治疗淀粉样沉积疾病的嵌合抗体的制作方法

引用efs-web提交的序列表序列表“8441-0004-1_st25”的ascii文本文件的内容，大小为15.6kb，创建于2018年6月4日，并通过efs-web与本申请一起以电子方式提交，在此全部引用作为参考。要求优先权本申请要求2017年6月29日提交的美国临时专利申请62/526,835的优先权，其全部内容通过引用并入在此。政府权利本发明是在美国政府的支持下联系20xs094a完成，由科学应用国际公司(frederick)授予的。因此，美国政府对此处描述和要求保护的发明享有某些权利。本发明是关于一种可用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病的小鼠-人嵌合抗体、包含此抗体的药物组合物、制备此抗体的方法与材料、以及使用所述抗体或所述医药组成物治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，尤其是一种原发性(al)淀粉样变性。
背景技术：
：天然的抗体通常是由约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其是由两条相同的轻链及两条相同的重链所组成，其中每条轻链透过一个二硫键与重链相连，而两条重链之间额外的二硫键的数量随不同的抗体的同种型而有不同。最简单的同种型抗体是igg，其仅包含两条轻链及两条重链，且其中两条重链仅透过两个二硫键连接。每条重链的一端具有一个可变区域(vh)，其带有多个相邻的恒定区域：而每条轻链的一端亦具有可变区域(vl)，且其另一端具有恒定区域。抗体中轻链及重链的每个可变区域都包含三个区段，称为互补决定区(complementarity-determiningregions，cdr)或高度变异区。轻链中的每个互补决定区与相邻重链中所相应的互补决定区共同形成抗体的抗原结合位点。轻链有主要有κ与λ两种类型，属于哪种类型是取决于其恒定区域，κ与λ轻链均可与任何不同的重链互相结合。淀粉样蛋白轻链淀粉样变性(al淀粉样变性)，或称为原发性淀粉样变性，是在美国最常见的全身性淀粉样变性的形式；其中，术语“淀粉样变性”是指一组具有共同特征的疾病，即病理性原纤维蛋白在器官及组织中的细胞外沉积(rodney，etal.-nejm，25：898)。淀粉样变性是由于人体内产生抗体的细胞功能异常而引起的，这种异常会导致蛋白质纤维异常地产生，且所述些蛋白质纤维会在器官及组织中聚集形成不可溶的淀粉状蛋白。淀粉样变性的类型是由形成原纤维沉积物的前驱蛋白的性质所决定的。在原发性淀粉样变性中，原纤维包含免疫球蛋白轻链的片段，而在继发性淀粉样变性中，原纤维则包含淀粉样蛋白a。淀粉样变性较现代的分类是基于形成原纤维沉积物的前驱血浆蛋白的性质而决定的。前驱血浆蛋白是多种且无关的，尽管如此，所有前驱沉积物都会产生淀粉样沉积物，且其具有共同的典型β-折叠构型的特征，而此特征是纤维状沉积物典型的染色特性所致。淀粉样变性发展的最后阶段是淀粉样原纤维沈积在患者的器官中，且淀粉样变性地死亡率很高，目前的五年生存率约为28％。迄今为止，原发性淀粉样变性的治疗方法，一直是致力于透过常规或高剂量细胞毒性化学疗法，以攻击发生功能异常的细胞来减少淀粉样前驱轻链的合成。然而，此种治疗有两个缺点：第一个是因为直到发生大量沉积为止，原纤维沉积通常是无症状的，因此在已经发生大量沉积之前不太可能进行所述种治疗方法；另一个则是因为此种治疗方法最多只能停止前驱异常蛋白的产生而不能去除现有的沉积物，因此由于病理性沉积物的残存率(或进展状态)，原发性淀粉样变性患者的预后仍然非常差(solomon，etal.-int.j.exp.clin.invest.2：269)。最近的动物研究显示，施用针对存在于原发性淀粉样变性原纤维上的β-折叠结构的共同抗原表位的鼠11-1f4抗体、及其他鼠抗人轻链特异性抗体，会导致人类alκ及alλ淀粉样蛋白沉积物的完全降解。于美国专利第8,105,594号专利案中关于所述些鼠类抗体的部分描述，其整体是透过引用的方式并入本文中。鼠抗体通常不适合施用于其他物种的动物中(例如人类)，因为施用的物种会将鼠抗体视为具有抗原性并将产生针对其的抗体。当将一种物种的抗体注射到另一物种中时，其抗原性通常是由恒定结构域的一部分所引起的，这样的抗原反应将会阻碍或阻止鼠抗体的治疗作用。在人类体内，这种抗原反应称为人类抗小鼠抗体(humananti-mouseantibody，hama)。在′594号专利案中所描述的抗体，具有透过人抗小鼠抗体反应而在人类中产生高度免疫原性的潜力。由于人类抗小鼠抗体反应通常导致小鼠抗体从人受体中被快速地清除，因此人类抗小鼠抗体将会严重的限制鼠抗体在人体的治疗中，可能具有任何益处的潜力。因此，所述些鼠抗体不适合施用于患者体内，以中止或逆转患者体内淀粉样蛋白原纤维的沉积，并且需要使用在人类中具有低免疫原性的抗体，于淀粉样蛋白沉积疾病的治疗中。技术实现要素：本发明的一个实施例是关于一种嵌合小鼠-人抗体用于治疗淀粉样蛋白沉积疾病的用途，且特别是对治疗原发性淀粉样变性。本发明的另一个实施例是关于一个药物组合物，其包含嵌合抗体及医药学上可接受的载体。本发明的另一个实施例是关于一种用于产生所述抗体的方法及材料，包含多核苷酸序列及载体构建体。本发明的另一个实施例是关于一种治疗或改善需要所述种治疗的患者的淀粉样沉积疾病例如原发性淀粉样变性的症状的方法，其中是透过对需要这种治疗或改善的患者给予一有效量的所述抗体以及医药学上可接受的载体。本发明的另一个实施例是关于一种在怀疑患有淀粉样沉积病的患者中检测淀粉样蛋白沉积病的方法，是透过给予本发明被标记的抗体以检测患者体内标记物的存在，且所述标记可以是放射性标记，例如124i，但是也能够为任何本领域技术人员可轻易地想到的其它种类的标记。所述实施例中包含所述标记的抗体本身。