一种腺病毒高免卵黄抗体注射液及其制备方法与流程

本发明属于禽类用生物制品技术领域，具体涉及一种腺病毒高免卵黄抗体注射液及其制备方法。

背景技术：

禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为3个群，且根据血清中和反应Ⅰ群禽腺病毒包含12个血清型，4型禽腺病毒主要感染3-5周龄鸡子，临床和病理症状为心包积液综合征、包涵体肝炎、肾炎等，致死率30-70％。由于腺病毒4型首次爆发于1987年的巴基斯坦，随至传播至印度、日本、墨西哥、智利、中国等一些国家，给养殖业带来大量损失。大量研究者发现不同的毒株在饲养条件下是同等感染，自然条件或口服接种后病程是7-15天。禽腺病毒是接触性传染性疾病，既可以水平传播，也可以垂直传播。

心包积液综合征最初认为是由霉菌毒素、脂肪中毒、多氯联苯、氯化钠、藻毒素等引起的中毒或者营养不良导致的，然而根据这些原因治疗之后均不能起到有效的治疗。随后研究发现心包积液综合征是由一个病毒引起的，电子显微镜观察到病毒呈六边形。后来，人们开始通过鸡胚原代肝细胞、鸡胚原代肾细胞、鸡胚等途径对病毒开始进行纯化增殖，发现感染3-4天后其可视细胞变圆、肿胀、脱落，感染的鸡胚会生长受阻、出血点、100％死亡。近年来，心包积液和包涵体肝炎在全世界爆发率增加，给养殖业带来大量损失。

目前，大量学者尝试各种方法来预防腺病毒带来的危害，最开始是用发病鸡的组织来免疫鸡子，但是这种方法可能导致病毒的传播，后来学者发明了腺病毒灭活苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗。卵黄抗体IgY是一种免疫球蛋白Ig，功能上类似于哺乳动物的IgG，但是结构上有所差异，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。卵黄抗体具有很多优点：1)卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体反应，且不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合；2)卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项实验表明IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响；3)卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。且卵黄抗体对动物没有毒副作用。目前卵黄抗体的制备及生产工艺已经成熟，可以保质保量的生产。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种腺病毒高免卵黄抗体注射液及其制备方法。

其技术方案为：

一种腺病毒高免卵黄抗体注射液，鸡卵黄中含有水分48％，蛋白质17.8％和脂肪30.5％，其他3.7％，卵黄蛋白包括水溶性蛋白(α-卵黄球蛋白、β-卵黄球蛋白、γ-卵黄球蛋白，其中γ-卵黄球蛋白即是IgY)和各种脂蛋白。本研究制备卵黄抗体的过程采用了粗提卵黄免疫球蛋白的措施，其主要目的是除去卵黄中的非水溶性成分。经过PEG处理，该高免卵黄注射液的主要包含水分、蛋白质，蛋白质成分占据约30％，水分70％。

一种腺病毒高免卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、分离毒株制备疫苗：样品经过研磨，冻融3次，12000g/min告诉离心8min，吸取上清液，将上清液接种到鸡胚尿囊腔，经过3代的传递，根据鸡胚的病变和PCR检测情况，验证得到弱毒株XH03；

步骤2、免疫健康鸡群制得蛋：采用自备的鸡腺病毒灭活苗对健康21只进行免疫，免疫两次，间隔两周，一周后开始收集蛋，清理、消毒、晾干备用；

步骤3、将收集好的鸡蛋表面污物洗干净，在0.4％的新洁尔灭溶液中浸泡15min；取出后用消毒纱布擦干，从小头打破蛋壳后倒尽蛋清；用不带针头的1ml无菌注射器插入蛋黄中，吸取500ul放入高压灭菌过的2ml离心管内，加入1ml PBS缓冲液，即卵黄：PBS以1:2的比例稀释；在卵黄液中加入青、链霉素各1000单位/ml；按0.01％加入硫柳汞，以防止微生物污染；在漩涡混匀器上充分混合均匀，并用封口膜封口，放置4℃备用；

步骤4、高免卵黄抗体的提取

1)用PBS稀释卵黄液，体积比为2:1，用PEG-6000配成3.5％的PEG溶液，混合均匀，静置20min，4℃，14000rpm离心10min；

2)弃去上清液和脂肪层。添加PEG-6000，配成12％的PEG溶液，混合均匀，静置20min。4℃，14000rpm离心10min。

3)弃去上清液，用PBS稀释沉淀至原卵黄液体积。然后添加PEG-6000，配成12％(w/v)的PEG溶液，混合均匀，静置20min。4℃，14000rpm离心10min。

4)弃去上清液，PEG用抽气法移走，然后用PBS溶解沉淀至体积为原卵黄溶液的二分之一。

注射液剂型主要包含注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)，尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(PEG)等。该腺病毒高免卵黄注射液是以PBS溶媒的，所以注射液的剂型为水针剂。

