可抑制CD8+T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂、抑制剂组合物及应用的制作方法

本发明属于生物技术与医学领域，涉及一种抑制剂及在防治白癜风疾病的应用，尤其涉及一种可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂、抑制剂组合物及在作为防治白癜风药物上的应用。

背景技术：

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，我国人群患病率约为0.1％-2％。白癜风以黑素细胞破坏导致的皮肤白斑为特征，发病机制尚不明确，给治疗带来极大困难。以往的研究认为，白癜风的发生与遗传、氧化应激、内分泌异常等多种因素相关。现有的治疗手段如激素、钙调磷酸酶抑制剂、抗氧化剂、中成药、光疗等疗效均有限，难以获得令病人满意的治疗结果。因此，探究白癜风新的治疗靶点并开发针对性药物是亟待解决的医学难题。

细胞免疫参与白癜风发病机制的重要线索之一是观察到T淋巴细胞渗透到活动期白癜风皮损区黑色素细胞区域边缘。

白癜风患者血液和皮肤中都可以检测到大量自体免疫的、黑素细胞特异的CD₈⁺T细胞。2004年发表在J Invest Dermatol Symp Proc的文章报道白癜风病灶周围的浸润细胞主要由CD₈⁺和CD₄⁺T细胞构成，通常会出现CD₈⁺/CD₄⁺比例增加。近年研究表明，CD₈⁺所参与的免疫应答在黑素细胞破坏中发挥重要的杀伤效应。自身免疫紊乱导致的CD₈⁺T细胞活化并迁移至皮肤杀伤黑素细胞是导致白斑出现的直接原因。这些特异性CD₈⁺T细胞可在体外通过分泌穿孔素、颗粒酶及Fas/FaL途经杀伤黑素细胞，并可在体内诱导小鼠出现白癜风样改变。

趋化因子作为重要的细胞因子之一，在介导细胞间相互作用以及调节体内免疫平衡起着至关重要的作用。白癜风患者皮肤角质形成细胞在各种因素诱导下(如ROS、IFN-γ)产生趋化因子CXCL10和CXCL16是CD8⁺T细胞趋化至皮损的关键环节。CXCL10属于非ELR CXC趋化因子，又称干扰素诱导蛋白(IP10)，是指在外源性(LPS等)和内源性炎性因子(IL-1、IFN-α、IFN-γ等)刺激下，由成树突状细胞、角质形成细胞等多种细胞分泌表达的细胞因子。2014年Mehdi Rashighi等人发表在Science Translational Medicine的研究发现白癜风患者血清和皮肤中均发现CXCL10表达水平较高，抗原特异性T细胞上CXCR3表达也相应上调。深入研究CXCL10的功能，研究者们通过白癜风模型小鼠来研究CXCL10的功能以及已CXCL10与CXCR3之间的相关性，发现含CXCR3缺陷T细胞表型的小鼠与CXCL10缺乏的小鼠或使用CXCL10中和抗体的小鼠相比，皮肤上白斑出现数量明显减少。此外，在已经形成白斑症状的小鼠中继续使用CXCL10中和抗体后小鼠出现色素再生的现象。

CXCL16在正常组织可表达于抗原递呈细胞、巨噬细胞、淋巴结上皮细胞、人上皮角质细胞等。CXCL16通过CXC型趋化因子受体6(CXCR6)参与炎性细胞向病变组织的趋化。CXCL16/CXCR 6与人类一系列炎症性疾病有关。2007年Mikiko Tohyama等人发表在International Immunology上的一项研究者发现CXCL16通过诱导活化T细胞和NKT细胞表面CXCR6表达来介导表皮角质细胞然免疫。而李春英教授团队2016年发表在J Allergy Clin Immunol.(IF.12.485)上的文章认为角质形成细胞在氧化应激条件下可激活NF-κB信号途径诱导CXCL16表达及分泌，招募CD8⁺T细胞向黑素细胞迁移并杀伤黑素细胞。该研究首次提出了CXCL16-CXCR6是介导白癜风氧化应激微环境下CD8⁺T细胞向皮肤迁移的关键信号，并提出了针对CXCL16轴抗氧化及调控免疫的白癜风靶向治疗新策略。