附图说明图1是为用于从杂交瘤细胞株选殖鼠vh及vk基因的策略概述图。图2是为鼠11-1f4抗体vh区域基因的dna序列及氨基酸序列的列表，分别为seqidno：39及35。图3是为鼠11-1f4抗体vk区域基因的dna序列及氨基酸序列的列表，分别为seqidno：40及36。图4是为免疫球蛋白κ轻链表达载体pkn100的基因地图，该载体是由一个psv2载体片段所组成，而该片段具有sv40起始及残缺的sv40晚期启动子，即sv40起源及co1e1起源；该载体还具有氨苄青霉素抗性以及neo基因；其中，残缺的sv40晚期启动子会驱动neo基因；该载体还具有hcmvi启动子、用于插入免疫球蛋白可变区域基因的多个选殖位点(包含bamhi及hindiii限制酶切位点)、以及由spac2终止讯号序列(arnie)终止的人类kappa恒定区域基因的cdna，其中该cdna的方向与kappa轻链表达匣相同。图5是为免疫球蛋白γ1重链表达载体pg1d200的基因地图，该载体是由一个psv2dhfr载体片段所组成，而该片段具有sv40早期和残缺的sv40晚期启动子，即sv40起源及co1e1起源；该载体还具有氨苄青霉素抗性及dhfr基因；其中，残缺的sv40晚期启动子会驱动dhfr基因；因此，该载体的表达能力较差，但其也因此允许使用相对较低表达水平的氨甲喋呤以选择多基因/高表达水平的选殖产物；该载体还具有hcmvi启动子片段、多选殖位点、人γ1恒定区基因(内含子缺乏)的cdna，该cdna的后面是spac2终止讯号序列(arnie)。图6是为经修饰的鼠11-1f4抗体vk区基因的dna序列及氨基酸序列(分别为seqidno：42及47)的列表，以及用于修饰该vk区基因的寡核苷酸引物的序列(分别为seqidno：41及no：43)，以及带有前导序列的dna序列(seqidno：37)。图7是为经修饰的鼠11-1f4抗体vh区基因的dna序列及氨基酸序列(分别为seqidno：45及no：48)的列表，以及用于修饰该vh区基因的寡核苷酸引物的序列(分别为seqidno：44及no：46)，以及具有前导序列的dna序列(seqidno：38)。图8是为淀粉样蛋白原纤结合elisa测定的结果；含有嵌合11-1f4抗体的cos细胞的细胞培养液上清液与纯化的鼠11-1f4抗体一起在同一个elisa培养盘上进行测试；其中是测量在od405的吸光值：新sv＝pg1kd200-11-1f4；新的共转染＝11-1f4vhpg1d200加上11-1f4vk.pkn100。具体实施方式根据本发明，本案提供的小鼠-人嵌合抗体可用于给予患有淀粉样沉积疾病的患者，以治疗或减轻所述疾病的症状。本发明的嵌合抗体能够与淀粉样蛋白结合，并激活所述患者的免疫系统以清除所结合的物质，且几乎不产生或完全不产生人类抗小鼠抗体(humananti-mouseantibody，hama)的反应。本发明还提供包含至少一种所述的嵌合抗体与药学上可接受的载体的医药组成物、一种用于产生所述些抗体的方法与材料、以及一种治疗或减缓患有淀粉样变性疾病患者的症状的方法，所述方法是藉由给予所述患者一定量的所述嵌合抗体，所述嵌合抗体可有效去除所述患者器官中的至少部分的淀粉样蛋白沉积物，从而治疗或缓解淀粉样变性的症状。在本发明中，向患有淀粉样变性的患者施用至少一种嵌合抗体，以促进降解及去除已经沉积在所述患者器官中至少部分的淀粉样蛋白原纤维。其中是将所述嵌合抗体的有效治疗量与医药学上可接受的载体一起施用，且合适的医药学上可接受的载体是本
技术领域：
中的通常知识。如医学
技术领域：
中普通技术人员所皆知的，典型的给药途径是肠胃外(例如静脉内)，而其他给药途径当然也是可行的，且能够单次或多次给药。医师能够针对特定患者优化抗体的给药量及给药频率。给予所述患者的嵌合抗体的有效治疗剂量(无论是以单剂量还是多次剂量的方式给药)应足以减少所述患者体内所沉积的淀粉样蛋白原纤维的量；其中，所述有效治疗剂量能够透过评估所述患者的症状变化、或评估所述患者淀粉样蛋白原纤维沉积量的变化来决定(例如透过使用具有124i标记的抗体，并透过放射免疫法以检测所沉积的淀粉样蛋白沉积物)。因此，本发明具有标记的嵌合抗体可用于在疑似患有所述疾病的患者上进行淀粉样蛋白沉积疾病存在的检测以及确定治疗的有效性。为了生产本发明的嵌合抗体，将美国专利第8,105,594号中所述的老鼠11-1f4单克隆抗体的重链和κ轻链的可变区基因进行pcr修饰，以促进嵌合11-1f4抗体在哺乳动物细胞中的表达。本发明中对修饰的可变区基因进行了详细的序列分析。将修饰的可变区基因克隆到合适的哺乳动物表达载体中，以产生构建体11-1f4vhpg1d200及11-1f4vk.pkn100，并透过ecori的限制酶消化与连接，将11-1f4vhpg1d200与11-if4vk.pkn100构建成单个超载体构建体pg1kd200-11-1f4；最后，透过在cos(chinesehamsterovary，中国仓鼠卵巢)细胞内共转染及单一超载体转染以瞬时表达嵌合11-1f4抗体；其中，尽管本发明为方便起见而选择cos细胞进行共转染或转染，但本领域技术人员皆知能够使用其他哺乳动物细胞株进行。透过直接结合elisa的方法以确定嵌合11-1f4抗体对淀粉样蛋白原纤维的结合能力的特征。出乎意料且有利的是，嵌合11-1f4抗体相较于比鼠11-1f4抗体具有与淀粉样蛋白原纤维更高的亲和力与结合力。本发明的抗体包含小鼠-人嵌合单克隆抗体，其包含seqidno：47的免疫球蛋白轻κ链可变链区域(immunoglobulinlightkappachainvariablechainregion，vk)及seqidno：48的免疫球蛋白重链可变链区域(immunoglobulinheavychainvariablechainregion，vh)，且所述抗体是与由淀粉样蛋白的β-折叠构型表达的抗原表位进行结合。此外，令人惊讶地，所述抗体比其衍生来源的11-1f4小鼠抗体具有与所述抗原表位更高的亲和力；其中，所述11-1f4小鼠抗体包含seqidno：36的vk区及seqidno：35的vh区。本发明包含在需要治疗的患者中治疗淀粉样蛋白沉积疾病的方法，所述方法包含对所述患者给予包含医药学上可接受的载体的前述抗体；其中，所给予的抗体的量应能够有效地减少沉积在所述患者组织中的淀粉样蛋白原纤维的量。所述抗体组成物能够透过任何常规的给药途径的方式给予，其中给药途径较佳为肠胃外给药(例如静脉内)，而医药学上可接受的载体是本
