新型富亮氨酸重复神经元蛋白1(LRRN1)抗体和其用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月16日提交的美国专利申请第62/672,363号的权益，所述美国专利申请的公开内容通过全文引用的方式并入本文。

本发明涉及针对富亮氨酸重复神经元蛋白1(lrrn1)的抗体，包含对lrrn1具有特异性的特异性部分或变体，以及编码此类抗体的核酸，以及其使用方法，包含包括抗体的治疗调配物和药物组合物。进一步地，提供了施用本发明的抗体的方法，向受试者施用本发明的抗体有效抑制癌细胞或干细胞。

背景技术：

对包含人胚胎干细胞(hesc)和癌症干细胞在内的干细胞的研究表明，干细胞表面标志物对于监测分化状态或理解干细胞的功能属性至关重要。使用糖蛋白质组学，发现富亮氨酸重复神经元蛋白1(lrrn1)是人胚胎干细胞(esc)的新型表面标志物，所述新型表面标志物在分化成胚状体(eb)时消失。

lrrn1还可以在许多恶性肿瘤细胞中表达，包含卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌和乳腺癌，参见https://www.proteinatlas.org/ensg00000175928-lrrn1/pathology。

由于对有效治疗和/或预防癌症的需求仍未得到满足，故这些发现为针对如lrrn1等干细胞表面糖蛋白的抗体的研发提供了基本原理。本发明提供了针对干细胞表面糖蛋白的抗体，以满足这些和其它需求。

技术实现要素：

本发明公开了一种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括：(a)重链可变结构域，所述重链可变结构域的氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸序列约90％到100％相同；以及(b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域的氨基酸序列与seqidno:2的氨基酸序列约90到100％相同。

本发明还公开了一种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括：(a)第一重链互补决定区(hcdr1)，所述hcdr1的氨基酸序列与seqidno:3、seqidno:9或seqidno:15约90％到100％相同；(b)第二重链互补决定区(hcdr2)，所述hcdr2的氨基酸序列与seqidno:4、seqidno:10或seqidno:16约90％到100％相同；(c)第三重链互补决定区(hcdr3)，所述hcdr3的氨基酸序列与seqidno:5、seqidno:11或seqidno:17约90％到100％相同；(d)第一轻链互补决定区(lcdr1)，所述lcdr1的氨基酸序列与seqidno:6、seqidno:12或seqidno:18约90％到100％相同；(e)第二轻链互补决定区(lcdr2)，所述lcdr2的氨基酸序列与seqidno:7、seqidno:13或seqidno:19约90％到100％相同；以及(f)第三轻链互补决定区(lcdr3)，所述lcdr3的氨基酸序列与seqidno:8、seqidno:14或seqidno:20约90％到100％相同。

还提供了缀合物，所述缀合物包括本文所描述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分可操作地附着到治疗剂或诊断剂。

还提供了用于通过向有需要的受试者施用本文所描述的抗体或其抗原结合部分来抑制癌细胞的方法。

本专利中使用的术语“发明(invention)”、“本发明(theinvention)”、“本发明(thisinvention)”和“本发明(thepresentinvention)”旨在广义地指代本专利的主题和下面的专利权利要求全部。含有这些术语的陈述应被理解为不限制本文所述的主题或不限制下面的专利权利要求的含义或范围。本专利所覆盖的本发明的实施例由下面的权利要求而非本概述来限定。本概述是本发明的各个方面的高级概括并且介绍了在下面的具体实施方式部分中进一步描述的概念中的一些概念。本概述不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在单独使用以确定所要求保护的主题的范围。应当通过参考整个说明书的适当部分、任何或所有附图和每个权利要求来理解本主题。

附图说明

本专利含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利的副本。

下面参考附图对本发明的说明性实施例进行详细描述。

图1是示出了通过akt介导的lrrn1对干性维持和中内胚层分化的作用的图形摘要。

图2a和图2b是展示了alexa488标记的lrrn1单克隆抗体在乳腺癌细胞中的内化的荧光显微镜术图像。

图3是展示了lrrn1e36单克隆抗体在有或没有pbmc温育的情况下相比于对照组以及有或没有pbmc温育的igg的抗体依赖性细胞毒性(adcc)的条形图。

具体实施方式

如本文所使用的，冠词“一个/一种(a/an)”是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。

术语“受试者”可以指怀疑患有癌症的脊椎动物。受试者包含温血动物，如哺乳动物，如灵长类动物，并且更优选地，人。非人灵长类动物也是受试者。术语受试者包含如猫、狗等家养动物、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。如本文所使用的“有效量”是指足以减轻癌症的症状和体征，如体重减轻、疼痛和可触知的肿块的抗体或缀合物的剂量，所述可触知的肿块是在临床上作为可触知的肿块或在放射学上通过各种成像手段可检测的。术语“有效量”和“治疗有效量”可互换使用。

