一种用于抑制血清淀粉样蛋白P的药物的制作方法

本发明涉及一种用于抑制血清淀粉样蛋白p的药物，属于生物医药技术领域。

背景技术：

动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础，其特点是在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下有脂质沉着，同时伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增生，使内膜增厚，形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块。炎症贯穿于动脉粥样硬化发生和发展的全过程，其作为动脉粥样硬化过程中许多病理生理改变的共同基础，已日益得到关注和认可。到目前为止，as的发病机制尚未完全清楚，存在多种学说，涉及多种危险因素，以至临床缺乏有效的防治药物。

血清淀粉样蛋白p(sap)是一种血浆糖蛋白，属于五聚体家族蛋白，正常血浆浓度为24-32μg/ml，在体外以ca²⁺依赖的方式与某些寡糖、多糖、dna等多种配体结合。近年来人们发现sap除了参与阿尔茨海默病的发生，与心血管疾病如急性心肌梗死、不稳定性心绞痛等发病风险密切相关，此外还影响2型糖尿病的发生，而糖尿病人群是心血管疾病风险的高危因素。对临床病人的主动脉标本研宄发现，动脉粥样硬化斑块内部有大量sap沉积，并且与动脉粥样硬化的程度呈正相关，这证明sap在心血管疾病尤其是as中扮演重要角色，然而关于sap对as的具体作用及相关机制仍不是十分明确。

盐酸苄丝肼是外周脱羧酶抑制药，与左旋多巴联合应用制成复方制剂多巴丝肼，在临床上常用于帕金森病的治疗。目前的临床研究表明，盐酸苄丝肼对于脑膜炎或合并脑动脉硬化的效果比较好，推测盐酸苄丝肼同样能够作用于血管的粥样硬化。但盐酸苄丝肼抗动脉粥样硬化的具体机制和靶点还未有研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于抑制血清淀粉样蛋白p的药物。

本发明通过构建sap过表达的细胞模型研究了盐酸苄丝肼对于sap表达的抑制作用，结果显示盐酸苄丝肼能显著抑制sap过表达的巨噬细胞的sap表达量，并且抑制作用具有药物浓度依赖性，盐酸苄丝肼低剂量组的抑制效果明显优于高剂量组的抑制效果。除此之外，结果显示sap过表达能引起炎症因子tnf-α表达量的上升，且与对照组相比具有显著性差异，说明sap表达过量能引起其他炎症因子如tnf-α的过表达，虽然sap在动脉粥样硬化中的具体作用尚未清晰，但本研究可为进一步阐明其具体作用和机制提供新的思路和依据。综上所述，盐酸苄丝肼能显著抑制sap过表达的巨噬细胞的sap和tnf-α表达量，显示了盐酸苄丝肼具有改善动脉粥样硬化的良好潜力，也为进一步研究盐酸苄丝肼抗动脉粥样硬化的具体机制和靶点奠定基础。

下面是药理学部分试验及结果：

一、建立实验细胞模型

取生长于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液的对数生长期的thp-1细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于6孔培养板，经100ng/ml佛波酯(pma)刺激48h后细胞贴壁并长出伪足即成功分化为人巨噬细胞，将细胞分别加入不同浓度lps(0、100、300、500、700μg/ml)作用24h后，提取rna并逆转录成cdna保存，通过q-pcr确定后续实验所用的cdna以获取sap目的基因，进行sap过表达载体的构建。

二、sap-plvx-ires-zsgreen1重组载体的构建

设计sap引物，并用lps浓度为300ug/ml得到的cdna进行pcr，将pcr产物经过1％琼脂糖电泳后得到的条带切下用胶回收试剂盒进行回收并测定浓度。将plvx-ires-zsgreen1载体用ecori和bamhi进行双酶切，酶切产物与胶回收产物进行重组连接、转化、菌液pcr克隆鉴定、测序，测序结果可证明sap-plvx-ires-zsgreen1重组载体构建成功。

三、慢病毒包装

将sap-plvx-ires-zsgreen1/plvx-ires-zsgreen1(对照)、pspax2、pmd2.0g三质粒采用lipofectamine2000试剂共转染293t细胞，转染48h后收集上清液，用0.45μm滤器过滤，并于4℃、50000xg的条件下进行超高速离心3h，弃去上清液，将得到的沉淀用一定体积的含10％胎牛血清的rpmi1640培养液重悬后即可得的慢病毒悬液，可用于感染目的细胞。