技术领域：
中的通常知识，并且医学领域中具通常知识者能够选择最合适的一种方式。其中，淀粉样沉积疾病较佳为原发性(al)淀粉样变性。本发明还包含用于制备本发明的抗体的方法与材料。用于制备本发明的抗体的材料包含选自11-1f4vk.pkn100与11-f4vh.pg1d200的载体构建体，其分别显示于图5及图6中，以及由前述两个载体建构体所制备的超构建体pg.1kd20011-1f4。其它所使用的材料包还经修饰的鼠11-1f4抗体vk区基因(seqidno：42)与经修饰的11-1f4抗体vh区基因(seqidno：45)，以及相对应的引物seqidno：41、43、44、及46。本发明的抗体可透过将载体构建体11-1f4vk.pkn100与11-f4vh.pg1d200共转染、或将超构建体pg.1kd20011-1f4转染在合适的哺乳动物宿主细胞，例如cos细胞中进行制备。简称dulbecco′s改良的eagles培养基(dulbecco′smodifiedeaglesmedium，dmem)，胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，核糖核酸(ribonucleicacid，rna)；传讯rna(messengerrna，mrna)；脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)；互补dna(copydna，cdna)；聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)；分钟(minute，min)；秒(second，sec)；三硼酸盐缓冲液(tris-boratebuffer，tbe)。氨基酸由iupac缩写表示，如下所示：丙氨酸(alanine，ala，a)，精氨酸(arginine，arg，r)，天冬酰氨(asparagine，asn，n)，天冬氨酸(asparticacid，asp，d)，半胱氨酸(cysteine，cys，c)，谷氨酰氨(glutamine，gln，q)，谷氨酸(glutamicacid，glu，e)，甘氨酸(glycine，gly，g)，组氨酸(histidine，his，h)，异亮氨酸(isoleucine，ile，i)，亮氨酸(leucine，leu，l)，赖氨酸(lysine，lys，k)，蛋氨酸(methionine，met，m)，苯丙氨酸(phenylalanine，phe，f)，脯氨酸(proline，pro，p)，丝氨酸(serine，ser，s)，苏氨酸(threonine，thr，t)，色氨酸(tryptophan，trp，w)，酪氨酸(tyrosine，tyr，y)，缬氨酸(valine，val，v)。核苷酸类似物：腺嘌呤(adenine，a)，胞嘧啶(cytosine，c)，鸟嘌呤(guanine，g)，胸腺嘧啶(thymine，t)，尿嘧啶(uracil，u)，腺嘌呤或鸟嘌呤(adenineorguanine，r)，胞嘧啶或胸腺嘧啶(cytosineorthymine，y)，鸟嘌呤或胞嘧啶(guanineorcytosine，s)，腺嘌呤或胸腺嘧啶(adenineorthymine，w)，鸟嘌呤或胸腺嘧啶(guanineorthymine，k)，腺嘌呤或胞嘧啶(adenineorcytosine，m)，胞嘧啶或鸟嘌呤或胸腺嘧啶(cytosineorguanineorthymine，b)，腺嘌呤或鸟嘌呤或胸腺嘧啶(adenineorguanineorthymine，d)，腺嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶(adenineorcytosineorthymine，h)，腺嘌呤或胞嘧啶或鸟嘌呤(adenineorcytosineorguanine，v)，以及任何碱基(base，n)。实施例1小鼠11-1f4抗体的pcr克隆及dna测序以pcr克隆鼠11-1f4单克隆抗体的重链与轻链的可变区基因，并对所分离出的所有可变区基因(包含假性与功能性的)进行详细的序列分析，以获得鼠11-1f4的重链与轻链可变区基因的详细dna及氨基酸序列。材料培养基的成分及所有其他组织培养材料皆是购自lifetechnologies(英国)。rna溶液试剂套组是购自stratagene(美国)，而第一链cdna合成试剂套组则是购自pharmacia(英国)。用于rcr反应的所有成分与设备，其中包含聚合酶，皆是购自perkinelmer(美国)。topota试剂套组是购自invitrogen(美国)。琼脂(ultrapuretm)是购自lifetechnologies(英国)。abidyetm终止剂循环定序准备反应试剂套组、预混合循环定序试剂套组、及abi定序仪皆是购自peappliedbiosystems(美国)。其它所有分子生物学产品均是购自newenglandbiolabs(美国)及promega(美国)。方法图1中概述在杂交瘤细胞株中，以pcr克隆鼠vh与vk基因进而制造鼠单克隆抗体11-1f4的策略。产生α-人类轻链单克隆抗体11-1f4的sp2/0杂交瘤细胞株的两个克隆株(b2c4及b2d6)是由医学博士alansolomon所提供(田纳西大学医学中心，田纳西州诺克斯维尔)。