本文中的所有数字均可以被理解为由“约”修饰。如本文所使用的，术语“约”意指涵盖±10％的变化。

抗体

如本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有免疫特异性地结合糖蛋白的抗原结合部分的分子。这样，术语抗体不仅涵盖完整的抗体分子，而且还涵盖抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包含衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。有五个主要的重链类别(或同种型)决定抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。每条链含有不同的序列结构域。轻链包含两个结构域，可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包含四个结构域，可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3，统称为ch)。轻链(vl)和重链(vh)两者的可变区决定了对干细胞表面糖蛋白的结合识别和特异性。抗体的轻链和重链各自具有三个互补决定区(cdr)，分别指定为lcdr1、lcdr2、lcdr3和hcdr1、hcdr2、hcdr3。因此，抗原结合位点包含六个cdr，包括来自重链可变区和轻链可变区中的每个可变区的cdr组。框架区(fr)是指插入在cdr之间的氨基酸序列。

关于本发明的指定氨基酸序列的一致性或同源性在本文中被定义为，在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大同源性或一致性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同源性或一致性的一部分的情况下，候选序列中的与指定残基相同的氨基酸残基的百分比。指定序列的n端、c端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响同源性或一致性。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。虽然可以使用常规方法手动完成此类比对，但以下中描述了各种程序和比对算法：smith和waterman,《应用数学进展(adv.appl.math.)》2:482,1981；needleman和wunsch,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》48:443,1970；pearson和lipman,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》85:2444,1988；higgins和sharp,《基因(gene)》73:237,1988；higgins和sharp,cabios5:151,1989；corpet等人,《核酸研究(nucleicacidsresearch)》16:10881,1988；以及pearson和lipman,《美国国家科学院院刊》85:2444,1988。altschul等人,《自然·遗传学(naturegenet.)》6:119,1994，提出了对序列比对方法和同源性/一致性计算的详细考虑。ncbi基本局部比对搜索工具(blast(altschul等人,《分子生物学杂志》215:403,1990))可从若干个来源获得，包含国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(ncbi，马里兰州贝塞斯达(bethesda,md.))和在网上，以用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。在ncbi网站上可获得如何使用此程序测定序列一致性或同源性的说明。

本发明的抗体还包含从本发明的抗体产生的嵌合化或人源化单克隆抗体。在一个实施例中，人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，所述抗体分子具有来自非人物种的一个、两个或所有cdr以及来自人免疫球蛋白分子的一个、两个或所有三个框架区。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子。例如，抗体可以含有衍生自鼠类mab的可变区以及人免疫球蛋白恒定区。嵌合抗体可以通过重组dna技术产生。morrison等人,《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984)。例如，用限制性酶来消化编码鼠类(或其它物种)抗体分子的基因以除去编码鼠类fc的区域，并且然后将编码人fc恒定区的基因的等价部分取代到重组dna分子中。嵌合抗体也可以通过重组dna技术产生，其中编码鼠类v区的dna可以与编码人恒定区的dna连接。better等人,《科学(science)》,1988,240:1041-1043。liu等人,《美国国家科学院院刊》,198784:3439-3443。liu等人,《免疫学杂志(j.immunol.)》,1987,139:3521-3526。sun等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84:214-218。nishimura等人,《癌症研究(canc.res.)》,1987,47:999-1005。wood等人,《自然(nature)》,1985,314:446-449。shaw等人,《美国国立癌症研究所杂志(j.natl.cancerinst.)》,1988,80:1553-1559。国际专利公开号wo1987002671和wo86/01533。欧洲专利申请号184,187；171,496；125,023；以及173,494。美国专利号4,816,567。

因此，本发明的lrrn1抗体包含与非鼠源，优选地人源的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分之组合，这可以并入本发明的抗体中。

本发明的抗体能够在体外、原位和/或在体内调节、减少、拮抗、减轻、缓解、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种lrrn1表达性细胞(例如，表达lrrn1的癌细胞或干细胞)活性，如干性或分化。

术语“抗体”进一步旨在涵盖抗体、消化片段、其指定部分和变体，包含抗体模拟物或包括模拟抗癌抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包含单链抗体和其片段，每个单链抗体和其片段含有衍生自本发明的抗癌抗体的至少一个cdr。功能片段包含与lrrn1结合的抗原结合部分。例如，本发明涵盖能够与lrrn1或其各部分结合的抗体片段，包含但不限于fab(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、fab'(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)和f(ab')2(例如，通过胃蛋白酶消化)、facb(例如，通过纤溶酶消化)、pfc'(例如，通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚)、fv或scfv(例如，通过分子生物学技术)片段、分离的cdr、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明还涵盖通过使用重组方法或合成连接子连接抗体片段而产生的单链抗体。bird等人,《科学》,1988,242:423-426。huston等人,《美国国家科学院院刊》,1988,85:5879-5883。

