抗-PD-1抗体组合物的制作方法
本发明涉及抗体的药物制剂领域。具体地，本发明涉及抗-pd-1抗体制剂及其药物制备和用途。
背景技术：
抗体治疗剂通常被定期施用，并且一般涉及通过注射的数个mg/kg剂量。肠胃外递送是治疗性抗体的常见施用途径。对于肠胃外施用，相对高浓度的抗体制剂是希望的，以最小化每个剂量的体积。
由于涉及蛋白质的物理和化学稳定性，以及蛋白质制剂的制备、储存和递送的问题，开发高度浓缩的蛋白质制剂会是一个挑战。抗体制剂粘度的增加会引起从药物制备到药物递送至患者的问题。已进行了各种尝试来研究降低粘度的试剂对高度浓缩的水性含蛋白质制剂的作用。
已显示抗-pd-1抗体可用于治疗过度增殖性疾病，包括1型癌症。需要具有合适粘度的抗-pd-1抗体的稳定、高浓度抗体制备，以满足患有由pd-1介导的病症(诸如癌症)的患者的医疗需求。
技术实现要素：
提供了包含抗-pd-1抗体和能够降低包含所述抗体的制剂的粘度的赋形剂的组合物。已证明某些制剂有效降低粘度。有利地，本文提供的组合物证明适于对于用于治疗性处理的药物产品达到浓度大于100mg/ml的粘度行为。
本文提供的是在溶液中支持高浓度的生物活性抗体并且适于肠胃外施用的药物组合物，所述肠胃外施用包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内或皮内注射。组合物包含抗-pd-1抗体、二糖、缓冲剂、螯合剂和聚山梨酯。在一些实施方案中，组合物的ph可以在约4.5至5.5之间。在一些实施方案中，优选地，组合物具有约1厘泊(cp)至约20cp之间的粘度。在一些实施方案中，优选的施用途径是皮下注射。
在一些实施方案中，组合物可以包含约100mg/ml至约200mg/ml之间的抗-pd-1抗体、二糖、缓冲剂、螯合剂和聚山梨酯或基本上由约100mg/ml至约200mg/ml之间的抗-pd-1抗体、二糖、缓冲剂、螯合剂和聚山梨酯组成，并且具有约4.5至约5.5的ph。在一些实施方案中，所述组合物可以基本上由约150mg/ml的抗-pd-1抗体、二糖、缓冲剂、螯合剂和聚山梨酯组成，并且具有约5.0的ph。
在一些实施方案中，组合物不包含抗氧化剂。在一些实施方案中，组合物不包含甲硫氨酸，诸如不限于，l-甲硫氨酸或其药学可接受的盐。在一些实施方案中，组合物不包含精氨酸。
在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有小于约50cp，小于约40cp，小于约30cp或小于约20cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约5至约50cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约5至约40cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约5至约30cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约5至约20cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约10至约20cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约14至约16cp的粘度。在一些实施方案中，组合物可以在20℃具有约14cp的粘度。
在一些实施方案中，聚山梨酯的浓度可以为约0.01至约0.3mg/ml。在一些实施方案中，聚山梨酯的浓度为约0.2mg/ml。在一些实施方案中，聚山梨酯是聚山梨酯80。
在一些实施方案中，二糖可以是海藻糖。在一些实施方案中，海藻糖是海藻糖二水合物。在一些实施方案中，海藻糖的浓度可以为约1mg/ml至约100mg/ml。在一些实施方案中，海藻糖的浓度为约84mg/ml。在其他实施方案中，海藻糖的浓度为约50mg/ml。
在其他实施方案中，二糖试剂可以是蔗糖。在一些实施方案中，蔗糖的浓度可以为约1mg/ml至约100mg/ml。在一些实施方案中，蔗糖的浓度为约50mg/ml。
在一些实施方案中，缓冲剂可以是组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度可以为约1.0至约30mm。在一些实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度为约20mm组氨酸。
在其他实施方案中，缓冲剂可以是乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，乙酸盐缓冲剂的浓度可以为约1.0至约30mm。在一些实施方案中，乙酸盐缓冲剂的浓度为约20mm乙酸盐。
在一些实施方案中，螯合剂可以是edta，包括例如不限于edta二钠和edta二钠二水合物。在一些实施方案中，edta的浓度可以为约0.01至约0.3mg/ml。在一些实施方案中，edta的浓度可以为约0.01mg/ml、约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15mg/ml、约0.2mg/ml、约0.25mg/ml或约0.3mg/ml。在一些实施方案中，edta的浓度为约0.04、约0.045或约0.05mg/ml。
在一些实施方案中，抗体浓度可以在约100mg/ml至约150mg/ml之间。在一些实施方案中，抗体浓度可以为约130mg/ml、约135mg/ml和约140mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为约150mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为约120mg/ml。
在一些实施方案中，组合物可以进一步包含精氨酸。在一些实施方案中，精氨酸的浓度为约25mm至约300mm之间，优选约50mm、约100mm、约150mm、约200mm或约250mm。
在一些实施方案中，组合物可进一步包含脯氨酸。在一些实施方案中，脯氨酸的浓度为约25mm至约300mm之间、优选约100mm或约200mm。
在一些实施方案中，组合物基本上由以下组成：约150mg/ml的抗-pd-1抗体；约20mm组氨酸缓冲剂；约84mg/ml海藻糖二水合物；约0.2mg/mlps80；和约0.05mg/mledta。在一些实施方案中，组合物具有5.0+/-0.5的ph。
在一些实施方案中，所述组合物基本上由以下组成：约150mg/ml的抗-pd-1抗体；约20mm组氨酸缓冲剂；约100mm精氨酸hcl，约50mg/ml海藻糖二水合物；约0.2mg/mlps80；和约0.05mg/mledta。在一些实施方案中，组合物具有5.0+/-0.5的ph，以及在20℃约10cp至约16cp的粘度。在一些实施方案中，组合物在20℃具有约15cp的粘度。
在一些实施方案中，组合物基本上由以下组成：约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约145mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、约150mg/ml、约151mg/ml或约152mg/ml的抗体，约20mm组氨酸缓冲剂，约84mg/ml海藻糖二水合物，约0.2mg/mlps80，约0.05mg/mledta，并且组合物的ph为5.0+/-0.5。在一些实施方案中，组合物在20℃具有约10cp至约16cp的粘度。
在一些实施方案中，组合物基本上由以下组成：约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约145mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、约150mg/ml、约151mg/ml或约152mg/ml的抗-pd-1抗体，约20mm组氨酸缓冲剂，约84mg/ml海藻糖，约0.2mg/mlps80，约0.05mg/mledta，并且组合物的ph为5.0+/-0.5。
在一些实施方案中，所述组合物基本上由以下组成：约150mg/ml抗-pd-1抗体，约20mm组氨酸缓冲剂，约84mg/ml海藻糖二水合物，约0.2mg/mlps80，约0.05mg/mledta，并且组合物的ph为5.0+/-0.5。
在一些实施方案中，抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人igg1、igg2、igg2δa、igg3、igg4、igg4δb、igg4δc、igg4s228p、igg4δbs228p、和igg4δcs228p亚类。在一些实施方案中，抗体是igg4同种型，并且包含稳定的铰链，例如s228p。
在一些实施方案中，抗体可以是pf-06801591、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、或斯巴达珠单抗(spartalizumab)。在其他实施方案中，抗体可以是pf-06801591、纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、或斯巴达珠单抗的抗原结合部分。
在一些实施方案中，抗体可包含重链可变区(vh)，其包含seqidno：2所示的vh序列的vh互补决定区一(cdr1)、vhcdr2和vhcdr3；和/或轻链可变区(vl)，其包含seqidno：3所示的vl序列的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在一些实施方案中，vhcdr1包含seqidno：4所示的氨基酸序列，vhcdr2包含seqidno：5所示的氨基酸序列，并且vhcdr3包含seqidno：6所示的氨基酸序列，vlcdr1包含seqidno：7所示的氨基酸序列，vlcdr2包含seqidno：8所示的氨基酸序列，vlcdr3包含seqidno：9所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，vh区包含seqidno：2中所示的氨基酸序列，或在不在cdr之内的残基中具有一个或几个保守氨基酸取代的变体，和/或vl区包含seqidno：3所示的氨基酸序列或其在不在cdr之内的氨基酸中具有一个或几个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗体可以包含与seqidno：2所示的重链可变区氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，和与seqidno：3所示的轻链可变区氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体可包含：包含seqidno：10所示氨基酸序列的可变重链序列和包含seqidno：11所示氨基酸序列的可变轻链序列。在一些实施方案中，抗体包含由具有atcc收录号pta-121183的表达载体产生的vh区。在一些实施方案中，抗体包含由具有atcc收录号pta-121182的表达载体产生的vl区。在一些实施方案中，抗体是特异性结合pd-1并与如本文所述抗体的相同pd-1表位竞争和/或结合至如本文所述抗体的相同pd-1表位的抗体。
在一些实施方案中，组合物基本上由以下组成：约150mg/ml的pf-06801591、约20mm组氨酸缓冲剂、约84mg/ml海藻糖二水合物、约0.2mg/mlps80、和约0.05mg/mledta；其中所述组合物的ph为5.0+/-0.1并且不包含甲硫氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，所述组合物基本上由以下组成：约150mg/ml的纳武单抗、约20mm组氨酸缓冲剂，约84mg/ml海藻糖二水合物、约0.2mg/mlps80和约0.05mg/mledta；其中所述组合物的ph为5.0+/-0.1并且不包含甲硫氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，组合物基本上由以下组成：约150mg/ml的派姆单抗、约20mm组氨酸缓冲剂、约84mg/ml海藻糖二水合物、约0.2mg/mlps80和约0.05mg/mledta；其中所述组合物的ph为5.0+/-0.1并且不包含甲硫氨酸或精氨酸。
在一些实施方案中，组合物可以不是冻干的。在其他实施方案中，组合物可以是冻干的。
本文还提供了用于在对象中治疗病况的方法，其中所述方法包括：向有此需要的对象施用有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述病况是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：胃部癌(gastriccancer)、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、鼻咽癌、胸腺癌、上皮癌、上皮性卵巢癌、唾液腺癌症(salivarycancer)、肝癌、胃癌(stomachcancer)、甲状腺癌、肺癌(包括例如不限于非小细胞肺癌)、卵巢癌、输卵管癌、乳腺癌(包括例如不限于三阴性乳腺癌)、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、口腔癌、皮肤癌、腹膜癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，对象是患有局部晚期或转移性黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(schnc)、卵巢癌、肉瘤或复发性或难治性经典霍奇金淋巴瘤(chl)的先前治疗过的成年患者。在一些实施方案中，癌症可以是铂抗性和/或铂难治性癌症，例如如铂抗性和/或难治性卵巢癌、铂抗性和/或难治性乳腺癌、或铂抗性和/或难治性肺癌。
在一些实施方案中，本文提供的抗-pd-1抗体药物组合物以约25mg至约1000mg之间的剂量施用，优选约50mg、约100mg、约125mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约525mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg或约800mg。在一些实施方案中，组合物以约0.5mg/kg至约15mg/kg之间的剂量施用，优选约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约3.0mg/kg、约5.0mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，组合物每7、14、21或28天施用一次。在一些实施方案中，组合物是皮下施用的。在其他实施方案中，组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，组合物以单次2ml皮下注射施用。在一些实施方案中，组合物每三周施用一次。在一些实施方案中，组合物每四周施用一次。在一些实施方案中，组合物以300mg的剂量皮下施用。在一些实施方案中，组合物每28天一次以300mg的皮下剂量施用。