未来，抑制白癜风角质形成细胞中CXCL10和CXCL16的表达及其功能可能成为白癜风治疗的重要策略。但是目前尚未有靶向抑制CXCL10和CXCL16的药物出现。

雷公藤是一种常用的抗炎、免疫抑制类中药，临床常用于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病的治疗，但在白癜风治疗中的应用尚未见广泛报道。既往研究表明，雷公藤可抑制多种免疫细胞中MCP-1、CCL5等趋化因子的表达，与其免疫抑制作用有关。而雷公藤中化学成分结构多样，构效关系也尚不明确。有研究发现其代表性单体化合物雷公藤甲素可上调细胞内的细胞因子信号抑制分子SOCS1的表达，从而下调STAT1信号通路的活性；而STAT1及其下游的转录因子IRF-1已被证实可由IFN-γ激活，发挥转录促进CXCL10表达的作用。

根据以上分析，提出如下假说：雷公藤有效成分抑制白癜风角质形成细胞内STAT1/IRF-1及NF-κB信号通路的活化，下调CXCL10和CXCL16的产生与释放，进一步阻止CD₈⁺T细胞趋化至皮肤，从而保护黑素细胞免受免疫杀伤，发挥治疗白癜风的作用。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种系统研究雷公藤系列化合物抑制STAT1/IRF-1通路的激活进一步降低CXCL10和CXCL16的表达的具体分子机制，所得结果为白癜风免疫调节疗提供理论依据和关键靶点的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂、抑制剂组合物及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂，其特征在于：所述可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂能够抑制角质形成细胞内STAT1转录因子的表达水平，进而下调IRF1表达水平，抑制角质形成细胞中分泌CXCL10以及CXCL16，进一步减少CXCL10和CXCL16对CD8⁺T细胞的趋化作用，从而抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤；所述可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤萜类化合物。

上述可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤倍的半萜生物碱、雷公藤的二萜类化合物和/或雷公藤的三萜类化合物。

上述可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤倍的半萜生物碱、雷公藤的二萜类化合物和/或雷公藤的三萜类化合物的单体化合物。

上述单体化合物是雷公藤甲素、雷公藤红素和/或雷公藤内酯酮。

上述单体化合物的有效剂量不高于80nM，优选1-60nM；更优选5-10nM。

一种基于如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂所形成的抑制剂组合物，其特征在于：所述抑制剂组合物含有如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂作为活性成分。

上述抑制剂组合物还包括能够使权利要求1-5任一权利要求所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂稳定和/或能够增强所述可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂效果的辅料。

上述辅料是一种或多种在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

根据如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂咋制备用于预防和/或治疗白癜风的药物中的应用。

本发明的优点是：

本发明提供了一种可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂、抑制剂组合物及应用，该可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂能够抑制角质形成细胞内STAT1转录因子的表达水平，进而下调IRF1表达水平，抑制角质形成细胞中分泌CXCL10以及CXCL16，进一步减少CXCL10和CXCL16对CD8⁺T细胞的趋化作用，从而抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤；该可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤萜类化合物，尤其是雷公藤倍的半萜生物碱、雷公藤的二萜类化合物和/或雷公藤的三萜类化合物。雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素是雷公藤中代表性的二萜、三萜类化合物，是从雷公藤3种化学结构类型(倍半萜生物碱、二萜、三萜共7个单体)中筛选出来的3个具有显著抑制CXCL10和CXCL16的单体化合物；确定了雷公藤中有效成分的结构类型。在保证同样用量的情况下，可以提高疗效并降低雷公藤的毒副作用；本发明首次阐明了雷公藤用于抑制CXCL10和CXCL16分泌的分子机制，即有效单体通过抑制STAT1的表达，下调IRF1，从而抑制CXCL10和CXCL16分泌及其对CD8⁺T细胞的趋化作用，保护黑素细胞。本发明为白癜风的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。本发明以角质形成细胞CXCL10和CXCL16的表达为关键切入点，运用成熟的细胞模型进行雷公藤有效成分的筛选，进一步运用分子细胞生物学技术，在分子、细胞、动物以及白癜风人群水平，系统研究雷公藤系列化合物抑制STAT1/IRF-1通路的激活进一步降低CXCL10和CXCL16的表达的具体分子机制，所得结果为白癜风免疫调节疗提供理论依据和关键靶点。