抗体的抗原结合部分可以包含抗体的与干细胞表面糖蛋白(例如，lrrn1)特异性结合的部分。

根据本发明的一方面，通过以下方法之一来确定vh和vl的cdr和框架残基的位置：eakabat等人,(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,第五版,美国卫生与公共事业部(u.s.departmentofhealthandhumanservices),nih公开号91-3242；mbswindells等人,“abysis：整合抗体序列和结构—管理、分析和预测(abysis:integratedantibodysequenceandstructure-management,analysis,andprediction)”《分子生物学杂志》2017年2月3日；429(3):356-364.doi:10.1016/j.jmb.2016.08.019；jye等人,“igblast：免疫球蛋白可变结构域序列分析工具(igblast:animmunoglobulinvariabledomainsequenceanalysistool)”《核酸研究》203；41(web服务器问题(webserverissue)):w34-40.doi:10.1093/nar/gkt38；vkunik等人,“抗体的结构共识定义了抗原结合位点(structuralconsensusamongantibodiesdefinestheantigenbindingsite)”《plos计算生物学(ploscomputbiol)》2012年；8(2):e1002388.doi:10.1371/journal.pcbi.1002388；或vkunik等人,“paratome：用于基于序列或结构系统地鉴别抗体中的抗原结合区的在线工具(paratome:anonlinetoolforsystematicidentificationofantigenbindingregionsinantibodiesbasedonsequenceorstructure)”《核酸研究》2012年7月；40(web服务器问题):w521-4.doi:10.1093/nar/gks480.电子版2012年6月6日。

根据本发明的另一方面，抗体或其抗原结合部分可以具有以下结构：

前导序列-fw1-cdr1-fw2-cdr2-fw3-cdr3-

本发明还涵盖抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括一个或两个如本文所公开的可变区，其中其它区域被来自至少一种不同物种的序列置换，所述至少一种不同的物种包含但不限于人、兔、绵羊、狗、猫、奶牛、马、山羊、猪、猴、猿、大猩猩、黑猩猩、鸭、鹅、鸡、两栖动物、爬行动物和其它动物。

本发明的抗体或其抗原结合部分可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性或双特异性抗体或其片段可以对一个靶干细胞表面糖蛋白(例如，lrrn1)的不同表位具有特异性。在一个实施例中，多特异性抗体或其抗原结合部分包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独的表位或同一干细胞表面糖蛋白上的不同表位特异性结合。参见tutt等人,1991,《免疫学杂志》147:60-69以及kufer等人,2004,《生物技术趋势(trendsbiotechnol.)》22:238-244。

本发明涵盖所有抗体同种型，包含igg(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、iga(iga1、iga2)、igd或ige(本发明涵盖所有类别和子类别)。抗体或其抗原结合部分可以是哺乳动物(例如，小鼠、人)抗体或其抗原结合部分。抗体的轻链可以是κ或λ类型。

本发明提供了如单克隆抗体等抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包括与干细胞表面糖蛋白(如lrrn1)或其片段结合的可变区。

lrrn1敲低降低了hesc的自我更新能力并使分化朝向内胚层/中胚层谱系偏斜。从机制上讲，lrrn1沉默会降低akt磷酸化、使多能性因子oct4、sox2和nanog从细胞核易位到细胞质，这会导致降解。因此，lrrn1对于维持hesc自我更新和多能性至关重要。

在本发明的一方面，抗体或其抗原结合部分包括重链可变区，其中所述重链可变区包括三个cdr，即，hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1的氨基酸序列与seqidno:3、9或15中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同，hcdr2的氨基酸序列与seqidno:4、10或16中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同，hcdr3的氨基酸序列与seqidno:5、11或17中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同。

在本发明的另一方面，抗体或其抗原结合部分包括轻链可变区，其中所述轻链可变区包括三个互补决定区(cdr)，即，lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中lcdr1的氨基酸序列与seqidno:6、12或18中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同，lcdr2的氨基酸序列与seqidno:7、13或19中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同，lcdr3的氨基酸序列与seqidno:8、14或20中所示的氨基酸序列约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分包括重链可变区(vh)，所述vh的氨基酸序列与seqidno:1约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同，和/或轻链可变区(vl)包括轻链，所述轻链的氨基酸序列与seqidno:2约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源或相同。

表1示出了本发明的抗体的一个实施例的重链可变区、轻链可变区和cdr的氨基酸序列。

表1.本发明的lrrn1抗体的氨基酸序列

1.序列是根据以下确定的：swindellsmb、porterct、couchm等人,(2017)abysis：整合抗体序列和结构—管理、分析和预测《分子生物学杂志》2017年2月3日；429(3):356-364.doi:10.1016/j.jmb.2016.08.019。

2.序列是根据以下确定的：yej、man、maddentl和ostelljm(2013).igblast：免疫球蛋白可变结构域序列分析工具《核酸研究》41(web服务器问题):w34-40.doi:10.1093/nar/gkt382

3.序列是根据以下确定的：kunikv、petersb、ofrany(2012).抗体的结构共识定义了抗原结合位点《plos计算生物学》8(2):e1002388.doi:10.1371/journal.pcbi.1002388。

4.序列是根据以下确定的：kunikv、ashkenazis、ofrany(2012).paratome：用于基于序列或结构系统地鉴别抗体中的抗原结合区的在线工具《核酸研究》2012年7月；40(web服务器问题):w521-4.doi:10.1093/nar/gks480.电子版2012年6月6日

在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分与包含但不限于lrrn1的干细胞表面糖蛋白结合。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分具有体外和体内治疗、预防和/或诊断用途。例如，可以将这些抗体例如在体外或离体地施用于培养物中的细胞或例如在体内施用于受试者，以治疗、抑制、预防复发和/或诊断疾病，如癌症。

