齐墩果酸类衍生物的应用的制作方法

本发明属于齐墩果酸类衍生物
技术领域：
，具体涉及齐墩果酸类衍生物制备色氨酸羟化酶-1抑制剂的应用。
背景技术：
：质疏松症被称为无声无息的流行病，是以骨组织显微结构受损、骨矿成分和骨基质等比例的不断减少、骨质变薄、骨小梁数减少、骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍疾病，被形象地称为沉默的杀手。据统计大约30–50％的女性和15–30％的男性生涯患有骨质疏松，由于绝经原因，临床80％的病人为女性。在我国，骨质疏松症的严重性仅次于心血管疾病，全国性大规模流行病学调查显示，国内骨质疏松症总患病率为12.4％，老年人患病比例超过一半以上，其中骨折发生率接近33％。预计到2020年，我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2.8亿，这不但给社会带来巨大的压力，造成沉重的经济负担，客观上也反映了骨质疏松防治的重要性。骨质疏松药物功能主要是抑制骨吸收(抑制破骨细胞功能)和增加骨形成(增强成骨细胞功能)。目前国外临床主要使用的有双膦酸盐、甲状旁腺素、选择性雌激素受体调节剂和活性维生素D及其同系物，中国市场也相同。双膦酸盐为临床一线用药，为骨吸收抑制剂，但长期应用可过度抑制骨形成，影响骨强度。遗憾的是目前具有促进骨形成作用的临床药物只有一个，甲状旁腺素(PTH1–34)。5-羟基色氨(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一种古老的神经传导分子，在很多组织中发挥很大的作用，调节中枢神经和外周循环的一些功能。色氨酸羟化酶(Tryptophanhydroxylase，Tph)是合成5-羟基色氨初始酶。研究表明肠源性血清素(Gut-derivedserotonin,GDS)进入血液循环后，可以通过抑制成骨细胞的分化与增殖减少骨形成。因此，抑制肠源性血清素的合成可能有利于提高骨形成的速度。由于色氨酸羟化酶-1(Tph-1)是肠源性血清素合成的限速酶(将色氨酸转化为5-羟基色氨酸，即GDS的前体)，因此开发Tph-1抑制剂调节血清素的合成可以作为骨质疏松症的一种崭新的治疗策略，Tph-1可以作为抗骨质疏松药物研发的靶标。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种齐墩果酸类衍生物的应用，通过抑制Tph-1达到增加骨形成的功能用途。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：齐墩果酸类衍生物在制备色氨酸羟化酶-1抑制剂中的应用。齐墩果酸类衍生物在制备用于增加骨形成的药物中的应用；所述的增加骨形成的药物通过抑制色氨酸羟化酶-1达到增加骨形成。齐墩果酸类衍生物在制备用于通过增加骨形成的抗骨质疏松药物中的应用；所述的增加骨形成的药物通过抑制色氨酸羟化酶-1达到增加骨形成。上述齐墩果酸类衍生物，结构通式为：R1选自下列基团：HNCH2COOCH3等氨基酸，等；Het选自下列基团：其中，R2选自基团：-CH3，R3、R4、R5和R6均选自基团：H，I，Br，OH，CH2CH2CH2OH，NO2，NH2等；R7和R8均选自和等；R9和R10均选自和等。上述齐墩果酸类衍生物的具体结构包括：有益效果：与现有技术相比，本发明的齐墩果酸类衍生物，具有很好的抑制色氨酸羟化酶-1效果，在制备色氨酸羟化酶-1抑制剂中将具有广泛的应用。同时，该齐墩果酸类衍生物通过抑制色氨酸羟化酶-1达到增加骨形成，在制备用于增加骨形成的药物以及通过增加骨形成的抗骨质疏松药物中都将具有广泛应用。附图说明图1是化合物6g对大鼠血清中5-HT的含量影响结果图；图2是化合物6g对大鼠左腿松质骨骨密度的影响结果图；图3和图4是化合物6g对大鼠血清骨相关标记物的影响结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中，所使用的齐墩果酸类衍生物与CN103936815A中公开的齐墩果酸类衍生物相同，其制备方法等信息与该专利文献公开的相同。实施例11)体外抑制5-HT合成实验肠源性血清素主要是由TPH-1催化合成，因此肠源性血清素产量的多少是TPH-1活性的一个标志。本实施例利用RBL2H3细胞(TPH-1的表达细胞)来检测合成的齐墩果酸衍生物抑制肠源性血清素合成的能力。实验所用细胞为色氨酸羟化酶-1的表达细胞大鼠RBL2H3，购自中科院细胞库。首先将购进的大鼠RBL2H3在37℃复苏，于37℃下用含有10％胎牛血清的α-MEM培养基(含有10％FBS，100U/mL盘尼西林，100μg/mL链霉素)培养于细胞培养箱(5％CO2/95％空气)。