杂交瘤细胞是自美国典型培养物保藏中心获得(atcc，编号pta-105)。细胞是使用含有20％(v/v)胎牛血清、青霉素/链霉素、及l-谷氨酰氨的dmem培养基进行培养。以前述方法培养细胞直到总活细胞总数达到108个细胞。不同细胞是分别由下列各个克隆株所获得。小鼠杂交瘤细胞株悬浮生长在合适及质量足够的培养基中，使得其能够生长到总活细胞数达约108个细胞后，收取细胞培养上清液，并以台式离心机(250g，5分钟)沉淀所述杂交瘤细胞，接着将细胞轻轻的重新悬浮于20ml的磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsalinebuffer，pbs)中，并取出100μl等分试样进行活细胞计数。将所述等分试样中的细胞再次离心沉淀后，将200μl的磷酸盐缓冲溶液与200μl的台盼蓝(trypanblue)添加到100μl的细胞溶液中并轻轻地混合均匀，接着取出10μl的所述混合物至一次性细胞计数载玻片中，并在显微镜下计数9个小方块中白色细胞的数量，其中不计算蓝色细胞(即死细胞)的数量。重复计数细胞的过程，将计数结果平均后乘以9x105，以获得20ml的磷酸盐缓冲溶液中总活细胞的数量。收取足够量的细胞后，将其重新悬浮于10ml的溶液d中以进行rna的分离纯化(参见下文，stratagenerna分离试剂套组)。接着根据制造商的指示，使用stratagenerna分离试剂套组将每个克隆的细胞中分别分离纯化出总rna。将1ml的2m乙酸钠(ph4.0)添加到样品中，并透过反复倒置试管的方式将其内容物充分的混合均匀，接着于各试管中加入10.0ml的苯酚(ph5.3-5.7)，并同样以反复倒置的方次再次充分混合内容物后，于所述混合物中加入2.0ml的氯仿-异戊醇混合物，将试管加盖后剧烈的摇晃10秒钟，并将试管在冰中作用15分钟。接着，将样品转移到已在冰上预冷的50ml厚壁圆底离心管中，并将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心20分钟后，则可于所述离心管中见到两相，其中上层为包含rna的水相，下层为苯酚相，而中间相则包含dna及蛋白质，将含有rna的上层水相转移到新的离心管中，并丢弃下层的苯酚相。将等体积的异丙醇加入到水相中，并透过反复倒置试管的方式将其内容物充分的混合均匀，接着将离心管在-20℃作用1小时以沉淀rna，再将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心20分钟后，取出含有rna的试管底部的沉淀物，并移除上清液。接着，将所述沉淀物溶解在3.0ml的溶液d中，再加入3.0ml的异丙醇于各离心管中，并将内容物充分混合均匀后，将各离心管在-20℃下反应1小时后，再次将所述离心管于离心机中以10,000xg转速及4℃温度离心10分钟，并将上清液从离心管中取出并丢弃。(注意：截至目前为止，已透过异硫氰酸胍保护rna免受核糖核酸酶的作用，但现在不再受到保护。)将所述沉淀物以75％(v/v)的乙醇(depc处理过的水(25％))清洗后，将所述沉淀物在真空下干燥2-3分钟，最后将所述rna沉淀物重新悬浮于0.5-2ml的depc处理过的水中。根据制造商的指示，使用amershampharmaciabiotech第一链cdna合成试剂套组中随附的noti-d(t)18引物，以产生11-1f4杂交瘤的mrna的cdna复制片段。以如下所示方法对所分离的每一对中的两个rna样品，分别进行一个反应，其中使用的成分是为：大量的第一链cdna反应混合物、克隆的fplcpuretm鼠反转录酶、rnaguardtm、bsa、datp、dctp、dgtp、及dttp、200mm的dit水溶液、notid(t)18引物：5′-d[aactggaagaattcgcggccgcaggaa18]-3′、及以depc处理过的水。将20μl的depc水中约5μg的总rna加热至65℃保持10分钟后，再置于冰上进行冷却。轻轻地混合大量的第一链cdna反应混合物，以获得混合均匀的悬浮液，并在0.5ml的微量离心管中进行如下所示的反应：20μl的变性的rna溶液，11μl的大量第一链cdna反应混合物、1μl的noti-d(t)18引物、及1μl的dtt溶液，总体积共为33μl。透过反复吸放溶液将反应物轻轻的混合均匀，并在37℃下反应孵育1小时。接着使用jones及bendig描述的方法(参见bio/technology9：88)由单链dna(singlestranddna，ssdna)模板以pcr反应扩增鼠重链及κ轻链的可变区基因(分别为vh基因及vk基因)。为了制造每种变性的前导序列特异性引物(对于vh是为mhvi-mhv12，对于vk则是为mkvi-mkv11)，分别使用适当的恒定区引物(针对vh的mhci-mhc3及针对vk的mkc的等摩尔混合物)个别进行pcr反应。表1与表2中详细的列出分别用于扩增vh及vk区基因的引物。总共进行12个重链反应及11个κ轻链反应。在所有pcr反应中，皆是使用聚合酶以扩增cdna模板，详细步骤如下所示。将完成的cdna第一链合成反应在90℃下加热5分钟，以使rna-cdna双链体变性并使反转录酶失去活性后，置于冰上进行冷却。取出十一个新的geneamptmpcr反应试管并标记为mkv1-11，于每个反应试管中准备共100μl的反应混合物，其中每种反应混合物均包含69.3μl的无菌水、10μl的10xpcr缓冲液ii、6μl的25mm的mgcl2、10μm的dntps储备液各2μl、2.5μl的10mm的mkc引物、2.5μl的10mm的十一个mkv引物的其中一种、及1μl的rna-cdna模板混合物。接着于每个试管中加入0.7μl的聚合酶，并将所得的反应混合物以50μl的矿物油覆盖。以类似于如上所述的试例的反应混合物制备方法，以pcr克隆小鼠重链可变区基因。