用于抑制癌细胞或人干细胞的方法

本发明的抗体或缀合物能够在体外、原位和/或在体内调节、减少、拮抗、减轻、缓解、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种干细胞表面糖蛋白或其片段。

本发明还提供了用于在体外、离体或在体内抑制癌细胞或干细胞的生长的方法，其中癌细胞或干细胞与有效量的如本文所描述的抗体或缀合物接触。癌细胞和干细胞表达干细胞表面糖蛋白，如lrrn1。lrrn1表达性癌症的非限制性实例包含胶质瘤、淋巴瘤、肺癌、胰腺癌、类癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、皮肤癌或黑素瘤。

可以使用本领域众所周知的方法来确定本发明抗体或缀合物的体外功效。mtt测定基于代谢活性细胞摄取mtt四唑盐的原理，在所述代谢活性细胞中，mtt被代谢成可以用光谱法读取的蓝色的甲瓒产物。《免疫学方法杂志(j.ofimmunologicalmethods)》65:5563,1983。本发明抗体或其抗原结合部分的细胞毒性可以通过克隆形成测定来研究。可以通过elisa执行用于结合lrrn1的功能测定。可以通过标准碘化丙啶(pi)染色和流式细胞术来研究抗体或其抗原结合部分的细胞周期阻断。侵袭抑制可以通过博伊登室(boydenchamber)研究。在此测定中，将重组基底膜基质胶的层涂覆在趋化性滤器上并充当细胞在博伊登室中迁移的屏障。只有具有侵袭能力的细胞才可以穿过基质胶屏障。其它测定包含但不限于细胞活力测定、凋亡测定和形态学测定。也可以使用鼠类模型在体内进行测定。参见例如，b.teicher,用于功效确定的肿瘤模型(tumormodelsforefficacydetermination)《分子癌症治疗学(molcancerther)》2006；5:2435-2443。

缀合物

在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分可以与另一个功能分子，例如诊断剂或治疗剂连接或共表达，以形成缀合物。例如，抗体或其抗原结合部分可以可操作地附着到(例如，通过化学偶联、遗传融合、重组表达、可裂解间隔子或连接子、共价或非共价缔合或其它方式)一个或多个其它分子实体。

在一个实施例中，治疗剂可以增强并且甚至协同本发明的抗体的作用。治疗剂的非限制性实例包含化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂和抗微管蛋白药物或第二单克隆抗体或多克隆抗体。

示例性化学治疗剂包含：类固醇；细胞因子；抗代谢物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氨基喋呤；蒽环类药物；丝裂霉素c；长春花生物碱；抗生素；地美可辛；依托泊苷；光神霉素；以及抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或美法仑。示例性抗血管生成剂包含血管抑素(angiostatin)、内皮抑素、血管抑制素(vasculostatin)、血管能抑素和乳腺丝抑蛋白。示例性抗微管蛋白药物包含秋水仙碱、紫杉醇、长春花碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)和康普瑞汀(例如，康普瑞汀a、b和/或d)。示例性抗微管蛋白药物是秋水仙碱；紫杉烷，如紫杉醇；长春花生物碱，如长春花碱、长春新碱和长春地辛；以及康普瑞汀。

据报道，以下治疗剂与抗体缀合：阿霉素、道诺霉素、甲氨蝶呤和长春花碱新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌(trenimon)和α-鹅膏蕈碱(参见美国专利第5,660,827号、第5,855,866号和第5,965,132号)。

本发明抗体和缀合物的施用途径包含但不限于静脉内、肌肉内、鼻内、皮下(subcutaneous)、口服、局部、皮内、透皮、真皮下(subdermal)、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用。

出于预防或治愈目的等，抗体或缀合物可以在适合于受试者的年龄、体重和病状、所使用的特定组合物以及施用途径的时间表和时间段内以单剂量治疗或以多剂量治疗施用。例如，在一个实施例中，根据本发明的抗体或缀合物按每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天一次(qod)、每天一次(qd)、一天两次(qid)或一天三次(tid)施用。

为了易于施用和剂量均匀，可以使用口服或肠胃外剂量单位形式。如本文所使用的，剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生期望的治疗效果的预定量的抗体。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于在人类中使用的一系列剂量。在一个实施例中，抗体或缀合物的剂量在包含ed50在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。在另一个实施例中，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。在动物模型中可以将剂量配制为实现包含如在细胞培养中测定的ic50(即，测试化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。sonderstrup,斯普林格出版社(springer),《免疫病理学研讨会(sem.immunopathol.)》25:35-45,2003。nikula等人,《吸入毒理学(inhal.toxicol.)》4(12):123-53,2000。