如无其他说明，所用实验都在此条件下进行。体外活性实验分为两个组：对照组和给药组，每组设置三个复孔，对照组用0.1％DMSO作为对照。将细胞种于24孔板，细胞密度：5×104个/孔。待细胞完全贴壁后给药或者培养基，药物最终浓度为10μM。连续作用48小时后去除培养基，每孔用200μL强裂解液RIPA裂解，吹打4-5次，用流动相(乙腈：NaH2PO4水溶液＝20：80，V/V)稀释，12000r/min离心十分钟后取上清，直接用高效液相(岛津，LC-20AT)色谱仪检测5-HT的含量，检测器采用RF-20A荧光检测器，激发波长和发射波长分别定为：280nm和330nm；分析柱采用Waters色谱柱(50mm×4.6mm，5μm，C18)；流速设为0.4mL/min；采样时间10min。5-HT标准品购自上海有机所。首先用5-HT标准品确定样品中5-HT的保留时间，然后用积分所得面积比计算药物对5-HT生物合成的抑制率。抑制率数值越大，说明药物对5-HT生物合成抑制作用越强。结果如表1所示，表明化合物在体外对5-HT的合成具有明显的抑制作用。表1：齐墩果酸衍生物对5-HT的抑制活性(10μM)化合物抑制率(％)化合物抑制率(％)Control0.0±4.35g73.6±7.8**230.1±1.5*5h76.0±6.8**2a67.7±3.5**5i78.2±7.6*2b45.3±9.4**5j33.6±5.8*2c85.1±2.2**6a11.0±1.4**2d81.6±0.3**6b18.2±2.0*3a76.0±10.8**6c23.3±6.9*3b10.0±6.96d39.2±8.6**4a22.6±6.2*6e83.6±3.3**4b68.1±4.5**6f10.2±6.74c65.2±3.1**6g90.0±6.3**4d50.1±1.4**6h89.2±7.1**4e31.2±2.3*6i53.6±8.2**4f36.4±2.9*6j70.9±3.6**5a76.4±3.9**739.1±1.2*5b10.9±9.87a35.4±0.2*5c86.4±5.9**7b23.2±7.1*5d26.8±5.9*7c77.3±8.3**5e32.3±2.0*7d17.6±6.1*5f87.2±2.6**a抑制率＝100％–(给药组5-HT峰面积/对照组5-HT峰面积×100％)。数据表示为平均值±SD；*p<0.05，**p<0.01。2)体内抑制5-HT合成实验体内实验分为两组，体内用药分别为6g，每组实验流程如下：12周大的雌鼠，购进后分为6组：给药组(低、中、高三个剂量组)，空白组，阳性药对照组，假手术组，每组8只。禁食24h后摘除卵巢造模，手术三天后给药。给药剂量分别为：0.1mg/kg.d，1mg/kg.d，10mg/kg.d。阳性对照组采用腹腔注射PTH(20μg/kg.d)。连续灌胃给药8周后颈动脉取全血，静置于37℃水浴30min得到血清，将血清用5％高氯酸酸化，用流动相稀释后12000r/min离心十分钟后取上清，直接用高效液相(岛津，LC-20AT)色谱仪检测5-HT的含量，检测器采用RF-20A荧光检测器，激发波长和发射波长分别定为：280nm和330nm；分析柱采用Waters色谱柱(50mm×4.6mm，5μm，C18)；流速设为0.4mL/min；采样时间10min。如图1所示，化合物6g可以显著降低5-HT在血清中的含量。3)对密度和骨代谢标记物的影响用pQCTsystemXCTResearchM(StartedMedizintechnikGmbH,Germany)扫描左腿。扫描最小分辨率为0.08mm，片层厚度为0.5mm。工作站在Peelmode20模式下通过自动扫描全骨并根据阈值将自动全骨(totalbone)分成皮质骨(corticalbone)和松质骨(cancellousbone)。每轮扫描工作站分别扫描股骨上距离股骨胫骨分离点1-5mm的4个横断面，每个断面厚1mm。根据每个面的横切图组数据计算松质骨(cancellousbone)。数据处理使用的软件为XCTResearchSeriesManualSoftwareVersion5.4。血清中骨形成标志物(N-MID-OT)及骨吸收标志物(CTX-1)，的测定按试剂盒手册进行。大鼠脊椎骨骨密度用μCT(eXploreL℃usSPscanner，GEHealthCare)测试，结果如图2，3，4所示，其中，图2为化合物6g对大鼠左腿松质骨骨密度的影响。图3、4为6g对大鼠血清中血清中骨形成标志物(N-MID-OT)及骨吸收标志物(CTX-1)的影响。上述数据清楚地说明，化合物说明化合物6g通过抑制Tph-1，增加骨形成，达到有效的防止骨质疏松大鼠骨量减少的作用。当前第1页1 2 3