本文还提供了在患有肿瘤的对象中抑制肿瘤生长或进展的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的药物组合物。
本文还提供了在对象中抑制或预防癌细胞转移的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的本文所述的药物组合物。
本文还提供了在患有表达pd-1肿瘤的对象中诱导肿瘤消退的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，本文的抗体可以在对象中肠胃外施用。在一些实施方案中，对象是人。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括施用有效量的至少一种其他治疗性药剂。在一些实施方案中，治疗性药剂是例如克唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(palbociclib)、他拉唑帕尼(talazoparib)、抗-ctla4抗体、抗-4-1bb抗体、抗-ox40抗体、第二种pd-1抗体、car-t细胞和化疗剂。
本文还提供了本文提供的任何抗-pd-1抗体药物组合物在制备用于在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。
还提供了抗-pd-1抗体药物组合物，其用于在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长或进展。在一些实施方案中，所述癌症为例如不限于胃部癌(gastriccancer)、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌症(salivarycancer)、肝癌、胃癌(stomachcancer)、甲状腺癌、肺癌(包括例如不限于非小细胞肺癌)、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。
本文还提供增强疫苗的免疫原性或治疗效果的方法，所述疫苗用于在哺乳动物，特别是人中治疗癌症，所述方法包括向接受所述疫苗的哺乳动物施用有效量的由本公开提供的抗-pd-1抗体组合物。
本文还提供用于在哺乳动物，特别是人中治疗癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用(1)能够引起针对癌细胞的免疫应答的有效量的疫苗，和(2)有效量的由本公开提供的抗-pd-1抗体药物组合物。在一些实施方案中，组合物以约125至约300mg的皮下双侧剂量施用。在一些实施方案中，组合物以300mg的皮下双侧剂量施用。
附图简述
图1描绘比较在不同ph值下的抗-pd-1抗体制剂的粘度的图。
图2描绘比较具有不同浓度的精氨酸hcl的抗-pd-1抗体制剂的粘度的图。
图3描绘比较在不同ph值下的抗-pd-1抗体制剂的粘度的图。
图4描绘比较在添加或不添加脯氨酸下具有100mm精氨酸hcl的抗-pd-1抗体制剂的粘度的图。
图5描绘比较抗-pd-1抗体制剂7和8的粘度的图。
图6描绘显示在抗-pd-1抗体mab7中的聚糖异质性的图。
图7描绘显示制剂7中各种抗-pd-1抗体的热性质的图。
发明详述
本文公开具有降低的粘度的组合物。有利地，所述组合物在溶液中稳定地支持高浓度的生物活性抗体，并且适合于肠胃外施用，包括或皮下、静脉内、肌内、腹膜内或皮内注射。
通用技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术内。此类技术在文献中有充分的解释，诸如molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition(sambrook等，1989)coldspringharborpress；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait，ed.，1984)；methodsinmolecularbiology，humanapress；cellbiology：alaboratorynotebook(j.e.cellis，ed.，1998)academicpress；animalcellculture(r.i.freshney，ed.，1987)；introductiontocellandtissueculture(j.p.mather和p.e.roberts，1998)plenumpress；cellandtissueculture：laboratoryprocedures(a.doyle，j.b.griffiths，andd.g.newell，eds.，1993-1998)j.wileyandsons；methodsinenzymology(academicpress，inc.)；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weir和c.c.blackwell，eds.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.miller和m.p.calos，eds.，1987)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等，eds.，1987)；pcr：thepolymerasechainreaction，(mullis等，eds.，1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coligan等，eds.，1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(wiley和sons，1999)；immunobiology(c.a.janeway和p.travers，1997)；antibodies(p.finch，1997)；antibodies：apracticalapproach(d.catty.，ed.，irlpress，1988-1989)；monoclonalantibodies：apracticalapproach(p.shepherd和c.dean，eds.，oxforduniversitypress，2000)；usingantibodies：alaboratorymanual(e.harlow和d.lane(coldspringharborlaboratorypress，1999)；theantibodies(m.zanetti和j.d.capra，eds.，harwoodacademicpublishers，1995)。
定义
除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：术语“分离的分子”(其中所述分子是例如多肽、多核苷酸或抗体)是这样的分子，其依据其来源或衍生的来源而(1)不与在其天然状态下伴随其的天然缔合的组分缔合，(2)基本上没有来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然中不存在。因此，化学合成的分子或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中表达的分子将与其天然相关组分“分离”。使用本领域众所周知的纯化技术，通过分离也可以使分子基本没有天然相关组分。分子纯度或均质性可通过本领域众所周知的多种手段检测。例如，多肽样品的纯度可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用本领域众所周知的技术的可视化多肽的凝胶染色来测定。为了某些目的，可以通过使用hplc或本领域众所周知的其他用于纯化的手段来提供更高的分离度(resolution)。
如本文所用，术语“制剂”或“组合物”在其涉及抗体时，是指描述与药学可接受的赋形剂组合的抗体，所述药学可接受的赋形剂包含至少一种张度剂、至少一种缓冲剂、至少一种螯合剂、至少一种表面活性剂，其中ph是定义的。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式的制品。
“药学可接受的赋形剂”(载具，添加剂)是可以安全地施用于对象以提供有效剂量的所用活性成分的那些。如本文所用的术语“赋形剂”或“载体”是指惰性物质，其通常用作用于药物的稀释剂、载具、防腐剂、粘合剂或稳定剂。如本文所用，术语“稀释剂”是指药学可接受的(对人施用是安全且无毒的)溶剂，并且可用于制备本文的液体制剂。示例性稀释剂包括但不限于无菌水和注射用抑菌水(bwfi)。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点与靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且涵盖，除非另有说明，其与完整抗体竞争特异性结合的任何其抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。抗原结合部分包括，例如，fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、结构域抗体(dab，例如鲨鱼和骆驼抗体)、包括互补决定区(cdr)的片段、单链可变片段抗体(scfv)、maxibodies、minibodies、细胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-nar和bis-scfv，以及包含免疫球蛋白的至少一部分(其足以使特定抗原与多肽结合)的多肽。抗体包括任何类别的抗体，诸如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些的几个可以进一步分为亚类(同种型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地或组合地。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(cdr)(也称为高变区)连接的四个框架区(fr)组成，并且促成抗体的抗原结合位点的形成。如果需要对象可变区的变体，特别是具有在cdr(即在框架区中)之外的氨基酸残基中的取代，则可以通过比较对象可变区与包含和对象可变区相同的经典分类中的cdr1和cdr2序列的其他抗体的可变区来鉴定合适的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代(chothia和lesk，jmolbiol196(4)：901-917，1987)。
在某些实施方案中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成cdr的明确描述和包含抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种(诸如x射线晶体学)来完成。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或估计cdr区。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或估计cdr区。此类方法的示例包括但不限于kabat定义、chothia定义、abm定义、接触定义和构象定义。
kabat定义是用于编号抗体中残基的标准，并且通常用于鉴定cdr区。参见例如，johnson&wu，2000，nucleicacidsres.，28：214-8。chothia定义类似于kabat定义，但chothia定义考虑了某些结构环区的位置。参见例如，chothia等，1986，j.mol.biol.，196：901-17；chothia等，1989，nature，342：877-83。abm定义使用由oxfordmoleculargroup生产的对抗体结构建模的计算机程序的集成套件。参见例如，martin等，1989，procnatlacadsci(usa)，86：9268-9272。“abmtm，acomputerprogramformodelingvariableregionsofantibodies，”oxford，uk；oxfordmolecular，ltd。abm定义使用知识数据库和从头算方法的组合(诸如samudrala等，1999，“abinitioproteinstructurepredictionusingacombinedhierarchicalapproach，”inproteins，structure，functionandgeneticssuppl.，3：194-198所描述的那些)从一级序列中模拟抗体的三级结构。接触定义基于可获取复杂晶体结构的分析。参见，例如，maccallum等，1996，j.mol.biol.，5：732-45。在本文称为cdr的“构象定义”的另一种方法中，cdr的位置可以是其被鉴定为对抗原结合起焓贡献的残基。参见，例如，makabe等，2008，journalofbiologicalchemistry，283：1156-1166。还有其他cdr边界定义可能并不严格遵循上述方法之一，但仍会与kabatcdr的至少一部分重叠，虽然它们可以根据特定残基或残基组不会显著影响抗原结合的预测或实验发现来被缩短或延长。如本文所用，cdr可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)所定义的cdr。本文使用的方法可以利用这些方法中的任何一种所定义的cdr。对于包含一个以上cdr的任何给定实施方案，可以根据kabat、chothia、扩展(extended)、abm、接触和/或构象定义中的任一个来定义cdr。
如本领域中已知的，抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，单独地或组合地。
如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为从基本上均质的抗体群体获得的，且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由kohler和milstein，1975，nature256：495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组dna方法(诸如美国专利号4,816,567中描述的)来制备。单克隆抗体也可以从使用例如mccafferty等，1990，nature348：552-554所描述的技术所生成的噬菌体文库而分离。如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠科)抗体的形式，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的其片段(诸如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的cdr的残基被具有期望的特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的cdr的残基替换。人源化抗体可包含在受体抗体或导入的cdr或框架序列中均未发现的，但被包括在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。