不过，这次共需标记十二个反应试管，并于其中分别添加十二个mhv引物的其中一种、以及适当的mhc引物。即此pcr反应是为了扩增小鼠γ1重链的可变域基因，例如使用mhcg1引物。将反应试管装载到dna热循环仪中，并在94℃下初始解璇1.5分钟之后，在94℃下反应1分钟，在50℃下反应1分钟，在72℃下反应1分钟共进行25个循环，其中最后一个循环完成后，进行最后的延伸步骤，即在72℃下反应10分钟，接着将反应产物冷却至4℃。除了在黏合(50℃)以及延伸(72℃)的步骤之间使用2.5分钟的延长斜坡时间之外，在每个循环步骤之间皆使用30秒的斜坡时间。将每个所获得的pcr产物，在每个含有0.5μg/ml的溴化乙锭的1％(w/v)琼脂/1xtbe缓冲凝胶上进行10μl的等分试样，以确定哪组引物产生pcr产物。阳性pcr克隆的大小约为420-500bp。将以上的pcr扩增反应再重复进行两次，并选择那些似乎完整扩增可变域基因全长的pcr反应，接着将每个候选的pcr产物以6μl的等分试样，按照制造商的说明指示，直接克隆到试剂套组所提供的pcrtmii载体中，并转型于大肠杆菌细胞中，接着分别取出10.0％(v/v)、1.0％(v/v)、及0.1％(v/v)等分试样的已转形的大肠杆菌细胞，放置到含有50μg/ml的氨苄青霉素的直径为90毫米的lb琼脂培养盘上，并以用25μl的x-gal储备溶液及40μl的iptg储备溶液覆盖，再于37℃下反应一夜，以透过pcr筛选鉴定阳性的菌落。表1.克隆小鼠κ轻链可变区基因的pcr引物表2.克隆小鼠重链可变区基因的pcr引物每个pcr反应产物皆取出5μl的等分试样在1％的琼脂/tbe(ph8.8)凝胶上进行电泳，以确定哪个反应产物具有正确的pcr产物大小(约450bp)。将以此方法鉴定出为阳性的pcr产物直接克隆到试剂套组所提供的pcr2.1载体中，并按照制造商的说明指示，将所述载体转形至top10胜任细胞中，并按照güssowandclackson(nucleicacidsres.17：4000)的方法，利用如表3所示的1212与1233寡核苷酸引物进行pcr筛选，以对插入正确片段大小的质粒的菌落进行pcr的鉴定。接着，使用abiprism310基因分析仪及abiprismbigdyetm终止子对以前述方法鉴定出为阳性的克隆株进行双链质粒的dna定序；其中，本发明实施例中对来自b2c4杂交瘤细胞株克隆的每个vh及vk基因的三个阳性选植株进行定测序，以及对来自b2d6杂交瘤细胞株克隆的vk基因的四个阳性克隆株与六个vh基因进行定序。表3.克隆小鼠重链可变区基因的pcr引物引物名称序列(5′-＞3′)seqidno1212(17mer)gttttcccagtcacgac291233(21mer)agcggataatttcacacagga30表4(a)中显示对每个杂交瘤克克隆株(b2c4及bcd6)，所进行的十二个pcr反应以扩增鼠11-1f4重链可变区基因的结果。将变性的前导序列引物mhv7与mhcg1-3恒定区引物的混合物(如表1所示)进行组合，以从衍生自b2c4及b2d6杂交瘤细胞株的模板cdna产生大小约为600bp的pcr产物。由于所述产物的大小大于平均vh基因的预期大小(450bp)，因此不作进一步的研究。相反的，变性的前导序列引物mhv6与mhcg1-3恒定区引物的混合物(如表1所示)进行组合后，可由来自b2c4与b2d6杂交瘤细胞株中的模板cdna，获得符合vh基因预期大小(450bp)的pcr产物。表4.中显示从sp2/0杂交瘤细胞株b2c4与b2d6克隆鼠11-1f4单克隆抗体可变区重链(a)及轻链(b)基因的pcr扩增结果；其中，第三列包含实际pcr结果的记录。在观察到特定引物组合的大小时，在适当的空间记录其碱基对的大小(bp)。表4(a).表4(b).衍生自杂交瘤克隆株b2c4的pcr产物的三个克隆产物的序列分析、以及衍生自杂交瘤克隆株b2d6的pcr产物的五个克隆产物的序列分析，公开示单个重链可变区序列(如图2所示)。所使用的克隆策略(透过使用位于前导序列与恒定区序列特异性引物区域的侧翼的引物，以扩增整个可变区基因)能够鉴定出完整的fr1序列。定序的所有八个克隆在所述区域均具有相同的序列(如图2所示)。表4(b)中显示对每个杂交瘤克克隆株(b2c4及bcd6)，所进行的十一个pcr反应以扩增鼠11-1f4κ轻链可变区基因的结果。变性的前导序列引物mkv6与mkc恒定区引物的组合(如表2所示)，仅从源自杂交瘤细胞株b2c4的模板cdna产生大小约为200bp的pcr产物。由于所述大小比vk基因的预期大小(450bp)小得多，因此不作进一步的研究。变性的前导序列引物mkv2与mkc恒定区引物的组合(如表2所示)，会产生一个大小小于预期450bp的pcr产物(当在琼脂上观察时)；其中，所述pcr产物是衍生自杂交瘤细胞株b2c4与杂交瘤细胞株b2d6二者的模板cdna。此外，先前的vk克隆发现mkv2引物会扩增一个众所周知的kappa轻链假性基因；因此，需要针对每个pcr产物的一个克隆结果皆进行序列的分析，以确认所述产物是假性基因而不是鼠11-1f4vk基因，而所述序列分析结果显示所述pcr克隆结果确实是为假性基因。最后，变性的前导序列引物mkv1与mkc恒定区引物的组合(如表1所示)，从衍生自杂交瘤细胞株b2c4及杂交瘤细胞株b2d6二者的模板cdna，能够产生符合vk基因预期大小(450bp)的pcr产物。对衍生自杂交瘤细胞株b2c4的pcr产物的三个克隆产物的序列分析、及衍生自杂交瘤细胞株b2d6的pcr产物的四个克隆产物的序列分析，公开单个κ轻链可变区序列，其不能被鉴定为假基因。因此，从杂交瘤mrna克隆出11-1f4重链可变区基因(使用恒定区特异性及前导序列特异性引物)并进行定序。当所述mrna进行转译后，所述序列会产生tvss的胜肽序列。