附图说明

图1为通过CCK-8实验确定雷公藤甲素，雷公藤红素，雷公藤内酯酮在角质细胞中适宜剂量范围；

图2通过CCK-8实验确定雷公藤甲素，雷公藤红素，雷公藤内酯酮对氧化应激状态下黑素细胞(PIG1，PIG3V)的保护作用；

图3为通过WesternBlot实验考察雷公藤系列化合物对STAT1，p-STAT1，IRF1，NF-κB表达水平的影响；

图4为通过ELISA实验考察雷公藤系列化合物对炎症因子刺激后角质细胞分泌趋化因子CXCL10的影响；

图5为通过ELISA实验考察雷公藤系列化合物对炎症因子刺激后角质细胞分泌趋化因子CXCL16的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂，该抑制剂能够抑制角质形成细胞内STAT1转录因子的表达水平，进而下调IRF1表达水平，抑制角质形成细胞中分泌CXCL10以及CXCL16，进一步减少CXCL10和CXCL16对CD8⁺T细胞的趋化作用，从而抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤；可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤萜类化合物；该可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂是雷公藤倍的半萜生物碱、雷公藤的二萜类化合物和/或雷公藤的三萜类化合物，尤其是雷公藤倍的半萜生物碱、雷公藤的二萜类化合物和/或雷公藤的三萜类化合物的单体化合物，例如雷公藤甲素、雷公藤红素和/或雷公藤内酯酮。这些单体化合物的有效剂量不高于80nM，优选1-60nM；更优选5-10nM。

同时，本发明在提供可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂的同时，还提供了一种基于如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂所形成的抑制剂组合物，该抑制剂组合物含有如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂作为活性成分，以及能够使可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂稳定和/或能够增强可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂效果的辅料；辅料是一种或多种在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

另外，本发明还提供了如前所述的可抑制CD8⁺T细胞对黑素细胞杀伤的抑制剂咋制备用于预防和/或治疗白癜风的药物中的应用。

本发明所提供的雷公藤中3种有效单体成分抑制CXCL10和CXCL16分泌分子机制，及其在白癜风治疗方面的应用，其中，雷公藤甲素(Triptolide)、雷公藤红素(Celastrol)和雷公藤内酯酮(Triptonide)可抑制角质形成细胞内STAT1的转录因子表达，下调IRF1水平，减少趋化因子CXCL10和CXCL16的分泌，发挥治疗白癜风的作用。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明在实施例中所采用的测试样品：(1)雷公藤定碱(LGT-1)，(2)雷公藤次碱(LGT-2)，(3)雷公藤晋碱(LGT-3)，(4)雷公藤甲素(LGT-4)，(5)雷公藤酯甲(LGT-5)，(6)雷公藤红素(LGT-6)，(7)雷公藤内酯酮(LGT-7)，(8)雷公藤甲素+雷公藤红素+雷公藤内酯酮(LGT-8)。样品配制：DMSO为溶剂，配制化合物初始浓度为1.0×10^-2M/L；每个化合物设三个工作液浓度，分别为10^-3、10^-4以及10^-5M/L。

实施例1

通过CCK-8实验确定雷公藤甲素，雷公藤红素，雷公藤内酯酮在角质细胞中适宜剂量范围，其结果参见图1所示。细胞培养：6000个/孔的细胞密度为种于96孔板；37℃，5％CO₂条件下于恒温培养箱中培养24h后吸去培养基，然后每孔加入各供试样品0.2uL(每孔终浓度DMSO 0.1％)，每个浓度的供试样品需5个复孔，再加入200uL新鲜培养基继续培养24h。然后吸去培养基，加入CCK-8试剂(1：10稀释于培养基中)100uL，37℃避光温孵1h后，酶标仪测定OD₄₅₀吸光值。