“人抗体”是这样的抗体，其拥有对应于由人产生的抗体和/或使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术已经被制备的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体的这种定义包括包含至少一个人的重链多肽或至少一个人的轻链多肽的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中并且特别是在cdr3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”没有意图包括其中源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列已被移至人框架序列上的抗体。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列源于一个物种并且恒定区序列源于另一物种的抗体，例如其中可变区序列源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠科)抗体的形式，所述非人抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的其片段(诸如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合序列)。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(cdr)的残基被具有期望的特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的cdr的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或导入的cdr或框架序列中均未发现的，但被包括在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个并且通常是两个可变区，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些，以及所有或基本上所有的fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。其他形式的人源化抗体具有一个或多个相对于原始抗体有所改变的cdr(cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2或cdrh3)，其也称为“源于”原始抗体的一个或多个cdr的一个或多个cdr。
如本文所用，术语“mab7”用于指抗-pd-1抗体，其包含分别示于seqidno：2和seqidno：3的重链和轻链可变区的氨基酸序列。
mab7重链可变区氨基酸序列：
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywinwvrqapgqglewmgniypgssltnynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarlstgtfaywgqgtlvtvss(seqidno：2)
mab7轻链可变区氨基酸序列：
divmtqspdslavslgeratinckssqslwdsgnqknfltwyqqkpgqppklliywtsyresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndyfyphtfgggtkveik(seqidno：3)
mab7的产生和表征在wo2016/092419的实施例中描述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，术语“mab7”是指由(a)保藏号为atccno.pta-121182的编码mab7轻链可变区的多核苷酸，和(b)保藏号为atccno.pta-121183的编码mab7重链可变区的多核苷酸而编码的免疫球蛋白。
术语“表位”是指能够在一个或多个抗体的抗原结合区被抗体识别并结合的分子的那部分。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的表面分组组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性或构象的。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白质内的非连续多肽(或氨基酸)，对表位具有特异性的抗体与之结合。如本文所用，术语“抗原表位”定义为如通过本领域众所周知的任何方法(例如通过常规免疫测定法)所确定的抗体可以与之特异性结合的抗原的一部分。一旦确定抗原上期望的表位，就可以例如使用本说明书中描述的技术生成针对该表位的抗体。可选地，在发现过程中，抗体的生成和表征可以阐明有关期望的表位的信息。从该信息，然后可以针对结合相同的表位来竞争性地筛选抗体。实现此的一种方法是进行竞争和交叉竞争研究，以发现与另一个竞争或交叉竞争地结合pd-1的抗体，例如，竞争与抗原的结合的抗体。
如本文所用，术语“分离的抗体”或“纯化的抗体”是指依据它的起源或衍生的来源具有以下一至四项的抗体：(1)不与在其天然状态下伴随其的天然缔合的组分缔合，(2)没有来自相同物种的其他蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然中不存在。
当至少约60％至75％的样品表现出单一种类的抗体时，抗体是“基本上纯的”，“基本上均质的”或“基本上纯化的”。基本上纯的抗体通常可以包含抗体样品的约50％、60％、70％、80％或90％w/w，更通常为约95％、且优选将超过99％纯。抗体纯度或均质性可以通过本领域众所周知的多种手段进行测试，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或hplc。
术语“抗体”是指与靶标结合并防止或降低该靶标的生物学效应的抗体。在一些实施方案中，该术语可以表示防止与其结合的靶标例如pd-1进行生物学功能的抗体。
与表位“优先结合”或“特异性结合”(本文可互换使用)的抗体是本领域众所周知的术语，并且确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质的反应或缔合比其与其他细胞或物质相比更频繁，更迅速，更具有持久性和/或更具有亲和力，则该分子被认为表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体以比其结合其他物质更具有亲和力、活动性(avidity)、更容易和/或更具有持久性的结合，则其与靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性或优先结合pd-1表位的抗体是与其结合其他序列相比更具有亲和力、活动性、更容易和/或更具有持久性的结合该表位序列的抗体。通过阅读该定义也应理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。这样，“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管可以包括)排他性结合。通常，但并非必须，提及结合是指优先结合。
如本文所用，抗体的“免疫特异性”结合是指在抗体的抗原结合位点和该抗体识别的特异性抗原之间发生的抗原特异性结合相互作用(即，抗体在elisa或其他免疫测定中与蛋白质反应，并且不会与无关蛋白质可检测地反应)。
本文中针对抗体所用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部分，以与第二抗体或其抗原结合部分的结合足够类似的方式结合表位，使得与不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比，在存在第二抗体的情况下第一抗体与其同源表位(cognateepitope)的结合的结果可检测地降低。可选的其中在第一抗体的存在下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低可以但并非必须如此。即，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而该第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，当每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合时，无论在相同，更大或更小程度上，都称抗体对于结合其各自表位彼此“交叉竞争”。本发明涵盖竞争性抗体和交叉竞争性抗体二者。无论发生这种竞争或交叉竞争的机制是什么(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分的结合)，基于本文提供的教导，本领域技术人员应理解，这种竞争性和/或交叉竞争性抗体被涵盖并且可用于本文公开的方法。
如本文所用，术语“pd-1”是指任何形式的pd-1及其变体，其保留至少一部分pd-1活性。除非另外指出，例如通过具体提及人pd-1，否则pd-1包括所有哺乳动物物种(例如人、犬、猫、马和牛)的天然序列pd-1。一种示例性人pd-1被发现为uniprot收录号q15116(seqidno：1)。
mqipqapwpvvwavlqlgwrpgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl(seqidno：1)。
如本文所用，“抗-pd-1抗体”是指能够抑制pd-1的生物学活性和/或由pd-1介导的下游事件的抗体。抗-pd-1抗体涵盖这样的抗体，其阻断、对抗、限制(suppress)或降低pd-1生物活性(至包括显著地的任何程度)，包括pd-1介导的下游事件，诸如pd-l1结合和下游信号传导、pd-l2结合和下游信号传导、抑制t细胞增殖、抑制t细胞活化、抑制ifn分泌、抑制il-2分泌、抑制tnf分泌、诱导il-10和抑制抗肿瘤免疫应答。为了本发明的目的，将明确地理解，术语“抗-pd-1抗体”(可互换地称为“pd-1抗体”)涵盖所有先前鉴定的术语、标题以及功能状态和特征，其中pd-1本身、pd-1的生物学活性或生物学活性的后果在任何有意义的程度被基本上消除，降低或中和的。在一些实施方案中，抗-pd-1抗体结合pd-1并上调抗肿瘤免疫应答。本文提供了抗-pd-1抗体的实例。
术语“相同性”是指两个氨基酸序列或两个核酸序列的“相同性”百分比。相同性百分比通常通过出于最佳比较目的而比对序列(例如，可以在第一序列中引入空位以与第二序列最佳比对)，并比较相应位置的氨基酸残基或核苷酸来确定。“最佳比对”是导致最高相同性百分比的两个序列的比对。通过比较序列内相同氨基酸残基或核苷酸的数目来确定相同性百分比(即，相同性％＝相同位置数目/位置总数目×100)。
可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成两个序列之间的相同性百分比的确定。用于比较两个序列的数学算法的一个示例是karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268的算法，其在karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：5873-5877中所修改。altschul，etal(1990)j.mol.biol.215：403-410的nblast和xblast程序已经并入这样的算法。可以用nblast程序，得分＝100，字长＝12进行blast核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质检索可以用xblast程序，得分＝50，字长＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如altschul等(1997)nucliecacidsres.25:3389-3402中所描述的gappedblast。可选地，psi-blast可用于进行迭代检索，其检测分子之间(ld.)的远距离关系。当使用blast、gappedblast和psi-blast程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如xblast和nblast)。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个示例是myers和miller，cabios(1989)的算法。作为gcg序列比对软件包的一部分的align程序(2.0版)已并入这种算法。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括如torellis和robotti(1994)comput.appl.biosci.，10:3-5中描述的advance和adam，以及pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.85：2444-8中描述的fasta。fasta中，ktup是一个控制选项，用于设置检索的灵敏度和速度。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一项或多项：减少赘生性或癌性细胞的增殖(或破坏赘生性或癌性细胞)、抑制赘生性细胞的转移、缩小或减小肿瘤的大小、缓解癌症、减轻癌症引起的症状、提高患有癌症的那些的生活质量、减少治疗癌症所需的其他药物剂量、延缓癌症进展、治愈癌症和/或延长患有癌症的患者的存活。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益或期望的结果的量。在更具体的方面，有效量预防、减缓或改善疾病的症状，和/或延长所治疗的对象的存活。对于预防性用途，有益或期望的结果包括消除或降低风险，减少严重性或延迟疾病的发作，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，其并发症以及在疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减轻疾病(诸如例如癌症，包括但不限于，例如胃部癌(gastriccancer)、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌症(salivarycancer)、肝癌、胃癌(stomachcancer)、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤)的一种或多种症状，减少治疗疾病所需的其他药物剂量，增强另一种药物的效果，和/或延迟患者中癌症的进展。有效剂量可以以一次或多次施用而施用。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床环境中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物结合而实现。因此，可以在施用一种或多种治疗药剂的上下文中考虑“有效剂量”，并且可以认为单一药剂以有效剂量给予如果与一种或多种其他药剂一起时可以达到或达到期望的结果。
