研究者对喜树碱类药物进行了系统深入的研究，其中以其为先导衍生合成的多个活性化合物如伊立替康、拓扑替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、DX-8951f、GG-211、BNP-1350、ST-1481和CKD-602等已被FDA批准上市或处于临床研究阶段(①Bioorg.Med.Chem.2004,12,1585–1604；②Phytochem.2004,65,2735–2749)。但由于喜树碱类衍生物结构中具有抗肿瘤活性的内酯环(E环)在人体内生理条件下容易水解开环，造成抗肿瘤活性降低。且实验证明，在血浆中内酯环形式与开环形式存在平衡，内酯环形式的浓度和药物疗效存在正比关系。而开环形式是导致不良反应的原因所在，如引起骨髓抑制、呕吐、腹泻和血尿等((1)药学学报.2003,38,715–720；(2)J.Org.Chem.,2000,65,4601-4606。)。因此对E环-20位的结构修饰和改造，提高内酯环形式在人血浆中的比例以期提高该类化合物的活性并减小毒性，成为目前研发喜树碱类药物的主要研究课题之一。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种喜树碱磷酸酯类化合物、其制备方法及应用，其目的在于通过以喜树碱构效关系研究为指导，将喜树碱20位羟基进行修饰形成酯键，提高内酯环的稳定性，由此解决现有喜树碱衍生物作为抗肿瘤药物的活性低、毒副作用大的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种喜树碱磷酸酯类化合物，其具有式(I)的结构：
其中，R1和R2各自独立地为直链烷基、支链烷基、芳基或杂芳基，n为1或3。
优选地，所述R1和R2各自独立地为C1-C12的烷基。
优选地，所述R1和R2各自独立地为C1-C7的烷基。
优选地，所述R1为2-丙基、异丁基、苄基或2-甲基丙基；所述R2为甲基、乙基或苯基。
按照本发明的另一个方面，提供了所述喜树碱磷酸酯类化合物的制备方法，所述喜树碱磷酸酯类化合物是由喜树碱氨基酸酯与甲醛和亚磷酸二乙酯反应得到。
优选地，所述制备方法按照如下步骤进行：以喜树碱氨基酸酯为原料，以四氢呋喃为溶剂，向反应体系加入三乙胺和无水三氯化铁混合均匀，然后向反应体系加入甲醛与亚磷酸二乙酯，所述喜树碱氨基酸酯与甲醛和亚磷酸二乙酯反应摩尔比为1:1.75:1.75，在60℃～100℃反应完全后，即可得到所述的喜树碱磷酸酯类化合物。
优选地，所述制备方法还包括分离步骤，所述分离步骤为柱层析分离。
优选地，所述柱层析采用的硅胶为200～300目的柱层析用硅胶。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的喜树碱磷酸酯类化合物的应用，应用于制备治疗癌症细胞的药物。
优选地，所述癌症细胞包括人肝癌细胞(Hep3B)、人肺腺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮样癌细胞(KB)或人口腔表皮样癌细胞耐药株(KBvin)肿瘤细胞。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明以喜树碱构效关系研究为指导，以不同氨基酸取代的喜树碱衍生物作为原料，将喜树碱20位羟基进行修饰形成酯键，制备得到了本发明所述的喜树碱磷酸酯类化合物，进一步阻止羟基和邻位酯羰基形成了分子内氢键，提高了内酯环的稳定性，从而提高了喜树碱的成药性、抗肿瘤活性并降低了其毒性。
(2)本发明利用氨基酸在体内被主动转运，可作为药动团连于药效团，以利于吸收和转运这一原理，同时运用“多样性合成”这一思想，将磷酸酯这一药物分子上常用的活性官能团与喜树碱氨基酸酯通过多组分反应的方式结合而合成了本发明所述的一类新型的喜树碱衍生物。
(3)经体外抗肿瘤活性筛选结果表明，本发明所述的喜树碱磷酸酯类化合物对人肺腺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、人口腔表皮样癌细胞(KB)和人口腔表皮样癌细胞耐药株(KBvin)表现出较强的抑制活性，且一些化合物高于目前临床药物拓扑替康，因此本发明的化合物可用于制备抗肿瘤的药物。
(4)本发明所述的喜树碱类化合物结构新颖、合成工艺简单、产品纯度高，对肿瘤细胞表现出较强的抑制作用，具有优良的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的喜树碱磷酸酯类化合物的通式结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明所述的喜树碱磷酸酯类化合物具有式(I)所示的化学结构：
其中，R1和R2各自独立地为直链烷基、支链烷基、芳基或杂芳基，n为1或3，R1和R2各自独立地优选为C1-C12的烷基，进一步优选为C1-C7的烷基。
更进一步地优选，R1为2-丙基、异丁基、苄基或2-甲基丙基；所述R2为甲基、乙基或苯基。
本发明所述的喜树碱磷酸酯类化合物制备方法按如下化学反应式进行：
本发明的喜树碱磷酸酯类化合物(式I化合物)制备方法是以喜树碱氨基酸酯为原料，适量的四氢呋喃作溶剂，滴加三乙胺，向反应体系加入催化剂量的无水三氯化铁，待搅拌10分钟后，向反应体系加入反应量的甲醛与亚磷酸二乙酯，60～100℃反应8个小时，薄层层析检测，柱层析(洗脱体系为氯仿:甲醇)分离，得到目标化合物。