从图1可以看出，雷公藤甲素(LGT-4)、雷公藤红素(LGT-6)和雷公藤内酯酮(LGT-7)在低剂量范围内(5-10nM)对黑素细胞PIG1和PIG3V的增殖是没有影响的，三种单体联合用药后效果也更为显著。其他化合物雷公藤定碱(LGT-1)、雷公藤次碱(LGT-2)、雷公藤晋碱(LGT-3)、雷公藤酯甲(LGT-5)在1uM浓度水平对细胞生长没有显著影响。

实施例2

通过CCK-8实验确定雷公藤甲素，雷公藤红素，雷公藤内酯酮对黑素细胞系(PIG1，PIG3V)在氧化应激模型下的保护作用，结果请参见图2。细胞培养：6000个/孔的细胞密度为种于96孔板；37℃，5％CO₂条件下于恒温培养箱中培养24h后吸去培养基，然后每孔加入各供试样品0.2uL(每孔终浓度DMSO 0.1％)，每个浓度的供试样品需5个复孔，再加入200uL新鲜培养基继续培养2h后再加入H₂O₂使其终浓度达到800uM，继续培养24h。然后吸去培养基，加入CCK-8试剂(1：10稀释于培养基中)100uL，37℃避光温孵1h后，酶标仪测定OD₄₅₀吸光值。

从图2可以看出，雷公藤甲素(LGT-4)、雷公藤红素(LGT-6)和雷公藤内酯酮(LGT-7)对黑素细胞保护的有效浓度范围在5nM～10nM。

实施例3

雷公藤系列化合物与IFN-γ+TNF-α共同作用于角质形成细胞24h后，收集细胞提取蛋白，Western Blot分析雷公藤系列化合物对角质形成细胞中STAT1，pSTAT1、IRF1蛋白表达水平的影响，其结果请参见图3。收取细胞蛋白，先经SDS电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，用5％BSA室温封闭1h，敷上所需检测的蛋白相对应的一抗(其中Anti-pSTAT1，Anti-STAT1，Anti-IRF1，Anti-SOCS3，Anti-β-Actin均购于CST公司)，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，膜用TBST清洗3次，每次10min，后敷上二抗(Goat anti-rabbit IgG-HRPGoat anti-mouse IgG-HRP购于SANTA公司)，室温孵育1h。后用TBST清洗3次，每次10min。之后均匀涂上发光液，于凝胶成像系统上观察。

结果如图3所示，IFN-γ联合TNF-α可显著上调细胞p-STAT1与IRF1的蛋白表达水平。与DMSO组相比，雷公藤系列化合物p-STAT1和STAT1水平均有所下调，尤其以LGT-4，LGT-7以及LGT-8下调效果最为明显。同时这三个化合物对IRF1蛋白表达水平也有显著的下调。

实施例4

通过ELISA实验考察雷公藤系列化合物对IFN-γ及联合TNF-α刺激角质细胞后分泌趋化因子CXCL10，CXCL16的影响，其结果请参见图4以及图5。

结果如图4以及图5所示：(1)在IFN-γ与药物共孵育24h后，与DMSO组相比，LGT-6(0.1uM水平)和LGT-8(100ng/mL)可显著下调角质细胞CXCL10的分泌；(2)调整药物浓度后，再与IFN-γ⁺TNF-α共孵育24h后，LGT-4，LGT-7以及LGT-8均可显著下调角质细胞CXCL10和CXCL16的分泌。

实验数据表明，在雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯酮及联合用药后，均可显著降低角质形成细胞分泌趋化因子CXCL10和CXCL16的产生，其作用机制可能是下调CXCL10和CXCL16上游调控分子STAT1和NF-kB的表达；并且三种单体化合物联合用药以后效果更为显著，提示其可作为白癜风治疗的候选药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。