抗体或缀合物的有效量取决于受试者和待治疗病状。在一个实施例中，本发明抗体或其抗原结合部分以范围为以下的剂量施用：约0.01mg到约10g、约0.1mg到约9g、约1mg到约8g、约2mg到约7g、约3mg到约6g、约10mg到约5g、约20mg到约1g、约50mg到约800mg、约100mg到约500mg、约0.01μg到约10g、约0.05μg到约1.5mg、约10μg到约1mg蛋白质、约30μg到约500μg、约40μg到约300μg、约0.1μg到约200μg、约0.1μg到约5μg、约5μg到约10μg、约10μg到约25μg、约25μg到约50μg、约50μg到约100μg、约100μg到约500μg、约500μg到约1mg、约1mg到约2mg。任何特定受试者的具体剂量水平取决于各种各样的因素，包含特异性肽的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物组合以及经受疗法的特定疾病的严重性并且可以由本领域普通技术人员确定，而无需过多的实验。

以下用于执行本发明的具体方面的实例仅出于说明性目的提供，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实例

材料与方法

细胞培养和试剂

从胚胎干细胞国际公司(escellinternational)(esi，新加坡)和wicell研究所(wicellresearchinstitute)(美国)获得hesc细胞系hes-5和h9，并在基质胶涂覆的板中在辐射小鼠胚胎成纤维细胞(mef)层上进行培养。hesc生长培养基由80％dmem/f12、20％敲除血清替代品(美国英杰公司(invitrogen,usa))、1mml-谷氨酰胺、0.1mmβ-巯基乙醇和4ng/mlfgf-2(英杰公司)组成。在使用前，以1.2×10⁵个细胞/ml的密度，将hesc生长培养基在丝裂霉素c(美国西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich,usa))灭活的mef上调节24小时。

为了诱导hesc到eb的分化，用1mg/ml分散酶处理hesc大约30分钟，直到细胞完全从板脱离。然后，将细胞悬浮液转移到锥形管中。在细胞通过重力沉降后，除去培养基，并用hesc生长培养基洗涤细胞两次。为了诱导eb长出，将细胞转移到含有无fgf-2的hesc生长培养基的超低附着细胞培养烧瓶(康宁公司(corning))中大约48小时。然后，使样品在明胶涂覆的组织培养皿或具有培养基的烧瓶中另外生长2周，所述培养基由80％dmem/f12、20％fbs、1mml-谷氨酰胺、0.1mmβ-巯基乙醇和0.5％青霉素和链霉素组成。培养基每隔一天进行更换。

质粒产生和慢病毒转导

为了质粒构建，将人lrrn1的全长编码序列(lrrn1，登录号nm_020873.5，seqidno:21)用特异性正向引物(gatcggatccatggctaggatgagctttgttatagca，seqidno:22)和反向引物(gatcctcgagttaccacatgtaatagcttctggatgtgt，seqidno:23)克隆到plkoas3w.puro载体(国家型rnai核心设施(nationalrnaicorefacility))中。通过添加8μg/ml聚凝胺(西格玛奥德里奇公司)，由病毒以感染复数(moi)10感染细胞。

定量rt-pcr

使用rneasy迷你试剂盒从hescs和eb生长细胞中提取总rna，并根据制造商的方案用不含rnase的dnasei组(德国希尔登的凯杰公司(qiagen,hilden,germany))进行处理。使用低聚核苷酸(dt)15引物和逆转录系统(普洛麦格公司(promega))对总rna(1μg)进行逆转录。使用lightcycler480sybrgreeni主混合物(罗氏公司(roche))执行定量rt-pcr(qpcr)，并用lightcycler480ii实时pcr系统(罗氏公司)进行分析。研究了以下标志物基因以分化滋养外胚层、内胚层、中胚层和外胚层：gapdh、lrrn1、oct4、nanog、sox2、cdx2、eomes、hand1、gata6、gata4、sox17、afp、brachyury、wt1、twist、bmp4、sox1、pax6和neurod1。使用gapdh作为内部对照组。

蛋白质印迹

从悬浮于具有蛋白酶抑制剂(罗氏公司，瑞士)的ripa裂解缓冲液中的细胞制备细胞提取物。离心后，将上清液溶解在laemmli样品缓冲液(美国伯乐公司(bio-rad,usa))中，以进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。在sds-page中分离出大约50μg蛋白质，并将其电转移到pvdf膜上。将膜用5％脱脂乳阻断并且然后在4度下用以下第一抗体探测过夜：抗lrrn1(af4990，美国r&d系统公司(r&dsystems,usa))、抗oct4(sc-5279，美国圣克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology,usa))、抗nanog(ab21624，英国艾博抗公司(abcam,uk))、抗sox2(mab4343，,美国默克密理博公司(merckmillipore,usa))、抗磷酸化akt(4060，美国细胞信号传导技术公司(cellsignalingtechnology,usa))、抗akt(sc-8312，圣克鲁兹公司)和抗actin(a5441，西格玛奥德里奇公司)。在与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(美国杰克逊免疫研究公司(jacksonimmunoresearch,usa))温育后，然后使用immobilonwestern化学发光hrp底物(密理博公司)使膜可视化。用image-quant5.2软件(美国通用电器医疗集团(gehealthcare,usa))对蛋白质印迹结果进行定量。

