和厚朴酚及厚朴酚在制备MCR-1酶抑制剂中的应用的制作方法

本发明公开了和厚朴酚及厚朴酚的一种新的用途，涉及和厚朴酚及厚朴酚在制备mcr-1酶抑制剂中的医用用途，属于医学制药技术领域。

背景技术：

细菌耐药性的日益增长对全球公共卫生造成了严重的威胁，导致许多治疗上较为困难的细菌性感染病例的出现，其中以产碳青霉烯酶的革兰氏阴性肠杆菌感染所致的病情较为严重，随着超级耐药菌的出现，以及对耐药菌治疗失败和较高的死亡率，给治疗院内感染、特别是治疗icu感染带来了更大的压力。多粘菌素是抗生素治疗耐药菌感染的“最后一道防线”，但是mcr-1的发现导致耐多粘菌素和耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌所引起的感染面临无药可用的情况。目前尚无有效的mcr-1抑制剂的报道，因此，开发新的安全有效的药物具有十分重要的意义。

和厚朴酚及厚朴酚主要来源为木兰科落叶乔木植物厚朴或凹叶厚朴的干皮、根皮及枝皮，具有明显的、持久的中枢性肌肉松弛，中枢神经抑制作用，抗炎，抗病原微生物，抗溃疡，抗氧化，抗肿瘤等药理作用，和厚朴酚除了上述作用外还具有抗衰老，降低胆固醇等药理作用，二者在临床医学中均具有重要地位。

经检索未见和厚朴酚及厚朴酚在制备mcr-1抑制剂中的相关报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种和厚朴酚及厚朴酚在制备mcr-1酶抑制剂中的医用用途，公开了和厚朴酚及厚朴酚能够抑制mcr-1酶的活性，恢复多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌的杀菌活性。

本发明所述的和厚朴酚，其分子式：c18h18o2，分子量：266.33；厚朴酚，其分子式：c18h18o2，分子量：266.33。

本发明通过棋盘法最小抑菌浓度试验和时间-杀菌曲线法验证和厚朴酚及厚朴酚能够抑制mcr-1酶的活性并恢复多粘菌素对mcr-1阳性肠杆菌的抗菌活性。进一步通过建立小鼠大腿肌肉感染模型证明和厚朴酚及厚朴酚联用多粘菌素对mcr-1阳性肠杆菌造成的感染具有良好的治疗效果。

本发明的积极效果在于：

提供了和厚朴酚及厚朴酚在制备mcr-1酶抑制剂中的新医用用途，公开了和厚朴酚及厚朴酚能够抑制mcr-1酶的活性，恢复多粘菌素对mcr-1肠杆菌的杀菌活性。体内实验中，和厚朴酚及厚朴酚联用多粘菌素对表达mcr-1的细菌性感染，尤其是对mcr-1阳性肠杆菌引起的感染具有良好的治疗效果，具有广泛的医用用途。

附图说明

图1为本发明和厚朴酚联合多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的时间-杀菌曲线；

图2为本发明厚朴酚联合多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的时间-杀菌曲线；

图3为本发明和厚朴酚联合多粘菌素对小鼠大腿肌肉感染的菌落定植结果；

图4为本发明厚朴酚联合多粘菌素对小鼠大腿肌肉感染的菌落定植结果。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

和厚朴酚及厚朴酚作为mcr-1酶抑制剂用于药学上可接受的任何载体。

实施例2

和厚朴酚及厚朴酚作为mcr-1酶抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。

实施例3

和厚朴酚及厚朴酚作为mcr-1酶抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病,特别是mcr-1阳性肠杆菌引起的感染。

试验例1

最小抑菌浓度试验

于96孔无菌微孔板内按棋盘法进行和厚朴酚、多粘菌素单用及二者联用抗产mcr-1大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌活性实验，确定二者单独应用及联合应用mic值，计算部分抑菌浓度指数(fic)。fic=mic(多粘菌素联合)/mic(多粘菌素单用)+mic(和厚朴酚/厚朴酚联合)/mic(和厚朴酚/厚朴酚单用)，结果见表1和表2：

表1和厚朴酚联用多粘菌素对不同菌株的mic及fic值

表2厚朴酚联用多粘菌素对不同菌株的mic及fic值

结论：

和厚朴酚或厚朴酚单独应用不具备抑菌效果，但是和厚朴酚或厚朴酚与多粘菌素联用能够降低多粘菌素对表达mcr-1工程菌株e.colibl21(de3)(pet28a-mcr-1)的mic值，具有明显的协同作用。而在不表达mcr-1工程菌株e.colibl21(de3)(pet28a)中，和厚朴酚或厚朴酚与多粘菌素联用无任何协同作用，这一结果表明和厚朴酚或厚朴酚是一种有效的mcr-1抑制剂。与上述研究结果相一致，和厚朴酚与多粘菌素联用能够降低多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的mic值8倍，对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌的mic值16倍。厚朴酚与多粘菌素联用能够降低多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的mic值4倍，对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌mic值4倍。fic数值表明和厚朴酚或厚朴酚与多粘菌素在mcr-1阳性菌株中具有协同作用。

试验例2

时间-杀菌曲线试验

取mcr-1阳性大肠杆菌分离株过夜培养物，调整至5×l0⁷cfus/ml，备用。取无菌试管分为4组（空白对照组、2μg/ml多粘菌素b组、32μg/ml和厚朴酚/厚朴酚组和32μg/ml和厚朴酚/厚朴酚联用2μg/ml多粘菌素b组），每组标记为1、3、5、7h，所有试管内均加入lml高压灭菌的lb培养基，之后，每管内均加入10μl调整后的菌液，使每个试管内的菌液浓度为5×10⁵cfus/ml。其中2μg/ml多粘菌素b组、32μg/ml和厚朴酚/厚朴酚组及32μg/ml和厚朴酚/厚朴酚联用2μg/ml多粘菌素b组分别加入对应用量的抗生素及抑制剂，混匀之后立即将无抗生素对照组的菌液进行涂板计数，作为0h的菌落数。之后，每1、3、5及7h分别取对应试管内的菌液,涂板计数，绘制时间-杀菌曲线（附图1和2）。

结论：和厚朴酚或厚朴酚联用多粘菌素能够在1h（3h）内彻底杀死mcr-1阳性大肠杆菌。

试验例3

小鼠大腿肌肉感染的菌落定植实验

小鼠肺炎克雷伯菌大腿肌肉感染模型

balb/c小鼠（雌性，约20g）保定后，经大腿内侧注射mcr-1阳性肺炎克雷伯悬液（2×10⁷cfus），建立小鼠大腿肌肉感染模型。

菌落定植实验

小鼠大腿内侧肌肉注射mcr-1阳性肺炎克雷伯菌后，分别皮下注射5mg/kg（50μl）的溶解于ddh2o的多粘菌素b、50mg/kg（50μl）的和厚朴酚/厚朴酚溶解于dmso溶液，以及多粘菌素b（5mg/kg）联用和厚朴酚/厚朴酚（50mg/kg），阳性对照组给与50μl的dmso空白溶剂。所有组小鼠每隔8h皮下给药一次，共三次。给药36h后处死小鼠并取大腿肌肉称重，匀浆，稀释后涂板计数，结果见附图3和4。

结论：

经和厚朴酚/厚朴酚联用多粘菌素b治疗后，显著降低了小鼠大腿肌肉的菌落定植数，和厚朴酚/厚朴酚或多粘菌素b单独治疗组未见显著效果。