如本文所用，用于治疗目的的术语“对象”包括任何对象，并且优选是需要治疗目标病理病况例如自身免疫疾病的对象。为了预防的目的，所述对象是任何对象，并且优选是处于发展目标病理病况的风险中或倾向于发展目标病理病况的对象。术语“对象”旨在包括活生物体，例如原核生物和真核生物。对象的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的特定实施方案中，所述对象是人。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指核糖核苷酸亦或脱氧核苷酸的核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式，并且可以是单链和双链形式。除非另有说明，否则“多核苷酸”或“核酸”序列涵盖其互补序列。如本文所用，术语“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”是指基因组、cdna或合成来源的多核苷酸或其某种组合，依据其起源或衍生的来源，分离的多核苷酸具有以下一至三项：(1)不与在自然界中与“分离的多核苷酸”一起发现的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)与在自然界中未与其连接的多核苷酸可操作地连接，或(3)不会作为较大序列的一部分在自然界中出现。
如本文所用，术语“螯合剂”是可以与金属离子形成至少一个键(例如，共价键、离子键或其他键)的赋形剂。螯合剂通常为多基配体(multidentateligand)，其可在组合物中用作稳定剂以与多物质(species)复合，所述多物质可能另外促进稳定性。
如本文所用，术语“缓冲剂”是指通常通过其酸-碱缀合物组分的作用使液体抗体制剂抵抗ph变化的添加的组合物。当提到缓冲剂的浓度时，意指所述浓度代表缓冲剂的游离酸或游离碱形式的摩尔浓度。
如本文所用，“粘度”可以是“绝对粘度”或“运动粘度”(“kinematicviscosity”)。“绝对粘度”，有时也称为动态粘度或简单粘度，是描述流体流动阻力的量。“运动粘度”是绝对粘度和流体密度的商。当使用毛细管粘度计表征流体的阻力流时，频繁地报告运动粘度。当将两种等体积的流体放在相同的毛细管粘度计中并允许其通过重力流动时，粘性流体的流动要比粘性较小的流体流过毛细管的用时更长。如果一种流体用200秒完成其流动，且另一种流体用400秒，则在运动粘度标度上第二种流体的粘性是第一种的两倍。如果两种流体具有相同的密度，则在绝对粘度标度上第二种流体的粘性是第一种的两倍。运动粘度的量纲为l2/t，其中l代表长度且t代表时间。运动粘度的si单位为m2/s。通常，运动粘度以厘沱(centistokes)，cst表示，其等价于mm2/s。绝对粘度的量纲为m/l/t，其中m代表质量，且l和t分别代表长度和时间。绝对粘度的si单位为pa·s，其等价于kg/m/s。绝对粘度通常以厘泊(centipoise)，cp为单位表示，其等价于毫帕斯卡-秒，mpa·s。
如本文所用，术语“张度剂”或“tonicifier”是指可以调节液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。在某些实施方案中，张度剂可将液体抗体制剂的渗透压调节为等渗的，使得抗体制剂与对象的身体组织的细胞在生理上相容。仍在其他实施方案中，“张度剂”可有助于本文所述抗体的稳定性的改善。“等渗的”制剂是具有与人血液基本相同的渗透压的制剂。等渗的制剂通常具有约250至350mosm的渗透压。术语“低渗的”描述具有的渗透压低于人血液的渗透压的制剂。相应地，术语“高渗的”用于描述具有的渗透压高于人血液的渗透压的制剂，等渗性可以使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。张度剂可以是对映体(例如，l-或d-对映体)或外消旋形式；诸如α或β的异构体包括α、α；或β、β；或α、β；或β、α；游离酸或游离碱形式；水合形式(例如一水合物)或无水形式。
如本文所用，术语“多元醇”是指具有多个羟基的赋形剂，并且包括糖(还原糖和非还原糖)、糖醇和糖酸。
如本文所用，术语“表面活性剂”是指可以改变液体抗体制剂的表面张力的赋形剂。在某些实施方案中，表面活性剂降低液体抗体制剂的表面张力。仍在其他实施方案中，“表面活性剂”可有助于改善制剂中任何抗体的稳定性。表面活性剂可以减少配制的抗体的聚集和/或最小化制剂中颗粒的形成和/或减少吸附。表面活性剂还可在冻/融循环期间和之后提高抗体的稳定性。
如本文所用，术语“糖类”是指作为多元醇的衍生物的一类分子。糖类通常被称为碳水化合物，并且可以包含不同量的糖(糖类)单元，例如单糖、二糖和多糖。
如本文所用，术语“还原糖”是包含可以还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基共价反应的半缩醛基团的一种，以及“非还原糖”是不具有还原糖的这些性质的一种。
“冻干保护剂”是一种分子，其当与感兴趣的蛋白质结合时，在冻干和随后的储存中显著防止或减少蛋白质的物理化学的不稳定性。示例性的冻干保护剂包括糖及其相应的糖醇；氨基酸诸如谷氨酸一钠或组氨酸；甲胺诸如甜菜碱；溶致盐(lyotropicsalt)诸如硫酸镁；多元醇诸如三元或更高分子量的糖醇，例如丙三醇、右旋糖酐、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；
将冻干保护剂以“冻干保护量”添加至预冻干的制剂中，这意味着在冻干保护量的冻干保护剂的存在下蛋白质冻干之后，蛋白质在冻干和储存时基本上保持其物理化学稳定性。
如本文所用，“药学可接受的载体”包括当与活性成分组合时允许成分保留生物活性并且与对象的免疫系统不反应的任何材料。实例包括但不限于任何标准药物载体诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液诸如油/水乳液、以及各种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水、生理(0.9％)盐水或5％右旋糖。通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物(参见例如remington'spharmaceuticalsciences，18thedition，a.gennaro，ed.，mackpublishingco.，easton，pa，1990；以及remington，thescienceandpracticeofpharmacy20thed.mackpublishing，2000)
“减少发病率”是指任何减轻严重性，其可以包括减少通常用于该病况的(例如，暴露于)其他药物和/或疗法的需求和/或量。如本领域技术人员所理解的，个体可以根据其对治疗的反应而变化，并且因此，例如，“减少发病率的方法”反映施用抗-pd-1抗体是基于这种施用可能会导致该特定个体中的发生率的降低的合理预期。
“改善”是指与不施用抗-pd-1抗体相比，减轻或改善一种或多种症状。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约x”的描述包括“x”的描述。数值范围包括定义所述范围的数字。
当根据马库什组或其他可选物的分组来描述本发明的方面或实施方案时，本发明不仅涵盖作为总体列出的整个组，而且涵盖单独的所述组的每个成员和主组(maingroup)的所有可能的子组，还涵盖缺少一个或多个小组成员的主组。本发明还设想在要求保护的发明中明确排除一个或多个任何组成员。
当介绍本发明或其优选实施方案的元件时，冠词“一(a)”，“一(an)”，“该(the)”和“所述”旨在表示存在一或多项元件。术语“包含”(“comprising”)，“包含”(“comprise”)，“包含”(“comprises”)，“包括”(“including”)和“具有”旨在是包括性的，并且意味着除所列元件外可能有额外的元素。应该理解的是，无论本文在何处用语言“包含”来描述实施方案，其他以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的类似实施方案也被提供了。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。在整个该说明书和权利要求书中，单词“包含”(“comprise”)或变体诸如“包含”(“comprises”)或“包含”(“comprising”)将被理解为暗示包括所述整数或整数组，而不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数的术语应包括复数，以及复数的术语应包括单数。
在本文中描述了示例性的方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。材料、方法和示例仅是说明性的，且无意于限制。
抗-pd-1抗体组合物
一方面，本发明提供了包含抗-pd-1抗体的制剂，所述制剂具有约1cp至约25cp之间的粘度。在另一方面，提供了一种用于降低含抗-pd-1抗体的制剂的粘度的方法，其中所述方法包含向所述制剂中加入降低粘度量的能降低包含所述抗-pd-1抗体的水性制剂的粘度的化合物的步骤。所述制剂可以是水性亦或冻干形式。在水性形式中，所述制剂可以具有不大于约150cp、优选不大于约120cp、优选不大于约100cp、优选不大于约90cp、优选不大于约80cp、优选不大于约70cp、优选不大于约60cp、优选不大于约50cp、优选不大于约40cp、优选不大于约30cp、优选不大于约20cp、优选不大于大于约10cp、优选不大于约5cp的粘度。在一些实施方案中，包含抗体的组合物在20℃具有约1cp至约500cp之间、约1cp至200cp之间、约1cp至约150cp之间、约1cp至约100cp之间、约1cp至约90cp之间、约1cp至约80cp之间、约1cp至约70cp之间、约1cp至约60cp之间、约1cp至约50cp之间、约1cp至约40cp之间、在约1cp至约30cp之间、在约1cp至约20cp之间、或在约1cp至约10cp之间的粘度。在一些实施方案中，所述制剂具有约120cp、约115cp、约110cp、约105cp、约100cp、约95cp、约90cp、约85cp、约80cp、约75cp、约70cp、约65cp、约60cp、约55cp、约50cp、约45cp、约40cp、约35cp、约30cp、约25cp、约20cp、约15cp或约10cp或约5cp的粘度。在一些实施方案中，所述制剂具有约10cp至50cp之间、约10cp至100cp之间、约20cp至60cp之间、约30cp至60cp之间、约40cp至60cp之间、或约50cp至60cp之间的粘度。在一些实施方案中，在水性形式中，所述制剂可具有约1cp至10cp之间的粘度。在一些实施方案中，在水性形式中，所述制剂可具有约1cp至15cp之间的粘度。在一些实施方案中，在水性形式中，所述制剂可具有约1cp至20cp之间的粘度。
本发明的另一方面涉及一种包含容纳任何本文所述制剂的容器的制造品。
在一些实施方案中，所述制剂包含至少一种抗-pd-1抗体。在一些实施方案中，可以存在一种以上抗体。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种不同的抗体。通常，两种或更多种不同的抗体具有互补活性，其互相不会不利影响。某个抗体或每种抗体也可以与其他用于增强和/或互补抗体有效性的药剂联合使用。抗体可以约0.1至约300mg/ml的浓度范围存在于制剂中。在一些实施方案中，抗体的浓度为约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约2.5mg/ml、约3mg/ml、约3.5mg/ml、约4mg/ml、约4.5mg/ml、约5mg/ml、约5.5mg/ml、约6mg/ml、约6.5mg/ml、约7mg/ml、约7.5mg/ml、约8mg/ml、约8.5mg/ml、约9mg/ml、约9.5mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml、约30mg/ml、约31mg/ml、约32mg/ml、约33mg/ml、约34mg/ml、约35mg/ml、约36mg/ml、约37mg/ml、约38mg/ml、约39mg/ml、约40mg/ml、约41mg/ml、约42mg/ml、约43mg/ml、约44mg/ml、约45mg/ml、约46mg/ml、约47mg/ml、约48mg/ml、约49mg/ml、约50mg/ml、约51mg/ml、约52mg/ml、约53mg/ml、约54mg/ml、约55mg/ml、约56mg/ml、约57mg/ml、约58mg/ml、约59mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约101mg/ml、约102mg/ml、约102.5mg/ml、约103mg/ml、约103.5mg/ml、约104mg/ml、约104.5mg/ml、约105mg/ml、约105.5mg/ml、约106mg/ml、约106.5mg/ml、约107mg/ml、约107.5mg/ml、约108mg/ml、约108.5mg/ml、约109mg/ml、约109.5mg/ml、约110mg/ml、约111mg/ml、约112mg/ml、约113mg/ml、约114mg/ml、约115mg/ml、约116mg/ml、约117mg/ml、约118mg/ml、约119mg/ml、约120mg/ml、约121mg/ml、约122mg/ml、约123mg/ml、约124mg/ml、约125mg/ml、约126mg/ml、约127mg/ml、约128mg/ml、约129mg/ml、约130mg/ml、约131mg/ml、约132mg/ml、约133mg/ml、约134mg/ml、约135mg/ml、约136mg/ml、约137mg/ml、约138mg/ml、约139mg/ml、约140mg/ml、约141mg/ml、约142mg/ml、约143mg/ml、约144mg/ml、约145mg/ml、约146mg/ml、约147mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、约150mg/ml、约151mg/ml、约152mg/ml、约153mg/ml、约154mg/ml、约155mg/ml、约156mg/ml、约157mg/ml、约158mg/ml、约159mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约201mg/ml、约202mg/ml、约202.5mg/ml、约203mg/ml、约203.5mg/ml、约204mg/ml、约204.5mg/ml、约205mg/ml、约205.5mg/ml、约206mg/ml、约206.5mg/ml、约207mg/ml、约207.5mg/ml、约208mg/ml、约208.5mg/ml、约209mg/ml、约209.5mg/ml、约210mg/ml、约211mg/ml、约212mg/ml、约213mg/ml、约214mg/ml、约215mg/ml、约216mg/ml、约217mg/ml、约218mg/ml、约219mg/ml、约220mg/ml、约221mg/ml、约222mg/ml、约223mg/ml、约224mg/ml、约225mg/ml、约226mg/ml、约227mg/ml、约228mg/ml、约229mg/ml、约230mg/ml、约231mg/ml、约232mg/ml、约233mg/ml、约234mg/ml、约235mg/ml、约236mg/ml、约237mg/ml、约238mg/ml、约239mg/ml、约240mg/ml、约241mg/ml、约242mg/ml、约243mg/ml、约244mg/ml、约245mg/ml、约246mg/ml、约247mg/ml、约248mg/ml、约249mg/ml、约250mg/ml、约251mg/ml、约252mg/ml、约253mg/ml、约254mg/ml、约255mg/ml、约256mg/ml、约257mg/ml、约258mg/ml、约259mg/ml、约260mg/ml、约270mg/ml、约280mg/ml、约290mg/ml、或约300mg/ml。