从半对数转换的最佳拟合线的斜率计算oct4、nanog和sox2蛋白的半衰期。衰减曲线使用蛋白质数量的线性回归进行单独分析并表达为剩余蛋白质相对于时间的百分比，如先前在以下中描述的：o.adewumi等人,国际干细胞研究组织对人胚胎干细胞系的表征(characterizationofhumanembryonicstemcelllinesbytheinternationalstemcellinitiative)《自然生物技术(naturebiotechnology)》2007；25:803。

蛋白质稳定性测定

为了测定oct4、nanog和sox2的稳定性，使用慢病毒质粒(可从中央研究院分子生物学研究所的国家型rnai核心设施获得)沉默hesc中lrrn1的表达。用100μg/ml的环己酰亚胺(密理博公司)处理lrrn1沉默的细胞和对照细胞，以抑制蛋白质合成，并且随后在0、30、60、90和120分钟后收获。为了检查通过蛋白酶体降解对oct4、nanog和sox2的衰减，在与chx温育之前，将lrrn1沉默的hesc用10μm苄氧羰基-leu-leu-亮氨酸(mg132)(西格玛奥德里奇公司)进行预处理，以抑制蛋白酶体活性2小时。然后，在30、60、90和120分钟收获细胞，并对样品进行处理以用于蛋白质印迹分析。

细胞增殖测定

根据制造商的说明书，使用(启用激光的分析和处理)细胞处理工作站(美国英创松公司(intrexoncorp,usa))测定细胞增殖。简而言之，将对照细胞和lrrn1沉默的hesc以每孔5×10³个细胞接种在96孔板中。然后，将细胞在第1到3天分别用dapi(西格玛奥德里奇公司)进行染色并使用可视化。使用工作站在第1天、第2天和第3天测量对照hesc和lrrn1沉默的hesc的生长曲线，以从dapi染色细胞核测定细胞数。

细胞活力测定

通过与10％alamarblue试剂(美国biosource国际公司(biosourceinternational,usa))温育2小时、随后使用分光光度计(spectramax190，美国分子仪器公司(moleculardevices,usa))进行荧光测量(激发：544nm，发射：590nm)来测定细胞活力。

流式细胞术和共聚焦显微镜分析

为了检查lrrn1的表面表达，用抗lrrn1(e36)单克隆抗体进行流式细胞术分析。制备hesc(h9)和13天eb的单细胞悬浮液，并将其与本发明的lrrn1e36单克隆抗体在4℃下共温育60分钟。用冷pbs洗涤后，在4℃下添加与alexafluor488(杰克逊免疫研究公司)和7-aad(bd生物科学公司(bdbiosciences))缀合的第二抗体，持续20分钟。洗涤样品并用流式细胞仪(ec-800仪器，美国索尼生物科技公司(sonybiotecnology,usa))测定。用flowjo软件进行数据分析。在对活细胞群(即，7-aad^-细胞)进行门控后，分析抗lrrn1⁺细胞的百分比。

为了进行共聚焦成像分析，将hesc接种到隔室型载玻片(chamberslide)(易必迪公司(ibidi))上，如上文所描述地生长，用pbs洗涤，在4℃下用4％多聚甲醛/pbs固定15分钟，在pbs中漂洗并且在室温下用5％bsa/pbs阻断30分钟。将样品与igg对照组和lrrn1e36单克隆抗体(1:100)在室温下温育1小时。然后，将细胞用pbs洗涤并与alexafluor488affinipure山羊抗人igg第二抗体(杰克逊免疫研究公司)在室温下温育1小时并且用dapi复染。通过共聚焦显微镜术(leicatcssp8)监测lrrn1染色的强度和定位；结合混合检测器，用100x/1.4油浸物镜收集dapi和alexa-488图像。使用lasx软件(徕卡公司(leica))分析所得的z堆叠荧光图像。

免疫荧光分析

在hesc转导7天后，将对照hesc和lrrn1沉默的hesc(使用慢病毒质粒)在室温下在4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水(pbs)中固定15分钟、在pbs中用0.5％tritonx-100渗透5分钟，并且然后用5％牛血清白蛋白(bsa)/pbs阻断细胞30分钟。然后将细胞与第一抗体在4℃下温育。为了进行胚层标志物分析，使用了以下第一抗体：抗hand1(sc-9413，圣克鲁兹公司)、抗sox17(af1924，r&d公司)、抗α-胎蛋白(ab21624，艾博抗公司)、抗wt1(sc-192，圣克鲁兹公司)和抗pax6(sc-53106，圣克鲁兹公司)。为了进行细胞核定位分析，使用识别了oct4(圣克鲁兹公司)、nanog(艾博抗公司)和sox2(密理博公司)的第一抗体。

在与第一抗体温育过夜后，将细胞用pbs洗涤三次并在室温下与第二抗体温育1小时。所使用的第二抗体是alexafluor488缀合的山羊抗小鼠和抗兔igg以及alexafluor555缀合的山羊抗小鼠和抗兔igg(英杰公司)。用pbs洗涤后，将细胞与dapi温育以进行细胞核染色并且然后通过荧光显微镜术(leicadmi3000b)可视化。为了阻断oct4、nanog和sox2的细胞核输出，在mg132存在的情况下，将lrrn1沉默的hesc用mg132处理2小时并且然后用20ng/ml轻肌蛋白b(lmb，西格玛奥德里奇公司)另外处理6小时。

