本发明涉及药物递送、药物载体、疫苗载体、疫苗佐剂及生物技术领域，具体涉及一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒及其制备方法与用途。
背景技术：
纳米载体在医学领域的应用极为广泛，在医药领域，纳米粒使药物、抗原或佐剂在人体内的递送方面具有独特的优势。其中，仿生型纳米递送系统通过模仿生物系统的结构和功能，可有效降低传统纳米粒的免疫原性和副作用，成为理想的候选递送系统。
甘油酯或甘油磷酸乙醇胺是机体的正常组分，参与机体代谢或者功能，尤其甘油磷脂是生物膜重要的构成成分，具有良好的生物相容性，其在体内的代谢产物对机体无毒无害，安全性高，是优良的仿生生物材料。如何将甘油酯或甘油磷酸乙醇胺应用于制备载体，是重要的研究方向。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒及其制备方法与用途，以利用仿生和自组装技术，提供一种安全高效稳定的仿生型自组装纳米颗粒。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种核酸纳米颗粒，核酸纳米颗粒是采用两亲性单体分子作为自组装基元并通过自组装制备而成的纳米颗粒；两亲性单体分子是采用疏水性分子与亲水性的核酸分子合成。
优选地，核酸纳米颗粒为球形核酸纳米颗粒；核酸纳米颗粒的直径为148.77～153.63nm；核酸纳米颗粒的分散度指数(pdi)为0.16～0.22。
优选地，疏水性分子为疏水性的甘油酯分子和/或者疏水性的磷脂分子；疏水性的甘油酯分子为1,3-二亚麻酸甘油酯和/或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
优选地，亲水性的核酸分子选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
本发明还提供一种核酸纳米颗粒，单体分子为式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)和式(ⅳ)中的一种或多种；其中，
式(ⅰ)为：
式(ⅱ)为：
式(ⅲ)为：
式(ⅳ)为：
式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)和式(ⅳ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
本发明保护核酸纳米颗粒的用途，尤其是在药物递送、药物载体、疫苗载体、疫苗佐剂等技术领域的应用。
本发明还保护核酸纳米颗粒负载药物、抗原或佐剂形成的复合物。
本发明还保护核酸纳米颗粒负载药物、抗原或佐剂形成的复合物的用途，尤其是在药物递送、药物载体、疫苗载体、疫苗佐剂等技术领域的应用。
本发明还提供了一种核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：s1：将甘油酯和交联剂混合，室温下搅拌反应4～8h后与功能性寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌反应过夜，然后透析、冻干；s2：将待负载物与3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应4～8h后与功能性寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌反应过夜；s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入角鲨烯，室温下1000～1500rpm搅拌2～4h，然后透析、冻干，得到核酸纳米颗粒。
优选地，s1中，甘油酯的体积与交联剂的质量的比值为(100～200)μl：(3～5)mg，甘油酯的体积与功能性寡聚脱氧核苷酸的体积的比值为(100～200)μl：(200～500)μl；甘油酯为1,3-二亚麻酸甘油酯或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；交联剂为叠氮化钠或3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯；功能性寡聚脱氧核苷酸为cpg-odn或bcl2-odn；s2中，待负载物的质量与3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的质量的比值为(2～5)mg：(4.5～5.5)mg，待负载物的质量与功能性寡聚脱氧核苷酸的体积的比值为(2～5)mg：(200～500)μl；待负载物选自药物、抗原或佐剂中的一种或多种；优选为鸡卵清蛋白或阿糖胞苷；功能性寡聚脱氧核苷酸为anti-cpg-odn或anti-bcl2-odn；s3中，甘油酯的体积与待负载物的质量的比值为(100～200)μl：(2～5)mg，甘油酯的体积与角鲨烯的体积的比值为(100～200)μl：(50～100)μl；s1和s3中，透析采用的是透析袋，透析后收集的是分子量大于1000kd的物质。需要说明的是，本发明采用的cpg-odn的序列(seqidno.1)为：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’；anti-cpg-odn的序列(seqidno.2)为：5’-aacgtcaggaacgtcatgga-3’；bcl2-odn的序列(seqidno.3)为：5’-atggcgcacgctgggagaaaa-3’；anti-bcl2-odn的序列(seqidno.4)为：5’-ttttctcccagcgtgcgccat-3’；cpg-odn、anti-cpg-odn、bcl2-odn和anti-bcl2-odn均购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明将具有亲水特性的甘油酯或者磷脂与亲水性的核酸分子合成两亲性单体分子，并以此为自组装基元通过自组装制备纳米粒，即具有3d结构的仿生型球形核酸纳米粒，球形核酸的3d结构有利于维持脂质纳米囊粒结构的稳定性；该纳米粒亲水端可为功能核酸分子，疏水端是具有良好生物相容性的仿生型的生物材料；疏水层与亲水层分子均可负载不同特性的药物、抗原或佐剂，作为载体应用于药物或疫苗领域；在构建球形核酸纳米粒时，将具有氧化还原响应性的二硫键引入不同功能分子间的合成中，可以实现药物在细胞内的可控释放以及各功能分子以游离形式发挥作用；
(2)本发明提供的纳米颗粒，直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，电位为-28.8mv，1,3-二亚麻酸甘油酯与鸡卵清蛋白分别位于球形纳米颗粒内外，角鲨烯位于脂质层；细胞吞噬颗粒之后，纳米颗粒负载的药物可以游离的分子形式发挥作用；以二硫键连接的单体分子，在体内环境下不稳定，很容易断开，各药物能快速释放发挥作用；
(3)本发明提供的制备过程条件温和，保证了纳米颗粒所载药物或疫苗的活性及安全性；原料廉价易得，工艺简单易行。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例五中叠氮化1,3-二亚麻酸甘油酯的红外光谱图；
图2为本发明实施例七中1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺与cpg-odn成功偶联电泳图；
图3为本发明实施例七制备得到的球形核酸纳米颗粒粒径图；