根据本发明的一些实施方案，ph可以在约ph4.0至6.0的范围内，优选在约ph5.0至约ph4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5中的任何一个之间。进一步优选地，ph在选自约ph4.9、5.0或5.1中的任何一个之间的范围内。在一些实施方案中，ph为ph5.0+/-0.5。在这些范围内的ph值使组合物具有较低的粘度。
在一些实施方案中，制剂可以包含精氨酸。在一些实施方案中，精氨酸为精氨酸盐酸盐或精氨酸hcl。[bryan：尽管制剂7不包含精氨酸，我们将其作为可选物包括。相同的评论适用于制剂7中不存在但包含在本说明书中的其他赋形剂等。]精氨酸的浓度可以在约0.1毫摩尔(mm)至约200mm的范围内。在一些实施方案中，精氨酸的浓度为约10mm至约150mm、约50mm至约130mm、约80mm至约120mm或约90mm至约110mm之间。在一些实施方案中，精氨酸的浓度为约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm、约100mm、约105mm、约110mm、约115mm、约120mm、约125mm、约130mm、约135mm、约140mm、约145mm、约150mm、约155mm、约160mm、约165mm、约170mm、约175mm、约180mm、约185mm、约190mm、约195mm或约200mm。在一些实施方案中，精氨酸的浓度是100mm。
在一些实施方案中，张度剂可包含多元醇、糖类、碳水化合物、盐诸如氯化钠或其混合物。多元醇可以具有例如不限于小于约600kd(例如，在约120至约400kd的范围内)的分子量，并且可以是例如不限于甘露醇、海藻糖、山梨醇、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、甘油、乳糖醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇或其混合物。糖类或碳水化合物可以是例如不限于单糖、二糖或多糖、或前述任何的混合物。糖类或碳水化合物可以是例如不限于果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、山梨糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、右旋糖酐、普鲁兰糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、水溶性葡聚糖或其混合物。张度剂可以包含糖类诸如不限于还原糖或非还原糖或其混合物。张度剂可包含为非还原性糖(诸如不限于蔗糖、海藻糖及其混合物)的糖类。
组合物中张度剂的浓度范围为约1mg/ml至约300mg/ml、约1mg/ml至约200mg/ml、或约1mg/ml至约100mg/ml。优选地，组合物中张度剂的浓度为约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约2.5mg/ml、约3mg/ml、约3.5mg/ml、约4mg/ml、约4.5mg/ml、约5mg/ml、约5.5mg/ml、约6mg/ml、约6.5mg/ml、约7mg/ml、约7.5mg/ml、约8mg/ml、约8.5mg/ml、约9mg/ml、约9.5mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml、约30mg/ml、约31mg/ml、约32mg/ml、约33mg/ml、约34mg/ml、约35mg/ml、约36mg/ml、约37mg/ml、约38mg/ml、约39mg/ml、约40mg/ml、约41mg/ml、约42mg/ml、约43mg/ml、约44mg/ml、约45mg/ml、约46mg/ml、约47mg/ml、约48mg/ml、约49mg/ml、约50mg/ml、约51mg/ml、约52mg/ml、约53mg/ml、约54mg/ml、约55mg/ml、约56mg/ml、约57mg/ml、约58mg/ml、约59mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约81mg/ml、约82mg/ml、约83mg/ml、约84mg/ml、约85mg/ml、约86mg/ml、约87mg/ml、约88mg/ml、约89mg/ml、约90mg/ml、约91mg/ml、约92mg/ml、约93mg/ml、约94mg/ml、约95mg/ml、约96mg/ml、约97mg/ml、约98mg/ml、约99mg/ml、约100mg/ml、约101mg/ml、约102mg/ml、约103mg/ml、约104mg/ml、约105mg/ml、约106mg/ml、约107mg/ml、约108mg/ml、约109mg/ml、约110mg/ml、约111mg/ml、约112mg/ml、约113mg/ml、约114mg/ml、约115mg/ml、约116mg/ml、约117mg/ml、约118mg/ml、约119mg/ml、约120mg/ml、约121mg/ml、约122mg/ml、约123mg/ml、约124mg/ml、约125mg/ml、约126mg/ml、约127mg/ml、约128mg/ml、约129mg/ml、约130mg/ml、约131mg/ml、约132mg/ml、约133mg/ml、约134mg/ml、约135mg/ml、约136mg/ml、约137mg/ml、约138mg/ml、约139mg/ml、约140mg/ml、约141mg/ml、约142mg/ml、约143mg/ml、约144mg/ml、约145mg/ml、约146mg/ml、约147mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、或约150mg/ml。
表面活性剂可以是，例如不限于，聚山梨酯、泊洛沙姆、triton、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠(sodiumlaurelsulfate)、辛基糖苷钠、月桂基-磺基甜菜碱(lauryl-sulfobetaine)、肉豆蔻基-磺基甜菜碱(myristyl-sulfobetaine)、亚油酰基-磺基甜菜碱(myristyl-sulfobetaine)、亚油醇基-磺基甜菜碱(linoleyl-sulfobetaine)、硬脂酰-磺基甜菜碱(stearyl-sulfobetaine)、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油醇基-肌氨酸、硬脂酰-肌氨酸、亚油醇基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、十六烷基-甜菜碱、月桂酰氨基丙基-甜菜碱(lauroamidopropyl-betaine)、椰油酰胺丙基-甜菜碱(cocamidopropyl-betaine)、亚油酸酰胺丙基-甜菜碱(linoleamidopropyl-betaine)、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱(myristamidopropyl-betaine)、棕榈酰胺丙基甜菜碱(palmidopropyl-betaine)、异硬脂酸酰胺丙基-甜菜碱(isostearamidopropyl-betaine)、肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺(myristamidopropyl-dimethylamine)、棕榈酰胺丙基-二甲胺(palmidopropyl-dimethylamine)、异硬脂酸酰胺丙基-二甲胺(isostearamidopropyl-dimethylamine)、甲基椰油酰基牛磺酸钠(sodiummethylcocoyl-taurate)、甲基油酰牛磺酸二钠(disodiummethyloleyl-taurate)、二羟丙基peg5亚油基氯化铵、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物。表面活性剂可以是例如不限于聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85、peg3350及其混合物。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80(ps80)。
表面活性剂的浓度通常在约0.01mg/ml至约10mg/ml、约0.01mg/ml至约5.0mg/ml、约0.01mg/ml至约2.0mg/ml、约0.01mg/ml至约1.5mg/ml、约0.01mg/ml至约1.0mg/ml、约0.01mg/ml至约0.5mg/ml、约0.01mg/ml至约0.4mg/ml、约0.01mg/ml至约0.3mg/ml、约0.01mg/ml至约0.2mg/ml、约0.01mg/ml至约0.15mg/ml、约0.01mg/ml至约0.1mg/ml、或约0.01mg/ml至约0.05mg/ml的范围内。更优选地，表面活性剂的浓度为约0.5mg/ml、约0.05mg/ml、约0.06mg/ml、约0.07mg/ml、约0.08mg/ml、约0.09mg/ml、约0.1mg/ml、约0.11mg/ml、约0.12mg/ml、约0.13mg/ml、约0.14mg/ml、约0.15mg/ml、约0.16mg/ml、约0.17mg/ml、约0.18mg/ml、约0.19mg/ml、约0.2mg/ml。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为0.2mg/ml。
缓冲剂可以是例如不限于乙酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乙酸、磷酸盐、磷酸、抗坏血酸盐、酒石酸、马来酸、甘氨酸、乳酸盐、乳酸、抗坏血酸、咪唑、碳酸氢盐和碳酸、琥珀酸、苯甲酸钠、苯甲酸、葡萄糖酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙酸盐、苹果酸、咪唑、tris、磷酸盐及其混合物。在一些实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂，其中所述组氨酸可以包含l-组氨酸亦或d-组氨酸、组氨酸的溶剂化形式、组氨酸的水合形式(例如一水合物)、组氨酸的盐(例如，组氨酸盐酸盐)或组氨酸的无水形式或其混合物。优选地，缓冲剂是乙酸盐缓冲剂，其中乙酸盐可包含乙酸钠、乙酸或其混合物。
缓冲剂的浓度可以在约0.1毫摩尔(mm)至约100mm的范围内。优选地，缓冲剂的浓度为约0.5mm至约50mm、进一步优选为约1mm至约30mm、更优选为约1mm至约18mm、逐渐优选为约1mm至约15mm。优选地，缓冲剂的浓度为约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm或约50mm。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约190mm、约200mm、约210mm、约220mm、约230mm、约240mm、约250mm、约260mm、约270mm、约280mm、约290mm、约300mm、约310mm或约320mm。
在一些实施方案中，所述螯合剂可以选自由以下组成的组：氨基多元羧酸、羟基氨基羧酸、n-取代的甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(2-(2-amino-2-oxocthyl)aminoethanesulfonicacid，bes)、去铁胺(def)、柠檬酸、烟酰胺和脱氧胆酸盐及其混合物。在一些实施方案中，螯合剂选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(edta)、二乙三胺五乙酸5(dtpa)、次氮基三乙酸(nta)、n-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸(ada)、双(氨基乙基)乙二醇醚、n,n,n',n'-四乙酸(egta)、反式-二氨基环己四乙酸(dcta)、谷氨酸、和天冬氨酸、n-羟乙基亚氨基二乙酸(himda)、n,n-双-羟乙基甘氨酸(bicine)和n-(三羟甲基甲基)10甘氨酸(tricine)、甘氨酰甘氨酸、脱氧胆酸钠、乙二胺；丙二胺；二亚乙基三胺；三乙四胺(trien)、乙二胺四乙酰edta；edta二钠、edta草酸钙、苹果酸盐、柠檬酸、柠檬酸一水合物、和柠檬酸三钠-二水合物、8-羟基喹啉酸盐(8-hydroxyquinolate)、氨基酸、组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、肽、多肽和蛋白质及其混合物。在一些实施方案中，螯合剂选自由以下组成的组：edta的盐包括乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钙二钠、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸三钠和乙二胺四乙酸钾；以及去铁胺(def)合适的盐是甲磺酸去铁胺(dfm)或其混合物。在本发明中使用的螯合剂可以在可能的情况下以化合物的游离酸或游离碱形式或盐形式存在，也可以以化合物或相应盐的无水、溶剂化或水合形式存在。以给定的ph和相同浓度的乙二胺四乙酸(edta)溶解于溶液后，各种盐、游离酸、水合或无水形式的含有钠和水的edta被认为是等价的螯合剂。例如，都含有134.4μmedta的0.0500g/ledta二钠二水合物(fw：372.3)、0.0393g/ledta(fw：292.3)、0.0452g/ledta二钠(fw：336.2)、0.0481g/ledta三钠(fw：358.2)、0.0511g/ledta四钠(fw：380.2)、0.0422g/ledta钠(fw：314.2)和0.0446g/ledta钠水合物(fw：332.3)被认为是等价的螯合剂。