畸胎瘤形成

将大约2-5×10⁶个hesc或lrrn1沉默的hesc(使用慢病毒质粒，中央研究院)重悬于200μl的汉克平衡盐溶液(hank'sbalancedsaltsolution)中并皮下注射到五周龄的nod/scid小鼠中。8周后，通过手术收集形成畸胎瘤的对照hesc和lrrn1沉默的hesc，并且然后用4％甲醛固定并石蜡包埋。进行免疫组织化学分析以鉴别三个胚胎胚层。为了用针对三种胚层标志物sox17(内胚层标志物)、αsma(中胚层标志物)和nestin(外胚层标志物)的抗体进行标记，进行一般免疫组织化学染色方案。

使用stemformics数据库进行数据挖掘

使用stemformatics(www.stemformatics.org)数据库分析未分化的hesc或ipsc中lrrn1mrna相比于其各种分化衍生物的相对表达。从不同的数据集中整理lrrn1结果的log2表达，并针对lrrn1的差异表达进行评估。选择含有干细胞和分化细胞两者的数据集，排除从疾病样品中读出的结果，并收集野生型或健康供体细胞。所使用的数据集是maherali_2008_18786420、guenther_2010_20682450、marchetto_2010_21074045、jia_2010_20139967、hu_2011_21296996、zhang_2011_21185252、koyanagi-aoi_2013_24259714a和petrova_2014_24936454。

结果

lrrn1在hesc中高度表达

通过以下方式使用糖蛋白质组学分析来比较未分化hesc(hes-5)和16天eb生长细胞的糖蛋白表达模式：(i)与mannacyne温育并通过hesc和eb生长细胞中的聚糖生物合成机制将mannacyne掺入唾液酸化蛋白中；(ii)细胞裂解和点击化学反应以连接炔基唾液酸化糖缀合物和生物素叠氮化物；(iii)用链霉亲和素琼脂糖珠对生物素标记的唾液酸化糖缀合物进行亲和力捕获；(iv)珠上的唾液酸化糖蛋白的胰蛋白酶消化、随后用pngasef消化；以及(v)肽混合物的lc-ms/ms分析，这鉴别了hesc中富含的n连接的唾液酸糖蛋白。糖蛋白质组学分析表明，与eb相比，alpl、prom1、thy1和lrrn1在hesc中具有更高的表达。

为了检查lrrn1的细胞定位，使用完整细胞进行流式细胞术分析和共聚焦显微镜术分析。特异性识别lrrn1(关于氨基酸序列，参见表1)的lrrn1e36单克隆抗体用于完整细胞的流式细胞术分析中。

lrrn1e36单克隆抗体是从已知的噬菌体展示的scfv抗体文库技术平台生成的，以分离与人胚胎干细胞(hesc)的质膜标志物特异性结合的靶向配体。已经鉴别了特异性噬菌体克隆，所述特异性噬菌体克隆可以与未分化人胚胎干细胞结合并根据这些表面标志物的表达水平监测干细胞分化和发展的阶段。此外，特异性靶向配体用于未分化的hesc，以纯化、表征干细胞(例如，lrrn1)上的靶蛋白并进行其功能研究。然后，确定带有靶配体的噬菌体颗粒的单一克隆的序列；并且将dna插入质粒中并在293t细胞中产生以用于mab产生。发现lrrn1e36抗体的表位定位于lrrn1的lrr结构域。

如使用lrrn1e36单克隆抗体测定的，针对lrrn1表达，90.7％的hesc和11.8％的eb生长细胞呈阳性。经过免疫染色的未分化的hesc的共聚焦显微镜术表明，lrrn1定位于细胞的表面。此外，与eb生长细胞相比，hesc细胞中lrrn1的mrna水平高至少4倍。与eb生长细胞相比，hes-5和h9hesc两者中lrrn1的蛋白水平高4到10倍。

在诱导分化之前hesc中的lrrn1表达显著高于分化的衍生物(在各种数据集中为20-800倍)。与成纤维细胞中相比，lrrn1的mrna水平在ipsc中表达更高(增加430±111倍)。ipsc分化后，lrrn1的mrna水平下降到13.5±8.9。总体而言，这些数据证实，lrrn1的表达可以是未分化的hesc的独特标志物。

lrrn1基因敲低在hesc中的作用

使用慢病毒质粒(中央研究院)在hesc中沉默lrrn1表达3天，将lrrn1的蛋白质表达敲低约90％(相对倍数为1.0到0.1)。由于培养7天后细胞凋亡增加，因此lrrn1敲低导致hesc增殖明显减少。

lrrn1沉默在hesc中的作用

在第7天通过qpcr测量对照hesc和lrrn1沉默的hesc中三种胚层标志物的mrna水平(使用慢病毒质粒，可从中央研究院获得)。与对照hesc相比，lrrn1沉默的细胞中eomes、gata4、α-胎蛋白(afp)、sox17、brachyury、wt1和twist上调了至少4倍。相比之下，lrrn1沉默对sox1、pax6和neurod1的水平具有很小作用。这些结果表明，lrrn1对于hesc的多能性的维持至关重要。通过免疫荧光染色未观察到pax6表达，这表明lrrn1沉默后缺乏朝向外胚层谱系的分化)。