分析在kabat数据库中所记录的122个重排的人类vh基因(kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，发现其中84％的序列具有tvss2的胜肽序列。因此，可以得出所分离出的vh基因是正确的11-1f4基因序列的结论。鼠11-1f4可变区κ轻链基因，即不具功能的vk假性基因，也被成功的被克隆出来且定序。所述假性基因是由carroll等人(molecularimmunology(1988)25：991)首次鉴定出来的。所述序列是来自异常的mrna转录产物，其存在于源自起始mopc-21肿瘤(包含sp2/0)的所有标准融合族群中。由于异常的mrna，于第23位点的不变异性的半胱氨酸被酪氨酸残基所取代，而vj的接位点不符合原本的读取框架，进而导致于第105位产生终止信号的密码子。在淋巴样或杂交瘤细胞中，合成一种以上重新排列的轻型免疫球蛋白mrna是很常见的，由于具功能性的vk基因中，通常不存在终止信号的密码子或读取框架位移，所述些mrna通常是无效的。但是当从杂交瘤中克隆免疫球蛋白基因时，所述些假性信号则经常出现而成为主要的问题，因为尽管它们无法编码功能性多肽，但它们是v区是pcr反应中良好的底物。在对七个独立的pcr克隆产物进行详细的序列分析之后，鉴定出11-1f4vk基因序列，自所述些克隆产物中分离出两个不同的pcr产物以得到seq.idno：36。由于所有的序列皆相同，因此其被认为是正确的11-1f4κ轻链可变区序列。使用所述克隆出来的vh及vk区基因，用于制备小鼠-人的嵌合11-1f4单克隆抗体，并且对其进行分析以证实其与al原纤维的特异性结合。实施例2构建小鼠-人嵌合11-1f4(c11-1f4)的抗体为了使前述11-1f4vh及vk可变区基因作为小鼠-人嵌合抗体的一部分，并在哺乳动物细胞中实时的表达，实有必要使用专门设计的pcr引物(如表5所示)进行5′-与3′-端的修饰。本发明实施例中，寡核苷酸引物f39836及f39837被用于进行11-1f4vk基因的pcr修饰，而引物f39835及f58933则用于11-1f4vh基因的pcr修饰。反向(back，bak)引物f39836及f39835分别在vk及vh基因的5′端引入hindiii限制酶的切位点、kozak转译起始位点、及免疫球蛋白前导序列。正向(froward，for)寡核苷酸引物f39837在vk基因的3′端引入一个剪接位供应位点及一个bamhi限制酶的切位点，而正向(for)寡核苷酸引物f58933还附加γ-1ch1基因之前的22个碱基对，其中还包含位于vh基因的3′端的apai限制酶的切位点。表5.用于11-1f4重链及κ轻链可变区基因的pcr修饰的寡核苷酸引物kozak共通序列对于可变区序列的有效翻译至关重要(kozak-jmolbio196：947)。其会定义正确的aug密码子，使核醣体从所述密码子开始转译，并且最关键的一个碱基是aug起始位置-3处的腺嘌呤(或较不佳的鸟嘌呤)。免疫球蛋白前导序列用以确保表达的抗体分泌到培养基中，因此使得收取与纯化更加地容易。在所述情况下，所使用的前导序列是在vh及vk克隆的过程中，从杂交瘤cdna克隆的鼠11-1f4vk及vh前导序列。剪接位供应体序列对于轻链可变区与其适当的恒定区的正确读取框内连接是至关重要的，因此剪接出130bp的vk：ck内含子。重链可变区是透过apal切位点直接与其适当的恒定区基因相连，从而消除对剪接位供应体的需求。亚克隆限制酶切位点hindiii与bamhi，以及hindiii与apal分别将经修饰的vk及vh可变区基因涵盖起来，而使用不同的独特限制酶切位点以确保定向亚克隆到合适的哺乳动物表达载体中。首先仔细地分析11-1f4轻链可变区基因，以鉴定任何不需要的剪接位供应体位点、剪接位受体位点、及kozak序列(如表6所示)。接着分析重链及轻链可变区基因是否存在任何额外的亚克隆限制酶切位点，所述些切位点随后可能会干扰功能性完整的抗体的亚克隆及/或表达，而结果显示并未发现。表6.在哺乳动物细胞中有效表达免疫球蛋白基因的重要序列名称共通dna序列kozak转译起始位点ccgccrccauggkappa轻链剪接位供应体位点ac：：gtragt重链剪接位供应体位点ag：：gtragt免疫球蛋白剪接位受体位点yyyyyyyyyyncag：：g注：以粗体显示的碱基被认为在每个共通序列内是不变的。以下列的方法分别准备每个可变区基因的pcr反应，其中是将前述质粒11-1f4vh.pcr2.1及11-1f4vk.pcr2.1作为模板。在每个pcr试管中准备总体积为100μl的反应混合物，每个反应混合物最多包含41μl的无菌水、10μl的10xpcr缓冲液i、8μl的10mm的dntps储备溶液、1μl的10mm的5′正向引物、1μl的10mm的3′反向引物、及1μl的1/10稀释的模板dna。最后，在用50μl的矿物油覆盖完成的反应混合物之前，添加0.5μl的聚合酶(2.5个单位)。将反应试管置入dna热循环仪中，并在94℃下初始解璇1分钟后，在94℃下反应30秒，在68℃下反应30秒，在72℃下反应50秒共进行25个循环，其中最后一个循环完成后，在72℃下进行最后的延伸步骤，共持续7分钟，接着将反应产物冷却至4℃。每个pcr反应产物皆取出10μl的等分试样在1.2％(w/v)的琼脂/含有0.5μg/ml的溴化乙锭的1xtbe缓冲液凝胶上进行电泳，以确定pcr反应产物的大小及存在；其中，阳性pcr克隆产物的大小约为420bp。接着将所述些经鉴定为阳性pcr的反应产物，直接克隆到由topota试剂套组所提供的pcr2.1载体中，并按照制造商的说明指示，将所述含有pcr反应产物的载体转形到top10胜任细胞中；再按照güssowandclackson(nucleicacidsres.17：4000)的方法，利用如表3所示的1212与1233寡核苷酸引物进行pcr筛选，以针对插入正确片段大小的质粒的菌落进行pcr的鉴定。