最优选地，所述螯合剂是edta，诸如例如不限于edta二钠、edta钙或edta二钠二水合物。
特别优选的是edta二钠，因为它为组合物提供了增强的抗体稳定性和/或抗聚集性。
螯合剂的浓度通常为从约0.01mg/ml至约50mg/ml、从约1mg/ml至约10.0mg/ml、从约5mg/ml至约15.0mg/ml、从约0.01mg/ml至约1.0mg/ml、或从约0.03mg/ml至约0.5mg/ml的范围内。进一步优选地，螯合剂的浓度通常为约0.01mm至约2.0mm、从约0.01mm至约1.5mm、从约0.01mm至约0.5mm、从约0.01mm至约0.4mm、从约0.01mm至约0.3mm、从约0.01mm至约0.2mm、从约0.01mm至约0.15mm、从约0.01mm至约0.1mm、从约0.01mm至约0.09mm、从约0.01mm至约0.08mm、从约0.01mm至约0.07mm、从约0.01mm至约0.06mm、从约0.01mm至约0.05mm、从约0.01mm至约0.04mm、从约0.01mm至约0.03mm、从约0.01mm至约0.02mm或从约0.05mm至约0.01mm的范围内。优选地，螯合剂的浓度可以为约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、约0.04mg/ml、约0.05mg/ml、约0.06mg/ml、约0.07mg/ml、约0.10mg/ml、约0.20mg/ml。进一步优选地，螯合剂的浓度为约0.04mg/ml、约0.041mg/ml、约0.042mg/ml、约0.043mg/ml、约0.044mg/ml、约0.045mg/ml、约0.046mg/ml、约0.047mg/ml、约0.048mg/ml、约0.049mg/ml、约0.05mg/ml、约0.051mg/ml、约0.052mg/ml、约0.053mg/ml、约0.054mg/ml、约0.055mg/ml、或约0.056mg/ml。最优选地，螯合剂的浓度为约0.05mg/ml。
螯合剂在本发明组合物中可以降低还原的氧物质的形成、减少酸性物质(例如脱酰胺)的形成、减少抗体的聚集、和/或减少抗体的片段化，和/或减少抗体的氧化。这样的螯合剂可以减少或防止与没有螯合剂的保护的抗体相比配制的抗体的降解。
除非另有说明，本文列出的浓度是在环境条件下，即在25℃和大气压下的那些浓度。
在优选的实施方案中，制剂不包含抗氧化剂。例如，本文提供的组合物的优选实施方案不包含甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶或铂。
在一些实施方案中，制剂可以包含抗氧化剂。在一些实施方案中，抗氧化剂选自甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂组成的组。
抗氧化剂的浓度通常在从约0.01mg/ml至约50mg/ml、从约0.01mg/ml至约10.0mg/ml、从约0.01mg/ml至约5.0mg/ml、从约0.01mg/ml至约1.0mg/ml、或从约0.01mg/ml至约0.02mg/ml的范围内。优选地，抗氧化剂的浓度可以为约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、约0.04mg/ml、约0.05mg/ml、约0.06mg/ml、约0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、约0.10mg/ml、0.11mg/ml、0.12mg/ml、0.13mg/ml、约0.14mg/ml、约0.15mg/ml、约0.16mg/ml、约0.17mg/ml、0.18mg/ml、0.19mg/ml约0.20mg/ml、约0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml。最优选地，抗氧化剂的浓度为约0.01mg/ml。
在一些实施方案中，制剂可以包含防腐剂。优选地，防腐剂选自苯酚、间甲酚、苯甲醇、苯扎氯铵、benzalthoniumchloride、苯氧乙醇和对羟基苯甲酸甲酯。
防腐剂的浓度通常为从约0.001mg/ml至约50mg/ml、从约0.005mg/ml至约15.0mg/ml、从约0.008mg/ml至约12.0mg/ml或从约0.01mg/ml至约10.0mg/ml的范围内。优选地，防腐剂的浓度可以为约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml约1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、约4.0mg/ml、约5.0mg/ml、约6.0mg/ml、约7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml约9.1mg/ml、约9.2mg/ml、9.3mg/ml、9.4mg/ml、9.5mg/ml、9.6mg/ml、9.7mg/ml、9.8mg/ml、9.9mg/ml、10.0mg/ml。最优选地，防腐剂的浓度为约0.1mg/ml或9.0mg/ml。
在一些实施方案中，所述组合物不包含抗氧化剂。
在一些实施方案中，所述组合物不包含防腐剂。
在一些实施方案中，抗体包含重链恒定区，诸如例如igg、igm、igd、iga和ige；和任何同种型，诸如igg1、igg2、igg3和igg4。优选地，抗体是igg2或igg4抗体。在一些实施方案中，抗体包含igg4的恒定区，其包含以下突变(armour等，2003，molecularimmunology40585-593)：e233f234l235至p233v234a235(igg4δc)，其中编号是相对于野生型igg4。在又一个实施方案中，fc是具有缺失g236的人igg4e233f234l235至p233v234a235(igg4δb)。在一些实施方案中，fc是含有铰链稳定突变s228至p228的任何人igg4fc(igg4，igg4δb或igg4δc)(aalberse等，2002，immunology105，9-19)。
在一些实施方案中，抗体可以选自有以下组成的组：单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(例如，fab，fab'，f(ab')2，fv，fc，scfv等)，嵌合抗体，双特异性抗体，异缀合物抗体(heteroconjugateantibodies)，单链(scfv)，其突变体，包含抗体部分的融合蛋白质(例如域抗体)，人源化抗体，人抗体，以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体以及共价修饰的抗体。所述抗体可以是鼠科、大鼠、人或任何其他来源的(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，抗体可以是人的，但是更优选地是人源化的。优选地，抗体是分离的，进一步优选地，其是基本上纯的。当抗体是抗体片段时，其优选保留原始抗体的功能特征，即配体结合和/或拮抗剂或激动剂活性。
说明性的抗-pd-1抗体包括但不限于例如：纳武单抗(
beigeneltd.正在开发的bgb-a317(tislelizumab)是人源化igg4单克隆抗体，其具有工程化的fc区(即其中结合fcγ受体i的能力已被特异性去除)。bgb-a317与pd-1结合并抑制pd-1与pd-l1和pd-l2结合。
在一个或多个实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂选自pf-0680159、纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗和bgb-a317。
在一个特定方面，抗-pd-1抗体是pf-06801591(pfizerinc.，cas注册号2029210-61-3)。在另一个具体方面，抗-pd-1抗体是纳武单抗(
在一个特定方面，抗-pd-1抗体包含重链可变区，其包含：
(a)包含seqidno：4(gytftsywin)所示氨基酸序列的cdr1；
(b)包含seqidno：5(niypgssltnynekfkn)所示的氨基酸序列的cdr2；以及
(c)包含seqidno：6(lstgtfay)中所示的氨基酸序列的cdr3。
在一些实施方案中，抗体可以是包含轻链可变区的抗-pd-1抗体，所述轻链可变区包含：
(a)包含seqidno：7(kssqslwdsgnqknflt)所示氨基酸序列的cdr1；
(b)包含seqidno：8(wtsyres)所示的氨基酸序列的cdr2；以及
(c)包含seqidno：9(qndyfypht)所示的氨基酸序列的cdr3。
在一些实施方案中，抗体可以是抗-pd-1抗体，其包含来自重链可变区的三个cdr，所述重链可变区包含seqidno：2所示的氨基酸序列。
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywinwvrqapgqglewmgniypgssltnynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarlstgtfaywgqgtlvtvss(seqidno：2)
在一些实施方案中，抗体可以是抗-pd-1抗体，其包含来自轻链可变区的三个cdr，所述轻链可变区包含seqidno：3所示的氨基酸序列。
divmtqspdslavslgeratinckssqslwdsgnqknfltwyqqkpgqppklliywtsyresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndyfyphtfgggtkveik(seqidno：3)
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含与包含seqidno.2所示氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一相同性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与包含seqidno.3所示氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一相同性的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合人pd-1。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可包含重链可变区和/或可包含轻链可变区，所述重链可变区包含含有seqidno：2所示氨基酸序列的氨基酸序列，所述轻链可变区包含含有seqidno：3所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可以是包含seqidno：2和3所示的氨基酸序列的抗体。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可包含重链区和/或轻链区，所述重链区包含与包含seqidno.10所示氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一相同性的氨基酸序列，所述轻链区包含与包含seqidno.11所示氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一相同性的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合人pd-1。
重链序列
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywinwvrqapgqglewmgniypgssltnynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarlstgtfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno：10)
轻链序列
divmtqspdslavslgeratinckssqslwdsgnqknfltwyqqkpgqppklliywtsyresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndyfyphtfgggtkveikrgtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno：11)
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可包含重链区和/或可以包含轻链区，所述重链区包含含有seqidno：10所示氨基酸序列的氨基酸序列，所述轻链区包含含有seqidno：11所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以切割seqidno：10中所示的重链序列的c-末端赖氨酸；即，重链序列可缺少c端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可以是包含seqidno：10和11所示的氨基酸序列的抗体。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可以与本文定义的抗-pd-1抗体竞争pd-1结合。抗-pd-1抗体可以与抗体(该抗体)竞争pd-1结合，所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含含有seqidno：2所示的氨基酸序列的氨基酸序列，所述轻链可变区包含含有seqidno：3所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体可以是特异性结合人pd-1的单克隆抗体，mab7。抗体mab7描述于wo2016/092419中，其内容通过引用整体并入本文。mab7的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别显示在seqidno：2和3中。抗体mab7的cdr部分(包括chothia和kabatcdr)在wo2016/092419的表1中示意性地描绘。抗体mab7在阻断pd-1的生物学活性方面高度有效。