四、盐酸苄丝肼对sap过表达的thp-1细胞的影响

取生长于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液的对数生长期的thp-1细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于6孔培养板，经100ng/ml佛波酯(pma)刺激48h后细胞贴壁并长出伪足即成功分化为人巨噬细胞，设置空白对照组、空载体对照组(plvx-ires-zsgreen1慢病毒感染)、模型组(sap-plvx-ires-zsgreen1慢病毒感染)、盐酸苄丝肼给药组(sap-plvx-ires-zsgreen1慢病毒感染+10^-7、10^-8、10^-9mben)。除空白对照组外，其余组均加入plvx-ires-zsgreen1/sap-plvx-ires-zsgreen1慢病毒感染24h，之后弃去所有分组孔内的液体，空白对照组、空载体对照组和模型组均加入含10％胎牛血清的rpmi1640培养液，盐酸苄丝肼给药组加入10^-7、10^-8、10^-9mben，置于培养箱中孵育24h后，收集上清液进行elisa，检测不同组分sap和tnf-α的表达量。

附图说明

图1为不同浓度lps(0、100、300、500、700μg/ml)作用于thp-1细胞的qpcr结果图。

图2为sap-plvx-ires-zsgreen1重组载体的测序图谱。

图3为不同浓度盐酸苄丝肼(10^-7、10^-8、10^-9m)作用于sap过表达的thp-1细胞的sapelisa数据统计分析结果图。

图4为不同浓度盐酸苄丝肼(10^-7、10^-8、10^-9m)作用于sap过表达的thp-1细胞的tnf-αelisa数据统计分析结果图。

图5为盐酸苄丝肼对thp-1细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

1.提取细胞mrna并做qpcr实验

收集细胞，用冰冷0.01mpbs清洗两次，每孔加入1mltrizol，并将细胞悬液收集于rnase-free的1.5mlep管中。每管加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，室温静置5min，4℃，12000rpm，10min离心。吸取上层水相至新的ep管，加入等体积冰冷异丙醇，轻柔混匀，颠倒6-8次，于-20℃静置10min。4℃，12000rpm，10min离心，收集rna沉淀。75％冰乙醇洗涤两次，置于超净台风干。加入约20μldepc水溶解，测定rna浓度，然后按照逆转录试剂盒进行逆转录得到各组cdna。最后按照sybrgreen试剂盒进行qpcr，处理数据。结果如图1。

2.重组载体构建反应

1)sap目的基因的获得

于灭菌pcr管中配制如下反应体系，各组分使用完毕后及时放回-20℃。

将pcr管置于pcr仪中，进行如下反应程序：

2)双酶切反应

于ep管中配制如下反应体系：

37℃酶切过夜。

3)重组反应

冰上配制如下反应体系入管底。

在冰上解冻2×genrecassemblymastermix，颠倒混匀。

在无菌管中加入10μl2×genrecassemblymastermix，加入载体和片段(按上述要求)，用无菌水补足到20μl，用移液器轻轻吹打混匀避免气泡产生。

55℃恒温反应25-50min，在冰上放置3-5min。

4)转化

取化学转化感受态细胞于冰上解冻。

取上述反应液10μl加入到感受态细胞中充分混匀，冰上静置30min。

将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却2-3min。

向离心管中加入已预热的无菌lb培养液600μl，37℃恒温振荡培养45-60min。

短暂离心弃上清，100μl的新鲜lb培养基重新悬浮，将菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

5)克隆鉴定

取若干个1.5ml无菌ep管，加入相应抗性的lb培养基0.5ml。

用无菌置于牙签或10μl小枪头挑取单个菌落置于1.5mlep管进行摇菌培养。

培养若干小时后，待菌液略微出现浑浊后，即可直接吸取菌液进行菌液pcr鉴定。

配制20μlpcr反应体系，每个反应体系中加入微量菌液作为模板。

取5μlpcr产物跑胶检测，以确定阳性克隆，测序鉴定。结果如图2。

3.mtt法体外测定盐酸苄丝肼对巨噬细胞的细胞毒性

将thp-1细胞按4×10⁴细胞数接种于96孔培养板，pma诱导48h，将细胞分为空白组(0.5％新生牛血清1640培养基)、给药组(0.5％新生牛血清1640培养基及不同浓度的盐酸苄丝肼)，给药组分别为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9m盐酸苄丝肼。细胞培养24h后，每孔加入5mg/mlmtt溶液20μl，37℃孵育4h。吸出培养液后每孔加入dmso150μl，溶解结晶，振荡混匀10min后于570nm处测定各孔吸收度，结果如图5。