本发明的有益效果：

本发明先通过制备出免疫性强的毒株制成疫苗，并制备高免蛋，经过消毒、收集卵黄、处理得到腺病毒4型高免卵黄抗体。采用本发明的方法制备的鸡腺病毒4型高免卵黄抗体不仅可以对腺病毒病进行有效的治疗，而且在临床上减少了操作强度、降低饲养成本，本发明的鸡腺病毒高免卵黄抗体便于运输和储藏，而且保存时间长，能保持较高的抗体效价。

附图说明

图1是获得高免卵黄液的流程图；

图2是获得高免卵黄注射液的流程图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。

一种腺病毒高免卵黄抗体注射液，鸡卵黄中含有水分48％，蛋白质17.8％和脂肪30.5％，其他3.7％，卵黄蛋白包括水溶性蛋白(α-卵黄球蛋白、β-卵黄球蛋白、γ-卵黄球蛋白，其中γ-卵黄球蛋白即是IgY)和各种脂蛋白。本研究制备卵黄抗体的过程采用了粗提卵黄免疫球蛋白的措施，其主要目的是除去卵黄中的非水溶性成分。经过PEG处理，该高免卵黄注射液的主要包含水分、蛋白质，其比例比原卵黄成分高近一倍。

如图1、图2所示，一种腺病毒高免卵黄抗体注射液的制备方法，包括：分离株制备疫苗，免疫健康鸡群制得蛋，将蛋经过消毒处理，提取卵黄、配制、分装得到腺病毒4型高免卵黄注射液。具体步骤如下：

1)分离毒株制备疫苗：本次病毒样品主要从湖北新洲发病鸡采集的肝脏、心脏等组织样品，样品经过研磨，冻融3次，12000g/min告诉离心8min，吸取上清液，将上清液接种到鸡胚尿囊腔，经过3代的传递，根据鸡胚的病变和PCR检测情况，验证得到弱毒株XH03，

2)免疫健康鸡群制得蛋：采用自备的鸡腺病毒灭活苗对健康21只进行免疫，免疫两次，间隔两周，一周后开始收集蛋，清理、消毒、晾干备用；

3)将收集好的鸡蛋表面污物洗干净，在0.4％的新洁尔灭溶液中浸泡15min；取出后用消毒纱布擦干，从小头打破蛋壳后倒尽蛋清；用不带针头的1ml无菌注射器插入蛋黄中，吸取500ul放入高压灭菌过的2ml离心管内，加入1ml PBS缓冲液，即卵黄：PBS以1:2的比例稀释；在卵黄液中加入青、链霉素各1000单位/ml；按0.01％加入硫柳汞(thimerosal)，以防止微生物污染；在漩涡混匀器上充分混合均匀，并用封口膜封口，放置4℃备用。

PEG可以是卵黄液脱脂的原因是因为他属于非离子型表面活性剂，可以破坏卵黄脂类水化膜，打破卵黄的乳化状态，卵黄脂类相互凝结而发生沉淀，从而实现脂水分离。然而当浓度过高时，也会破坏抗体蛋白的水化膜使之发生沉淀，从而影响抗体效价，所以微量浓度的表面活性剂有利于抗体蛋白的提取。

卵黄抗体的提取方法有多种，根据实验条件及检测方法，选择了三种方法：

a.有机溶剂提取方法

有机溶剂的提取方法主要根据氯仿.聚乙二醇-6000法(cH-PEG法)。具体步骤如下：

1)将卵黄液用配制好的PBS缓冲液稀释(卵黄液与PBS的体积比为1:2)。

2)用同体积的氯仿溶液与卵黄稀释液混合均匀，4℃，10000rpm离心30min。

3)倒尽水层，添加12％(w/v)的聚乙二醇-6000，搅拌，静置30min，然后4℃，10000rpm离心30min。

4)弃去上清液，沉淀用PBS溶解至体积为原卵黄溶液的二分之一。

b.PEG-6000提取法(Polson等1980)

1)用PBS稀释卵黄液，体积比为2:1，用PEG-6000配成3.5％(w/v)的PEG溶液，混合均匀，静置20min。4℃，14000rpm离心10min。

2)弃去上清液和脂肪层。添加PEG-6000，配成12％的PEG溶液，混合均匀，静置20min。4℃，14000rpm离心10min。

3)弃去上清液，用PBS稀释沉淀至原卵黄液体积。然后添加PEG-6000，配成12％(w/v)的PEG溶液，混合均匀，静置20min。4℃，14000rpm离心10min。

4)弃去上清液，PEG用抽气法移走，然后用PBS溶解沉淀至体积为原卵黄溶液的二分之一。

c.氯仿抽提法

卵黄原液加入灭菌的烧杯中,用PBS稀释2倍,再加入与卵黄原液生理盐水等体积的氯仿，充分振荡后，37℃水浴30分钟，其间搅拌2-3次，4000r/min，离心20分钟后，待测样品分三层，一层为所需的提取液、第二层是蛋黄，第三层是氯仿。用ELISA试剂盒检测提取的IgY的浓度。

表1

如表1所示，结果分析：三种方法第二种即用氯仿-PEG6000联合提取卵黄抗体最好；此外从三种方法看出早期试验蛋黄中抗体较高于后期。但是从检测数据上看三种方法检测处理氯仿-PEG6000联合提取，结果实验组高于对照组，其他两种方法未见差异。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。