在一些实施方案中，抗-pd-1抗体还可包含抗体mab7的片段或区。在一个实施方案中，所述片段是抗体mab7的轻链，其包含如本文中seqidno：11所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述片段是抗体mab7的重链，其包含如本文seqidno：10所示的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述片段包括来自抗体mab7的轻链和/或重链的一个或多个可变区。在另一个实施方案中，所述片段包括来自抗体mab7的轻链和/或重链的一个或多个cdr，所述抗体mab7的轻链和/或重链分别包含本文中seqidno：11和10所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可以包含一个或多个(一个，两个，三个，四个，五个或六个)源于抗体mab7的cdr。在一些实施方案中，cdr可以是kabatcdr、chothiacdr或kabat和chothiacdr的组合(在本文中称为“扩展的”或“组合的”cdr)。在一些实施方案中，多肽包含本文所述的任何cdr构型(包括组合、变体等)。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的任何抗-pd-1抗体的重链的c-末端赖氨酸被缺失。在各种情况下，本文所述的抗-pd-1抗体的重链和/或轻链可以任选地包括信号序列。
在其他实施方案中，抗体可以选自本领域已知的抗-pd-1抗体，诸如在例如但不限于以下任一项中所描述的抗体：美国专利号8354509、9084776、9492540、9492539、9387247、8779105、8952136、和8709416。抗体可以与本领域已知的抗-pd-1抗体结合相同的表位，和/或可以与这样的抗体竞争结合pd-1。
根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含以下或基本上由以下组成：
约140mg/ml至约160mg/ml的抗体，
约10.0mm至约30.0mm的组氨酸缓冲剂，
约40mg/ml至约100mg/m的海藻糖，
约0.01至约0.3mg/ml的聚山梨酯80(ps80)，以及
约0.01至约0.1mg/ml的edta二钠，
其中所述组合物的ph选自约ph4.5至任何的约5.5之间的范围，或可选地选自约ph4.5至任何的ph4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9之间的范围。
根据一个优选的实施方案，组合物包含以下或基本上由以下组成：任何的约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml的抗体，
约20mm组氨酸缓冲剂，
约84mg/ml海藻糖，
约0.2mg/mlps80，和
约0.05mg/mledta二钠，
其中所述组合物的ph选自约ph5.0至任何的约ph5.0、5.2、5.5或5.8之间的范围，或可选地选自约ph4.5至任何的约ph4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5之间的范围，并且其中所述抗体包含可变重链序列和可变轻链序列，所述可变重链序列包含seqidno.2所示的氨基酸序列，所述可变轻链序列包含seqidno.3所示的氨基酸序列。
根据一个优选的实施方案，组合物包含以下或基本上由以下组成：任何的约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml或约180mg/ml的抗体，
约20mm组氨酸缓冲剂，
约84mg/ml海藻糖，
约0.2mg/mlps80，和
约0.05mg/mledta二钠，
其中所述组合物的ph为约ph5.0，+/-0.5，并且其中所述抗体包含可变重链序列和可变轻链序列，所述可变重链序列包含seqidno.2所示的氨基酸序列，所述可变轻链序列包含seqidno.3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所使用的剂量体积为约0.5ml、约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约6ml、约7ml、约8ml、约9ml、约10ml、约11ml、约12ml、约13ml、约14ml、约15ml、约16ml、约17ml、约18ml、约19ml、约20ml、约21ml、约22ml、约23ml、约24ml、约25ml、约26ml、约27ml、约28ml、约29ml、约30ml、约31ml、约32ml、约33ml、约34ml、约35ml、约36ml、约37ml、约38ml、约39ml、约40ml、约41ml、约42ml、约43ml、约44ml、约45ml、约46ml、约47ml、约48ml、约49ml、或约50ml。
在一些实施方案中，提供了一种冻干的和/或已经经历冻干的组合物。在一些实施方案中，提供了一种未被冻干的以及还没有经历冻干的组合物。
在一些实施方案中，抗体的浓度为约100mg/ml、约105mg/ml、约110mg/ml、约115mg/ml、约120mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约135mg/ml、约140mg/ml、约145mg/ml、约150mg/m、约155mg/ml或约160mg/ml的任一种。
根据本发明的另一个优选方面，提供了任何前述方面或实施方案的组合物，其用于制备用于在对象中治疗过度增生性病症诸如例如癌症的药物。
在一些实施方案中，所述癌症选自胃部癌(gastriccancer)、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌症(salivarycancer)、肝癌、胃癌(stomachcancer)、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤中的一种或多种。
根据本发明的又一个实施方案，提供了任何前述方面或实施方案的组合物，其用于制备用于在对象中治疗过度增生性病症诸如例如癌症的药物。
根据优选的实施方案，可以将组合物直接施用到血流中、肌肉中、组织中、脂肪中或内部器官中。肠胃外施用的合适方式包括皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、室内(intraventricular)、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、骨内(intra-ossial)和皮内。肠胃外施用的合适装置包括针(包括微针，微突(microprojections)，可溶针和其他微孔形成技术)注射器、无针注射器和输注技术(infusiontechniques)。
在一些实施方案中，药物的施用方式包括每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十五周一次、每二十周一次、每二十五周一次或每二十六周一次施用一个剂量的药物。在一些实施方案中，抗-pd1抗体每个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次施用。在一些实施方案中，药物的施用方式包括每四周或八周一次施用一个剂量的药物。
在一些实施方案中，剂量的体积小于或等于约3ml、约2.5ml、约2ml、约1.5ml、约1ml、约0.75ml、约0.5ml、约0.25ml或约0.1ml。
在一些实施方案中，剂量的体积为约20ml、约19ml、约18ml、约17ml、约16ml、约15ml、约14ml、约13ml、约12ml、约11ml、约10ml、约9ml、约8ml、约7ml、约6ml、约5ml、约4ml、约3ml、约2ml或约1ml。可选地，剂量的体积为约20.5ml、约19.5ml、约18.5ml、约17.5ml、约16.5ml、约15.5ml、约14.5ml、约13.5ml、约12.5ml、约11.5ml、约10.5ml、约9.5ml、约8.5ml、约7.5ml、约6.5ml、约5.5ml、约4.5ml、约3.5ml、约2.5ml、约1.5ml、或约0.5ml。可选地，剂量的体积为约900微升、约800微升、约700微升、约600微升、约500微升、约400微升、约300微升、约200微升、或约100微升，可选地约950微升、约850微升、约750微升、约650微升、约550微升、约450微升、约350微升、约250微升、约150微升、或约50微升。在一些实施方案中，剂量的体积小于或等于约2.0ml。
根据优选的实施方案，抗体的浓度可以在约0.1至约200mg/ml之间的范围。优选地，抗体的浓度为约100mg/ml、约101mg/ml、约102mg/ml、约103mg/ml、约104mg/ml、约105mg/ml、约106mg/ml、约107mg/ml、约108mg/ml、约109mg/ml、或约110mg/ml、约111mg/ml、约112mg/ml、约113mg/ml、约114mg/ml、约115mg/ml、约116mg/ml、约117mg/ml、约118mg/ml、约119mg/ml、约120mg/ml、约121mg/ml、约122mg/ml、约123mg/ml、约124mg/ml、约125mg/ml、约126mg/ml、约127mg/ml、约128mg/ml、约129mg/ml、约130mg/ml、约131mg/ml、约132mg/ml、约133mg/ml、约134mg/ml、约135mg/ml、约136mg/ml、约137mg/ml、约138mg/ml、约139mg/ml、约140mg/ml、约141mg/ml、约142mg/ml、约143mg/ml、约144mg/ml、约145mg/ml、约146mg/ml、约147mg/ml、约148mg/ml、约149mg/ml、或约150mg/ml。最优选地，抗体的浓度为约100mg/ml至约180mg/ml、并且可以选自包含以下的组：约100mg/ml、约105mg/ml、约110mg/ml、约115mg/ml、约120mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约135mg/ml、约140mg/ml、约145mg/ml、约150mg/ml、约155mg/ml、约160mg/ml、约165mg/ml、约170mg/ml、约175mg/ml、或约180mg/ml。
根据一个优选的实施方案，剂量含有小于或等于约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、约600mg、约610mg、约620mg、约630mg、约640mg、约650mg、约660mg、约670mg、约680mg、约690mg、约700mg、约710mg、约720mg、约730mg、约740mg、约750mg、约760mg、约770mg、约780mg、约790mg、约800mg、约810mg、约820mg、约830mg、约850mg、约850mg、约860mg、约870mg、约880mg、约890mg、约900mg、约910mg、约920mg、约930mg、约940mg、约950mg、约960mg、约970mg、约980mg、约990mg、或约1000mg的抗体。
根据一些实施方案，所述剂量含有约1μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约250μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、或约11mg/kg(所述剂量所施用于的对象的质量)的抗体的量。在一些实施方案中，所述剂量含有约20μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约250μg/kg、1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/k、或约10mg/kg。
剂量方案可能取决于执业医生希望达到的药代动力学衰减的模式。例如，在一些实施方案中，考虑每周四次给药。甚至可以使用频率更低的给药。在一些实施方案中，剂量每1周，每2周，每3周，每4周，每5周，每6周，每7周，每8周，每9周，每10周，每15周，每20周，每25周或更久施用一次。在一些实施方案中，剂量每1个月，每2个月，每3个月，每4个月，每5个月，每6个月或更久施用一次。通过常规技术和测定很容易监测该疗法的进展。给药方案可以随时间变化。
为了本发明的目的，药物的合适剂量将取决于所采用的抗体、要治疗的病症的类型和严重性、是否为了预防性或治疗性目的而施用药剂、先前的疗法，患者的临床病史和对药剂的应答、以及主治医师的酌处权(discretion)。典型地，临床医生将施用药物，直到达到实现期望的结果的剂量为止。剂量可以根据经验确定。例如，给个体递增的剂量以评估药物的功效。
剂量和/或频率可随治疗过程而变化。诸如抗体半衰期的经验考虑通常将有助于确定剂量。施用频率可以确定并在疗法过程中调整，并且施用频率通常但非必须地基于过度增殖性疾病的一种或多种症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。在某些个体中，可能需要不止一个剂量。可以在疗法过程中确定和调整施用频率。例如不限于，对于几天或更久的重复施用，取决于疾病及其严重性，持续治疗直到出现所期望的症状抑制或直到实现足以治疗癌症的治疗性水平。
包含所述组合物的药物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理条件、施用的目的是治疗性或是预防性、以及本领域执业医师已知的其他因素。包含所述组合物的药物的施用可以在预选的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔的剂量。
优选地，剂量的施用是肠胃外施用，其优选选自静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、骨内、皮内和皮下。优选地，所述药物是用于肠胃外施用的单位剂量无菌形式的。
提供以下实施例仅用于说明性目的，并无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据之前的描述，除了本文中示出和描述的那些之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。参考wo2016/092419中的实施例以说明用于本发明的抗体。w02016/092419的全部内容通过引用合并于此。
实施例
方法
所述方法部分提供了以下实施例1-6中使用的方法的概述。
在基于芯片的m-vroc仪器上测量抗体制剂的粘度，其中压力差与溶液动态粘度相关。在不同的流速和剪切速率下测试了量度。样品大小约为70-100μl。将等分试样加样到100μlhamilton注射器中，并连接到m-vroc芯片。在20℃进行一式三份测量。
为了确定冻融稳定性，将100-150mg/ml的抗-pd-1抗体从-20℃至2-8℃循环5次。通过ph、浓度和sec，评估抗体稳定性。
为了确定搅拌稳定性，以300rpm搅拌24小时后，以及在环境温度和在竖直方向的光线下评估高浓度的抗-pd-1抗体。通过ph、浓度和sec，评估稳定性。