本发明的喜树碱磷酸酯类化合物最佳制备方法是：将喜树碱氨基酸酯(2mmol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃(10mL)作溶剂，随后滴加三乙胺(2mmol)，向反应体系加入无水三氯化铁(0.3mmol)，待搅拌10分钟后，向反应体系加入甲醛(3.5mmol)和亚磷酸二乙酯(3.5mmol)，60摄氏度反应8个小时，薄层层析板检测反应完成后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸镁干燥后减压浓缩，柱层析分离(CHCl3:MeOH)纯化即得目标产物，其中柱层析采用的硅胶为200～300目的柱层析用硅胶。
本发明所用的原料喜树碱-20-O-L-氨基酯的制备方法参见文献方法(Bioorg.Med.Chem.,1998,6,551-562)。
按照本发明所述的喜树碱磷酸酯类化合物的制备方法，合成了如图1所示的通式的喜树碱磷酸酯类化合物。以下实施例给出了Ia-Ie一共5种喜树碱磷酸酯类化合物的制备合成方法，采用NMR测定了各化合物结构，并计算分析了其收率。
本发明所述的的喜树碱磷酸酯类化合物的应用，其特征在于，应用于制备治疗癌症细胞的药物，所述癌症细胞包括人肝癌细胞(Hep3B)、人肺腺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮样癌细胞(KB)或人口腔表皮样癌细胞耐药株(KBvin)肿瘤细胞。
以下为实施例：
实施例1：目标化合物Ia的合成
原料喜树碱20-O-L-甘氨酸酯的合成：取N-Boc-甘氨酸(3.13mmol)于圆底烧瓶中，加入干燥的二氯甲烷(200mL)使其溶解，随后在冰浴下依次加入喜树碱(3.13mmol)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC,3.13mmol)以及4-二甲氨基吡啶(DMAP,3.13mmol)。反应在室温下搅拌16小时。薄层层析检测反应完成后，抽滤除去固体杂质，随后用0.1N的盐酸洗涤有机相，干燥，减压浓缩后得到白色固体，柱层析(氯仿-甲醇)分离得到中间体喜树碱-20-O-(N’-叔丁氧羰基)-L-甘氨酸酯。取喜树碱-20-O-(N’-叔丁氧羰基)-L-甘氨酸酯(2mmol)于圆底烧瓶中，加入CH2Cl2(2mL)和TFA(2mL)，室温搅拌2小时后减压除去溶剂，用甲醇重结晶得到最终的喜树碱-20-O-L-甘氨酸酯的三氟乙酸盐。合成方法参见文献方法(Bioorg.Med.Chem.,1998,6,551-562)。
其反应式为：
Ia的合成：取喜树碱缬氨酸酯(2mmol)于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃(10mL)作溶剂，随后滴加三乙胺(2mmol)，之后向反应体系加入无水三氯化铁(0.3mmol)，待搅拌10分钟后，向反应体系加入甲醛(3.5mmol)和的亚磷酸二乙酯(3.5mmol)，60摄氏度反应8个小时，薄层层析板检测反应进度，待反应完成后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸镁干燥后减压浓缩，柱层析分离(CHCl3-MeOH)纯化即得目标产物。
其反应式如下：
反应所得产物检测数据如下：产率：64％；熔点:275-276℃；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.83(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.66(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.32(s,1H,C14-H),5.70(m,1H,C17-H),5.41(m,1H,C17-H),5.31(s,2H,C5-H),4.04-4.15(m,4H,OCH2CH3-H),3.50-3.62(m,2H,NCH2P),3.18-3.22(m,1H,缬氨酸-H),2.80-3.95(m,1H,缬氨酸-H),2.15-2.32(m,2H,C18-H),1.21-1.62(m,12H,缬氨酸-H,OCH2CH3-H)0.97(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:598.2[M+H]+，证实为Ia化合物。
实施例2：目标化合物Ib的合成
与实施例1同，仅以亮氨酸代替缬氨酸。反应所得产物检测数据如下：产率：66％；熔点:261-263℃；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.31(s,2H,C5-H),4.02-4.26(m,5H,OCH2CH3-H,亮氨酸-H),3.41-3.63(m,2H,NCH2P),3.11-3.19(m,3H,亮氨酸-H),2.13-2.34(m,2H,C18-H),1.07-1.60(m,12H,OCH2CH3-H,亮氨酸-H),0.87(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:634.2[M+Na]+，证实为Ib化合物。