接着，使用abiprism310基因分析仪及abiprismbigdyetm终止子对以前述方法鉴定出为阳性的克隆株进行双链质粒的dna定序；其中，对每个topota克隆株的vh及vk基因进行两个阳性克隆株的定序。鉴定含有正确修饰的11-1f4vh及11-1f4vk基因的克隆株，并将来自所述些选植株中具有v基因修饰的克隆株亚克隆到其各自的表达载体中，以促进嵌合重链及κ轻链在哺乳动物细胞中进行表达。经修饰的11-1f4vk基因以hindiii-bamhi片段亚克隆到表达载体pkn100(如图4所示)中，其中所述载体包含人κ恒定区基因(基因型：km(3ala153及ser191)；经修饰的11-1f4vh基因同样以hindiii-apai片段亚克隆到表达载体pg1d200中(如图5所示)，其中所述载体含有人γ1恒定区基因(基因型：g1m(-1glu377、met38i、-2ala462、3arg222、及ser229)，且κ及γ1恒定区的异型株通常存在于白种人中。接着将连结的表达构建体11-1f4vk.pkn100及11-1f4vh.pg1d200转形于dh5α胜任细胞中，并使用原始pcr修饰引物(如表4所示)以前述pcr筛选方法进行阳性克隆结果的鉴定；其中，所述些表达载体皆是普通技术人员可轻易获得的。实施例3建构于cos细胞中瞬时表达的嵌合11-1f4的单一超载体构建会同时表达嵌合的11-1f4抗体的两条免疫球蛋白链的单一超级载体的方法如下所述。将11-1f4κ轻链表达匣(包含hcmvi启动子、11-1f4κ轻链可变区基因、及κ轻链恒定区基因)从建构体11-1f4vk.pkn100上以限制酶切下来，其中限制酶ecori的切位点在位置1及位置2490(如图4所示)；接着，将所述切下来的片段透过独特的ecori(切位点在位置4297，如图5所示)连接到建构体11-1f4vhpg1d200中。所述连接反应会使超级载体构建体pg1kd200-11-1f4产生，且其会同时包含11-1f4嵌合抗体的重链及κ轻链。实施例4嵌合γ1/κ.11-if4全抗体在cos细胞中的瞬时表达嵌合11-if4抗体在cos细胞中能以两种方式进行瞬时表达，其中所述cos细胞是来自欧洲细胞培养物保存中心(europeancollectionofcellcultures，ecacc)：(i)透过共转染10μg的载体构建体11-1f4vk.pkn100及10μg的载体构建体11-1f4vh.pg1d200，且共重复进行两次的共转染；(ii)透过转染13μg的单一超载体构建体pg1kd200-11-1f4，且共进行五次超载体的转染。以下将详细描述转染的方法。cos细胞是培养在含有10％(v/v)胎牛血清(fetalcalfserum，fcs)、580μg/ml的左旋麸酰氨酸(l-glutamone)、及50units/ml的青霉素/50μg/ml链霉素(培养基)的dmem中；其中，所述细胞培养液是在150cm2的烧瓶中进行配制，直到所有成分皆混合均匀。将cos细胞培养到一定数量后，使用胰蛋白酶将贴附在细胞培养盘底部的cos细胞悬浮在细胞培养液中，并将所述细胞培养液平均分装在三个150cm2的烧瓶中，其中每个烧瓶中分别装有25ml新鲜的且已预热的培养培养液，接着再以桌上型离心机以250g离心五分钟后，将上清液移除后将cos细胞重新悬浮于6ml的细胞培养液中。接着，将cos细胞在5％的co2中于37℃培养一夜，并在培养细胞的第二天，在细胞仍保持指数成长的状态时收取细胞，并使最后每个烧瓶中含有约1×107个细胞；其中收取细胞的方式如下：使用如前所述方法，以胰蛋白酶将贴附在细胞培养盘底部的cos细胞悬浮在细胞培养液中，并以桌上型离心机以250g离心五分钟后，将上清液移除后以20ml的磷酸盐缓冲溶液清洗细胞后，以同样条件进行离心，并移除上清液后将cos细胞重新悬浮于足够量的磷酸盐缓冲溶液中，且最终溶液中的细胞浓度为1x107细胞/ml。接着，将700μl的所述经清洗过的cos细胞溶液转移至光析管中，并分别加入1μl的重链及1μl的kappa轻链表达载体dna(其中每个皆为10μg)、或加入13μg的超级载体构建体。接着，使用bio-rad设备将1900伏、25μf的电容脉冲传送到所述混合物中；对于每个转染的实验组以及不含dna的对照组(即其中的cos细胞在不存在任何dna的情况下进行电穿孔)重复进行所述脉冲；并同时建立一个先前表达的抗体作为阳性对照，以测试cos细胞的表达效率。在进行完电穿孔后，使cos细胞在室温下进行恢复10分，接着将其轻轻吸取后移到直径为10cm的组织培养盘中，所述组织培养盘中含有8ml的已预热的细胞培养液中，并在5％的co2中于37℃培养72小时；其中，所述细胞培养液是含有10％(v/v)不含γ-球蛋白的胎牛血清、580μg/ml的左旋麸酰氨酸、及50units/ml的青霉素/50μg/ml链霉素(培养基)的dmem。接着，在培养72小时后，收集各组cos细胞的细胞培养液的上清液，其中以离心方式除去细胞碎片，接着透过酵素免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)分析嵌合抗体的产生、以及c11-1f4抗体的抗原结合力。实施例5透过捕获elisa以定量嵌合γ1/κ11-1f4抗体以下将详细描述透过捕获elisa测定法，以定量存在于cos细胞上清液中的全部igg分子：透过山羊抗人igg的fcγ片段-特异性抗体，以捕获igg分子并将其固定在nunc-immunomaxisorbtm培养盘上，并通过抗人kappa轻链的过氧化物酶偶联的抗体进行igg抗体的检测。