使用对氢离子活性敏感的指示电极、玻璃电极和合适的参比电极(thermoscientificoriontmperphecttmrosstmcombinationphmicroelectrode)，使用能够将ph值恢复为0.02个ph单位的合适的、适当标准化的电位计仪器(thermoscientificorionstara111ph计)，根据usp药典方法(compendialmethod)<791>和ep药典方法2.2.3测量高浓度抗体制剂的ph稳定性。使用当天在22.5-25.4℃进行两点或三点校准，以验证ph计的标准化，在环境温度下平衡样品至少30分钟，并在ph读数稳定至少60秒后记录的至0.01ph单位的值。
使用soovpe(ctechnologiesinc.)仪器，根据不同路径长度和比尔-朗伯定律(a＝clε，其中a＝吸光度，c＝浓度，i＝路径长度，ε＝消光系数/摩尔吸光系数，以mgml-1cm-1)来测量总蛋白质浓度。对于抗-pd-1抗体mab7，使用的ε为1.62mgmgml-1cm-1。对于纳武单抗，使用的ε为1.68mgmgml-1cm-1。对于派姆单抗，使用的ε为1.42mgmgml-1cm-1。将样品平衡至环境温度，添加到样品容器中(ctechinc.#oc0009-1-p50)，并加样到检测窗平台中的容器支架。对每个样品，将干净的fibrette(#oc0002-p50)安装到fibrette联结器(coupler)中，并读取280nm处的斜率(320mm处的散射校正)。
在agilenthplc系统上通过尺寸排阻色谱(sec)分析较高分子量物质(hmms)的形成。根据ymc-packdiol-200色谱柱(waters、cat.no.dl20s053008wt)上的流体动力学体积将50μg蛋白质分离，所述色谱柱以0.75ml/min使用等度梯度(isocraticgradient)(20mm磷酸钠、400mm氯化钠、ph7.2)保持在30±2℃。分子量物质被洗脱并通过280nm处的紫外线吸收来检测。
使用成像的毛细管等电聚焦(ice)量化脱酰胺和片段化时高浓度的抗体的电荷异质性和稳定性，其中根据在ph梯度中的蛋白质物质的电荷差异(pi值)对其进行分离。将样品在混合物中稀释至终浓度为0.3mg/ml的蛋白质、0.01mg/mlpl标记物6.14(proteinsimple、partno.102220)、0.01mg/mlpl标记物9.50(proteinsimple、partno.101996)、4％pharmalyteph3-10(gepartno.17-0456-01)、0.25％甲基纤维素(proteinsimple、partno.101876))和2m尿素(sigma-aldrich、partno.u4883)。将样品注射入安装在proteinsimpleice3仪器中的涂有碳氟化合物的cief柱式色谱柱(cartridgecolumn)(proteinsimple、partno.101701)中，在高压(≤3000v)下聚焦在毛细柱中，并以280nm的固定波长在真实的柱成像检测(wcid)系统中进行监控。用适当的软件分析所得的电泳图，以确定每种物质的pl值和峰面积。
使用微流成像(mfi)分析亚可见(subvisible)颗粒。在任何样品分析之前，运行15μmduke乳胶计数标准品作为系统适用性检查。在每次分析之间使用水冲洗。此外，先进行水空白分析以确保背景计数适合测试。报告每ml的平均累积计数。此外，监控多个尺寸通道，以提供每个尺寸范围的颗粒计数的信息。
实施例1.缓冲剂和ph对粘度的影响
本实施例说明ph对高浓度抗-pd-1抗体制剂中粘度的影响。
为了制备抗体制剂，通过用缓冲剂反复稀释然后浓缩至大约160mg/ml直至完成缓冲剂交换，将抗-pd-1抗体mab7缓冲剂交换成20mm组氨酸ph5.5、20mm组氨酸ph6.0、20mm组氨酸ph6.5、20mm组氨酸ph7.0、20mm乙酸盐ph5.0和20mm乙酸盐ph6.0。所有样品的终浓度目标为160mg/ml。
测量所有样品的蛋白质浓度、粘度和ph。结果总结在表1和图1中。该结果表明具有较低ph的制剂具有显著较低的粘度。额外地，在相同的ph下，基于组氨酸和乙酸盐的制剂都具有相似的粘度。
表1
实施例2.精氨酸的评估
该实施例说明了不同浓度的精氨酸对抗-pd-1抗体粘度的影响。
为了评估精氨酸对粘度的影响，通过用20kdamwco透析盒透析(不含ps80)，将抗-pd-1抗体mab7配制成20mm乙酸盐ph5.0、50g/l蔗糖、0.05g/lna2edta二水合物和0.2g/lps80，用50kdaamicon离心过滤器浓缩至约200mg/ml抗-pd-1抗体，并掺入高浓度ps80。通过添加高浓度精氨酸盐酸盐(hcl)溶液来制备具有不同浓度精氨酸的制剂。
测量所有样品的蛋白质浓度和ph。结果总结在表2和图2中。显示了在一系列抗-pd-1抗体浓度下，具有0、50、100、150、200和250mm精氨酸的抗-pd-1抗体制剂的粘度(表2、图2)。结果表明，添加50mm精氨酸会降低高浓度抗-pd-1抗体制剂的粘度。额外地，将精氨酸浓度逐渐增加至250mm进一步降低粘度。
表2
实施例3.含精氨酸制剂的评价
该实施例说明了额外的赋形剂对抗-pd-1抗体的粘度和稳定性的影响。
为了制备含精氨酸的抗体制剂，通过用20kdamwco透析盒将mab7透析到每种制剂中(不含ps80)，用50kdaamicon离心过滤器浓缩至150-200mg/ml抗-pd-1抗体，并掺入高浓度ps80，来将抗-pd-1抗体mab7配制至各个制剂1-6(表3)。
表3
制剂1、2和3评估了ph在含精氨酸的制剂中的影响。表4和图3总结了在一系列抗-pd-1浓度下制剂1、2和3的粘度。结果表明，在含有150mm精氨酸的制剂中，将ph从5.5降低至4.5显著降低粘度。
表4
制剂4、5和6评估了向ph5.0的含有100mm精氨酸的制剂添加脯氨酸的影响。表5和图4总结了在一系列抗-pd-1抗体浓度下制剂4、5和6的粘度。结果表明，含有0、100或200mm脯氨酸的高浓度抗-pd-1抗体制剂的粘度没有显著差异。
表5
通过将样品置于5℃、25℃和40℃的稳定性下，确定在150mg/ml抗-pd-1抗体下制剂1、2、3、4和5的稳定性。就聚集(sec)、电荷同工型(ice)、浓度和ph评估蛋白质稳定性。表6、7、8、9和10分别总结了制剂1、2、3、4和5的热稳定性。
表6.制剂1温度稳定性
表7.制剂2温度稳定性
表8.制剂3温度稳定性
表9.制剂4温度稳定性
表10.制剂5温度稳定性
对于所有制剂1-5，在5℃和25℃电荷物质和聚集体(hmms)在10周后(对于制剂4和5，为4周)无显著变化。在40℃，制剂1(ph4.5)的碱性物质显著增加，而制剂2、3、4和5(ph>4.5)的酸性物质增加。在40℃下储存后，对于所有制剂，聚集体(hmms)的增加量相似，但是对于预期储存条件为5℃下的液体制剂，增加被认为是可接受的。
实施例4.含海藻糖制剂的评估
该实施例说明了海藻糖对抗-pd-1抗体制剂的稳定性和粘度的影响。
在无精氨酸和含精氨酸的制剂中，将海藻糖二水合物作为稳定剂进行了评估(表11)。
表11
为了制备含海藻糖的抗体制剂，使用具有50kda超滤滤芯(ultrafiltrationcartridges)的正切流过滤(tangentrialflowfiltration)，将抗-pd-1抗体mab7缓冲剂交换至20mm组氨酸和50g/l海藻糖二水合物。使用超滤提高抗-pd-1抗体mab7的浓度，然后使用高浓度溶液添加赋形剂，并必要时进行稀释。抗-pd-1抗体mab7以以下浓度在制剂7中配制：104mg/ml、154mg/ml、174mg/ml和200mg/ml。抗-pd-1抗体mab7以以下浓度在制剂8中配制：150mg/ml、170mg/ml和200mg/ml。如上所述测量粘度。结果总结在表12和图5中。
表12.含海藻糖制剂的粘度
含104mg/ml、154mg/ml、174mg/ml和200mg/mlmab7的制剂7的粘度在20℃分别为5.3、16.9、32.5和67.6cp。含150mg/ml、170mg/ml和200mg/mlmab7的制剂8的粘度在20℃分别为14.1cp，25.0cp和54.4cp。
结果表明，在抗-pd-1抗体浓度≥175g/l时，制剂8(含精氨酸)的粘度低于制剂7。制剂7和8在约150mg/ml的粘度是相似的(图5)。
在5℃，25℃和40℃评估了抗-pd-1抗体制剂7和8的稳定性。使用100mg/ml和150mg/ml抗-pd-1抗体测试制剂7，以及使用150mg/ml抗-pd-1抗体测试制剂8。如上所述，将样品置于5℃、25℃和40℃下，并通过测量聚集(sec)、电荷同工型(ice)、浓度、ph和亚可见颗粒(mfi)评估稳定性。结果总结在表13-21中(nt＝未测试)。
表13、14和15分别总结了在5℃、25℃和40℃时150mg/ml抗-pd-1的制剂7的热稳定性。
表16、17和18分别总结了在5℃、25℃和40℃时10mg/ml抗-pd-1的制剂7的热稳定性。
表19、20和21分别总结了在5℃、25℃和40℃时150mg/ml的抗-pd-1的制剂8的热稳定性。
在所有研究条件下，所有制剂均未观察到蛋白质浓度、ph或亚可见颗粒的显著变化(表13-21)。额外地，在5℃或25℃，未观察到聚集或电荷物质的显著变化。在40℃储存后所有制剂的聚集体(hmms)和酸性物质都增加，但是所有制剂中的增加是相同的，并且对于预期储存条件为5℃的液体制剂，相对增加被认为是可接受的。
这些结果证明在5℃或25℃储存14周后，ph5.0-5.1的含150mg/ml抗-pd-1抗体mab7、20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂7是稳定的(表13和14)。这些结果还证明在5℃或25℃存储14周后，ph5.0-5.1的含100mg/ml抗-pd-1抗体mab7、20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂7是稳定的(表16和17)。这些结果还证明在5℃或25℃储存6周后，ph5.0的含150mg/ml抗-pd-1抗体mab7、20mm组氨酸、100mm精氨酸、50mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂8是稳定的(表19和20)。
通过对制剂施加(stress)5次冻/融(ft)循环亦或24小时搅拌(ag)来确定100和150mg/ml抗-pd-1的制剂7和150mg/ml抗-pd-1的制剂8的冻-融和搅拌稳定性。结果总结在表22中。
类似地，对于制剂7和制剂8，在通过施加冻/融亦或搅拌之后，观察到低水平的聚集体形成，即0.6％(表22)。
这些结果证明在5次冻/融循环或24小时搅拌后，ph5.0-5.1的含100或150mg/ml抗-pd-1抗体mab7、20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂7是稳定的。在5次冻/融循环或24小时搅拌后，ph5.0)的含150mg/ml抗-pd-1抗体mab7、20mm组氨酸，100mm精氨酸hcl、50mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物、0.2mg/mlps80的制剂8也是稳定的。
实施例5.抗-pd-1抗体mab7的糖基化模式
该实施例说明了抗-pd-1抗体mab7的糖基化模式。
通过lc/ms的肽作图确证了位于含有n294st共有序列的重链肽上的一个n-糖基化位点。n294st共有序列基本上被完全占用。对mab7观察到的n-连接寡糖谱显示两个主要的n-聚糖(g0f和g1f)，其两者都是核心岩藻糖基化的复合型双触角型结构。另外，还检测和鉴定了较低丰度的n-聚糖，其对应于截短的和/或岩藻糖基化的复合型双触角型结构、高甘露糖型man5结构和唾液酸化的核心岩藻糖基化的复合型双触角型寡糖。
mab7的n-连接寡糖谱涉及由肽-n-糖苷酶f(pngasef)释放的n-连接寡糖的2-氨基苯甲酰胺(2-ab)标记。用有荧光检测的亲水相互作用液相色谱(hilic)分离2-ab标记的n-连接寡糖，并利用质谱进行结构解析。mab7中的聚糖异质性在图6的图中示出。
实施例6.制剂7中抗-pd-1抗体的评价
该实施例评估将制剂7与
派姆单抗和纳武单抗各个配制于ph5.0的20mm组氨酸缓冲剂、84mg/ml海藻糖二水合物中。将高浓度聚山梨酯80和edta二钠二水合物掺入样品成ph5.0的20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的最终制剂(制剂7)。然后将所有制剂使用0.22umpes过滤器过滤，并使用无蛋白质的制剂7溶液稀释至所需浓度。
派姆单抗以129、150、175和193.mg/ml配制在制剂7中。将纳武单抗以125、148和179mg/ml配制在制剂7中。如上所述测量在20℃的粘度。结果总结在表23中。
表23.在制剂7中抗-pd-1抗体的粘度
结果证明，随制剂7中派姆单抗和纳武单抗的蛋白质浓度变化的粘度与制剂7中抗-pd-1抗体mab7的粘度相当(表12)。
通过用差示扫描量热法测量熔融温度来评估制剂7中的派姆单抗、纳武单抗和抗-pd-1抗体mab7的热稳定性。在分析之前，使用无蛋白质的制剂7溶液将所有三种抗体稀释至1mg/ml。以100℃/小时的升温速率从10℃至110℃进行热扫描。热谱图显示在图7中，且热去折叠的起始(t起始)和熔融温度(tm1，m，2)显示在表24。
表24.制剂7中抗-pd-1抗体的热性质
热稳定性结果证明，制剂7中的派姆单抗、纳武单抗和抗-pd-1抗体mab7具有可比较的热谱、熔融起始温度和熔融温度。
通过测量聚集(sec)、电荷同工型(ice)、浓度、利用还原毛细管电泳(rcge)的纯度、和ph，评估了在40℃下2周的制剂7中150mg/ml的派姆单抗和纳武单抗的稳定性。
结果总结在表25和26中。
这些结果证明，在40℃储存2周后，ph5.0-5.1的含150mg/ml派姆单抗、20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂7是稳定的。这些结果还证明，在40℃储存2周后，ph5.1-5.2的含150mg/ml纳武单抗、20mm组氨酸、84mg/ml海藻糖二水合物、0.05mg/mledta二钠二水合物和0.2mg/mlps80的制剂7是稳定的。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书诸如此类，以及其中所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此其全文通过引用并入。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术诸如此类，则以本申请为准。
之前的描述和实施例详述了本发明的某些特定实施方案，并描述了发明人构思的最佳模式。然而，应当理解，无论前述的可以多么详细地出现在文本中，可以以许多方式来实践本发明，并且应当根据所附权利要求及其任何等效物来解释本发明。
序列表
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