实施例3：目标化合物Ic的合成
与实施例1同，仅以异亮氨酸代替缬氨酸。反应所得产物检测数据如下：产率：54％；熔点:265-266℃；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.71(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.04-4.23(m,5H,OCH2CH3-H,异亮氨酸-H),3.51-3.65(m,2H,NCH2P),3.02-3.19(m,1H,异亮氨酸-H),2.13-2.34(m,2H,C18-H),1.07-1.60(m,14H,OCH2CH3-H,异亮氨酸-H),0.86(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:634.1[M+Na]+，证实为Ic化合物。
实施例4：目标化合物Id的合成
与实施例1同，仅以苯丙氨酸代替缬氨酸。反应所得产物检测数据如下：产率：36％；熔点:268-270℃；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.21-7.36(m,4H,Ph-H,C14-H),7.00-7.03(m,2H,Ph-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.44(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.17-4.21(m,1H,苯丙氨酸-H),3.86-4.08(m,4H,OCH2CH3-H),2.89-3.26(m,4H,NCH2P,苯丙氨酸-H),2.13-2.29(m,2H,C18-H),1.21-1.28(m,6H,OCH2CH3-H)0.87(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:668.3[M+Na]+，证实为Id为化合物。
实施例5：目标化合物Ie的合成
与实施例1同，仅以β-丁氨酸代替缬氨酸。反应所得产物检测数据如下：产率：43％；熔点:272-276℃；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H，J＝4Hz),7.66(t,1H,C11-H，J＝4Hz),7.28(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.29(s,2H,C5-H),4.08-4.14(m,4H,OCH2CH3),3.13-3.15(m,2H,NCH2P),2.55-2.63(m,2H,丁氨酸-H),2.25-2.29(m,2H,丁氨酸-H),2.16-2.17(m,2H,C18-H),1.83-1.86(m,2H,丁氨酸-H),1.21-1.33(m,12H,OCH2CH3),0.97(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:606.2[M+Na]+，证实为Ie化合物。
实施例6
化合物Ia-Ie的抗肿瘤活性的实验方法及结果
本发明的药理实验采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法。肿瘤细胞培养选用10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640或DMEM培养基，将肿瘤细胞接种于96孔板，每个孔培养3-5×103个细胞，加入不同浓度的待测试目标化合物溶液。培养72小时后，每孔加入预冷的三氯乙酸溶液(50％，w/v)固定细胞，冰箱中固定30分钟。待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.04％(w/v)的SRB染液(1％的乙酸配制，购自Sigma Chemical公司)，染色30min后倒掉染液，用乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。用100μL非缓冲Tris-base碱液溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用ELx800吸收光酶标仪(美国Bio-TeK公司生产，操作软件Gen5)测定515nm处光吸收值。所有试验设3个平行组或重复3次。化合物Ia-Ie的细胞毒活性试验结果见表1
表1 化合物Ia-Ie的细胞毒活性试验结果：IC50(μM)
注：⑴筛选方法：磺酰罗丹明B比色法；⑵作用时间：72小时；(3)化合物编号Ia-Ie分别为前述实施例1至实施例5所得产物。
对六种肿瘤细胞体外细胞毒活性测试结果显示，本发明所合成的化合物均表现出良好的毒杀人肝癌细胞(Hep3B)、人肺腺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮样癌细胞(KB)和人口腔表皮样癌细胞耐药株(KBvin)肿瘤细胞的活性，几乎所有的化合物表现出高于喜树碱临床药物伊立替康(CPT-11)的体外细胞毒活性，而在Hep3B和MCF-7细胞中所有化合物均表现出良好的抗肿瘤活性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。