图4为本发明实施例八中1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺与bcl2-odn成功偶联电泳图；
图5为本发明实施例九中激光共聚焦图(50μm)；
图6为本发明实施例九中激光共聚焦图(20μm)；
图7为本发明实施例九中激光共聚焦图(10μm)；
图8为本发明实施例九中流式细胞术实验结果图(cd40)；
图9为本发明实施例九中流式细胞术实验结果图(cd80)；
图10为本发明实施例九中流式细胞术实验结果图(cd86)；
图11为本发明实施例九中的细胞存活率结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供了一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒，其是采用两亲性单体分子作为自组装基元并通过自组装制备而成的纳米颗粒；疏水性分子为疏水性的甘油酯分子和/或者疏水性的磷脂分子；疏水性的甘油酯分子为1,3-二亚麻酸甘油酯和/或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；亲水性的核酸分子选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，其单体分子为式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)和式(ⅳ)中的一种或多种；
其中，
式(ⅰ)为：
式(ⅱ)为：
式(ⅲ)为：
式(ⅳ)为：
式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)和式(ⅳ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
本发明还提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
s1：将甘油酯和交联剂混合，室温下搅拌反应4～8h后与功能性寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌反应过夜，然后透析、冻干；其中，甘油酯的体积与交联剂的质量的比值为(100～200)μl：(3～5)mg，甘油酯的体积与功能性寡聚脱氧核苷酸的体积的比值为(100～200)μl：(200～500)μl；甘油酯为1,3-二亚麻酸甘油酯或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；交联剂为叠氮化钠或3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯；功能性寡聚脱氧核苷酸为cpg-odn或bcl2-odn；透析采用的是透析袋，透析后收集的是分子量大于1000kd的物质；
s2：将待负载物与3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，搅拌反应室温下搅拌反应4～8h后与功能性寡聚脱氧核苷酸混合，室温下搅拌反应过夜；其中，待负载物的质量与3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的质量的比值为(2～5)mg：(4.5～5.5)mg，待负载物的质量与功能性寡聚脱氧核苷酸的体积的比值为(2～5)mg：(200～500)μl；待负载物选自药物、抗原或佐剂中的一种或多种；优选为鸡卵清蛋白或阿糖胞苷；功能性寡聚脱氧核苷酸为anti-cpg-odn或anti-bcl2-odn；s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入角鲨烯，室温下1000～1500rpm搅拌2～4h，然后透析、冻干，得到核酸纳米颗粒；其中，甘油酯的体积与待负载物的质量的比值为(100～200)μl：(2～5)mg，甘油酯的体积与角鲨烯的体积的比值为(100～200)μl：(50～100)μl；透析采用的是透析袋，透析后收集的是分子量大于1000kd的物质。
实施例一
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒，直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，其单体分子为式(ⅰ)：
式(ⅰ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
实施例二
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒，直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，其单体分子为式(ⅱ)：
式(ⅱ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
实施例三
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒，直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，其单体分子为式(ⅲ)：
式(ⅲ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
实施例四
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒，直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，其单体分子为式(ⅳ)：
式(ⅳ)中的r1、r2为任一脂肪链，核酸选自寡聚脱氧核苷酸、小干扰rna和核酸适配体中的一种或多种。
实施例五
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
s1：将100μl1,3-二亚麻酸甘油酯和4mg叠氮化钠混合，室温下搅拌反应6h后与200μlcpg-odn(seqidno.1：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’)混合，室温下搅拌反应过夜，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，之后冻干；
s2：将3mg鸡卵清蛋白与5mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlanti-cpg-odn(seqidno.2：5’-aacgtcaggaacgtcatgga-3’)混合，室温下搅拌反应过夜；
s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入50μl角鲨烯，室温下1000rpm搅拌4h，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，再冻干，得到仿生型自组装球形核酸纳米颗粒。
本实施例中，将1,3-二亚麻酸甘油酯与叠氮化钠在室温下反应，加入三乙胺调节反应液酸碱度，叠氮化1,3-二亚麻酸甘油酯。图1为叠氮化1,3-二亚麻酸甘油酯红外光谱图，显示成功叠氮化。
本实施例制备得到的仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，单体分子为：
实施例六
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