透过以下相同的方式在同一板上捕获及检测已知浓度的标准igg抗体，以产生用于计算igg浓度的标准曲线：在96孔免疫培养盘的每个孔中，均匀的涂覆100μl的等分试样的0.4μg/ml的山羊抗人igg抗体(所述抗体是以磷酸盐缓冲溶液进行稀释)，并在4℃下反应一夜，接着除去过量的涂覆溶液，并以200μl/孔的清洗缓冲溶液(含有0.1％聚山梨醇酯(tween)的1x磷酸盐缓冲溶液)将培养盘清洗三次。除了第b至g行的第2列以外，于所有培养孔中分配100μl的粒径筛析层析法(sizeexclusionchromatography，sec)缓冲液；其中，以溶于sec缓冲液中的人igg1/kappa抗体的1μg/ml溶液作为标准溶液，并将所述标准溶液以200μl/孔的量，加入于第b及c行的第2列的培养孔中。将经转染的cos细胞的细胞培养液以250g离心5分钟，并保存所述上清液。接着，将取自不含dna的对照组(在不含dna的情况下进行cos细胞的转染)的200μl细胞培养液上清液的等分试样移入第d行的第2列的培养孔中；并取200μl/孔的实验组细胞培养液上清液的等分试样移入第e、f、及g行的第2列的培养孔中。将第b至g行第2列的200μl的等分试样混合均匀后，从每个孔中取出100μl的溶液转移到第3列的相邻培养孔中，而所述对照组及实验组样品的2倍稀释溶液则继续进行相同的稀释过程至第11列，以完成一系列的标准品，接着将所有的样品在37℃下反应1小时后，将所有培养孔用200μl的等分试样的水溶性洗涤缓冲液清洗六次。接着，将山羊抗人κ轻链的过氧化物酶偶联物以粒径筛析层析法缓冲溶液中稀释5000倍，并于每个培养孔中加入100μl的所述稀释的偶联物，接着重复反应及清洗的步骤。接着，于每个培养孔中加入150μl的k-blue底物，并在25℃下于黑暗中反应10分钟后，于每个培养孔中加入50μl的redstop溶液以终止反应，并于655nm处读取光密度。实施例6嵌合11-1f4抗体的结合分析使用直接结合elisa测定法测试嵌合的11-1f4抗体与淀粉样蛋白原纤维的结合能力。合成的原纤维是由免疫球蛋白的轻链蛋白所形成的，并将其应用于使用“低结合性”聚苯乙烯培养盘(购自costar，编号#3474)的固态elisa的分析中，以监测抗体的反应能力。在将合成的原纤维披覆于培养盘之前，将质量为250μg的原纤维以披覆缓冲溶液(0.1％的牛血清白蛋白溶于ph7.5的磷酸盐缓冲溶液中)稀释至1ml；接着，使用tekmarsonicdisruptor超声探头对个样品以超声波处理20秒，其中功率设置为最大功率的40％，以获得最多由2-5个原型纤丝所组成的短纤维溶液。接着，将所述溶液稀释至5ml，并透过涡旋震荡仪将溶液充分的混合均匀，并等分到培养盘板的每孔中；其中，所述制备过程会在每个培养孔中产生浓度为50μg/ml的50μl的原纤维溶液。接着，透过将培养盘暴露在37℃的恒温培养箱中一夜进行干燥。接着，在制备培养盘的48小时内以如下方法进行elisa测定。透过在磷酸盐缓冲溶液中添加100μl的1％的牛血清白蛋白，并在室温下于振荡器上反应1小时，以进行培养孔的阻断。接着，将培养盘以含有0.05％聚山梨醇酯二十(tween20)(v/v)的磷酸盐缓冲溶液清洗共三次后，于培养盘的每个培养孔中加入50μl的c11-1f4溶液(溶于0.1％牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲溶液溶液的3μg/mk抗体)，并将培养盘在室温下于振荡器上作用1小时后，再次以前述方法清洗培养盘共安次，并使用生物素化的山羊抗小鼠igg抗体(购自sigma，编号#b-8774，抗重链及轻链)以完成结合的抗体的检测。结果对经成功修饰的vh及vk基因的序列分析结果显示正确的序列存在。经修饰的11-1f4vk及vh基因的详细地dna序列及氨基酸序列如图3及图4中所示。经修饰的vk及vh基因分别成功地被克隆到哺乳动物的表达载体pg1d200及pkn100中，以获得用于共转染于哺乳动物细胞中的建构体11-1f4vk、建构体pkn100、及建构体11-1f4vhpg1d200。构建体11-1f4vk.pkn100及构建体11-1f4vhpg1d200接着也被用于构建单个超级载体，即pg1kd200-11-1f4，其会在哺乳动物细胞中表达嵌合的11-1f4抗体。接着，测定来自ecacc的cos细胞中，共转染及超载体转染的嵌合11-1f4抗体的表达水平。结果显示，相较于共转染建构体11-1f4vk.pkn100及建构体11-1f4vhpg1d200的cos细胞(2820ng/ml)，转染超级载体pg1kd200-11-1f4(10326ng/ml)的cos细胞中所观察到的11-1f4抗体的表达水平较高3.7倍。于表达及定量后，透过直接结合elisa测试嵌合的11-1f4抗体与标靶抗原(由nci所提供的淀粉样原纤维)的结合能力；其中，结合elisa的结果如图8所示。进行两个最佳的来自不同转染超载体pg1kd200-11-1f4的cos细胞的培养液上清液、及一个来自共转染的cos细胞的培养液上清液的elisa测试。此结果显示，嵌合的11-1f4抗体会以比鼠类等效抗体更高的亲和力与淀粉样蛋白原纤维进行结合，而所述结果是令人惊讶且出乎意料的，因为通常情况下，嵌合抗体具有与原始鼠抗体相当的结合亲和力。不受特定机制所束缚，发明人相信，将11-1f4鼠类v区与人γ1/κc区进行结合以产生嵌合11-1f4抗体的最终效果可能会产生更高的亲和力。在本专利说明书及权利要求的描述中，单词“包含”(comprise)及所述单词的变异体，例如“包含”(comprises)及“包含”(comprising)并不会排除其它的特征、添加物、组成分、整数、或步骤，而是相反的，除非另有说明以明确指出，这些单词的范围应广义地解释为具有包容性的含义，而不是排他性的含义。尽管本发明的组合物及方法已经透过本案说明性实施例的方式中进行描述，但是应当理解为，本发明不限于此，并且如本领域技术人员所公知的，在不脱离由所附申请专利范围要求限定的本发明的教导的情况下，可以做出各种变化。当前第1页12