s1：将100μl1,3-二亚麻酸甘油酯和4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlbcl2-odn(seqidno.3：5’-atggcgcacgctgggagaaaa-3’)混合，室温下搅拌反应过夜，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，之后冻干；
s2：将3mg阿糖胞苷与5mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlanti-bcl2-odn(seqidno.4：5’-ttttctcccagcgtgcgccat-3’)混合，室温下搅拌反应过夜；
s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入50μl角鲨烯，室温下1000rpm搅拌4h，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，再冻干，得到仿生型自组装球形核酸纳米颗粒。
本实施例制备得到的仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，单体分子为：
实施例七
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
s1：将100μl1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlcpg-odn(seqidno.1：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’)混合，室温下搅拌反应过夜，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，之后冻干；
s2：将3mg鸡卵清蛋白与5mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlanti-cpg-odn(seqidno.2：5’-aacgtcaggaacgtcatgga-3’)混合，室温下搅拌反应过夜；
s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入50μl角鲨烯，室温下1000rpm搅拌4h，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，再冻干，得到仿生型自组装球形核酸纳米颗粒。
本实施例制备得到的仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，单体分子为：
图2为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺与cpg-odn成功偶联电泳图；
图3为球形核酸纳米颗粒粒径图。
实施例八
本实施例提供一种仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
s1：将100μl1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和4mg叠氮化钠混合，室温下搅拌反应6h后与200μlbcl2-odn(seqidno.3：5’-atggcgcacgctgggagaaaa-3’)混合，室温下搅拌反应过夜，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，之后冻干；
s2：将3mg阿糖胞苷与5mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，室温下搅拌反应6h后与200μlanti-bcl2-odn(seqidno.4：5’-ttttctcccagcgtgcgccat-3’)混合，室温下搅拌反应过夜；
s3：将s1得到的溶液和s2得到的溶液混合，加入50μl角鲨烯，室温下1000rpm搅拌4h，然后采用透析袋进行透析，收集分子量大于1000kd的物质，再冻干，得到仿生型自组装球形核酸纳米颗粒。
本实施例制备得到的仿生型自组装球形核酸纳米颗粒的直径为151.20±2.43nm，分散度指数(pdi)为0.19±0.03nm，单体分子为：
图4为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺与bcl2-odn成功偶联电泳图。
实施例九
1、共聚焦实验
为了观察负载ova(鸡卵清白蛋白)的dope-odn纳米颗粒(实施例七制备得到)在bmdcs中的分布状况，取c57bl/6小鼠骨髓来源树突状细胞(bonemarrowderiveddendriticcell,bmdc)进行培养，第七天收集细胞分别与游离ova(fitc标记)、负载fitc标记ova的dope-odn纳米复合物(加药量按20μg/mlova计算)共孵育6h后，pbs洗涤细胞3次，用dapi染细胞核，利用激光共聚焦显微镜(leica,tcssp5)观察负载ova的dope-odn纳米颗粒在bmdcs中分布状况。
结果：激光共聚焦图如图5(50μm)、图6(20μm)和图7(10μm)所示；其中，a指bmdc与负载fitc-ova的dope-odn纳米复合物孵育6小时的激光共聚焦图，b指bmdc与游离的fitc-ova孵育6小时的激光共聚焦图；从左到右依次为fitc-ova(绿色荧光)、dapi染色的细胞核(蓝色荧光)，两种荧光叠加图和细胞明场图，结果显示：dope-odn球形核苷酸纳米颗粒可显著增加抗原在bmdcs中的摄入量。
2、流式细胞术实验：
取bmdc与游离ova、负载ova的dope-odn纳米颗粒(实施例七制备得到)共孵育6小时，标记cd11c、cd40、cd80、cd86等流式抗体，用流式细胞仪(bdbioscience,c6)检测bmdcs活化程度。
结果：如图8、图9和图10所示；其中图8为流式细胞术实验结果图(cd40)；图9为流式细胞术实验结果图(cd80)；图10为流式细胞术实验结果图(cd86)。结果显示：dope-odn球形核苷酸纳米颗粒负载抗原可显著促进bmdcs细胞表面协同刺激分子的表达，具有促抗原提呈细胞活化的作用。
3、细胞毒性实验：
将培养7天的bmdcs接种于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。每孔加入浓度分别为0、10、20、30、40μg/ml负载ova的dope-odn纳米颗粒(按ova浓度计算，实施例七制备得到)，继续培养24小时，每孔加入10μlcck-8检测液，置于37℃培养箱中培养1～4h，利用多功能全波长酶标仪(thermovarioskanflash3001)测定450nm处吸光度。
结果：细胞存活率如图11所示，当负载ova的dope-odn纳米颗粒浓度为10μg/ml时细胞存活率为74％；浓度为40μg/ml时，细胞存活率仍为30％以上，说明负载ova的dope-odn球形核苷酸纳米颗粒的细胞毒性较低。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
sequencelisting
<110>中国医学科学院生物医学工程研究所
<120>仿生型自组装球形核酸纳米颗粒及其制备方法与用途
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