在体内畸胎瘤形成测定中，hesc可以分化为三个胚层。然而，在lrrn1沉默的hesc中仅观察到内胚层和中胚层。因此，lrrn1在hesc中的功能丧失导致在体外和在畸胎瘤测定中朝向内胚层和中胚层谱系的发展倾斜。

使用qpcr分析基因表达谱，并且在hesc中有或没有lrrn1沉默的情况下，oct4、nanog和sox2的mrna水平未示出显著差异。总体而言，hesc中lrrn1的沉默不会影响多能性因子的mrna水平，但会以某种方式影响hesc的分化能力。

lrrn1对多能性因子的作用

如通过感染5天后的蛋白质印迹分析所示，lrrn1沉默的细胞中的nanog和sox2蛋白水平分别下降到对照值的30％和20％。相比之下，oct4蛋白表达仅略有下降(对照值的70％)。

用抑制新蛋白质合成的环己酰亚胺(chx)处理对照hesc和lrrn1沉默的hesc，随后进行蛋白质印迹分析以检查内源oct4、nanog和sox2的稳定性。chx处理后收获细胞，其示出在对照hesc和lrrn1沉默的hesc两者中，oct4、nanog和sox2蛋白水平在chx处理的2小时内有所下降。在对照细胞中，oct4、nanog和sox2展现出半衰期分别为118、69和58分钟。然而，在lrrn1沉默的细胞中，oct4、nanog和sox2具有缩短的半衰期：71、35和21分钟。

评估在mg132(蛋白酶体抑制剂)存在的情况下hesc中oct4、nanog和sox2的稳定性，以确定lrrn1沉默后oct4、nanog和sox2的不稳定性是否可以归因于蛋白酶体途径。chx接种前，用mg132预处理lrrn1沉默的细胞2小时。然后收获细胞并通过蛋白质印迹分析针对oct4、nanog和sox2进行分析。mg132的添加增加了由lrrn1沉默引起的oct4、nanog和sox2的表达水平和半衰期。这些结果表明，下降的lrrn1表达通过活化蛋白酶体降解来抑制oct4、nanog和sox2表达。

使用免疫荧光染色检查lrrn1沉默对hesc中oct4、nanog和sox2蛋白的易位的作用。在对照细胞中，oct4、nanog和sox2蛋白主要定位于细胞核中并且不定位于细胞质中，而在lrrn1沉默后，这些蛋白质展现出显著更少的细胞核绿色荧光，但在细胞质中未观察到荧光。值得注意的是，mg132处理增加了细胞质中oct4(36％)、nanog(32％)和sox2(42％)的细胞百分比。此外，用细胞核输出受体crm1的特异性抑制剂lmb进行治疗降低了细胞质中oct4(6％)、nanog(8％)和sox2(10％)的细胞百分比。lmb治疗逆转了lrrn1沉默的作用这一观察表明，细胞核oct4、nanog和sox2向细胞质的易位至少部分地取决于crm1介导的细胞核输出途径。

鉴于lrrn1沉默会缩短多能性因子(oct4、nanog和sox2)的半衰期，检查akt信号传导在影响多能性因子的稳定性中的作用。lrrn1沉默的细胞示出显著较低的akt磷酸化水平。与对照组的水平相比，p-akt(s473)和p-akt(t308)水平均分别下降到48％和35％。

由于碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)是akt信号传导的关键活化剂，因此研究了从生长培养基中除去bfgf时lrrn1过表达补偿减少的akt信号传导的可能性。用表达全长lrrn1的慢病毒将hesc转染24小时，从而导致lrrn1过表达并在没有bfgf的生长培养基中另外培养24或48小时。在除去bfgf后0小时，对照细胞和lrrn1过表达性细胞中的p-akt(s473)蛋白水平类似。然而，撤回bfgf24或48小时后，对照细胞中p-akt(s473)的水平以时间依赖性方式降低。相比之下，lrrn1的过度表达阻止了由bfgf的不存在引起的p-akt(s473)下降。

检查在bfgf刺激不存在的情况下lrrn1过表达对hesc中oct4、nanog和sox2从细胞核到细胞质的易位的作用。在具有bfgf的对照细胞中，在细胞核中均观察到荧光标记的oct4、nanog和sox2蛋白。从对照细胞中除去bfgf后，标记的oct4、nanog和sox2蛋白示出较少的细胞核荧光。然而，在没有bfgf的hesc中的lrrn1过表达显著恢复了oct4、nanog和sox2的细胞核荧光标记。这些数据表明，lrrn1活化了hesc中的akt，并且此活化可以影响多能性因子的亚细胞分布。

使用特异性akt抑制剂(akti-1/2)研究了akt抑制和lrrn1沉默对多能性因子表达的作用。结果表明，在浓度高达40μm时，akti-1/2处理不会影响hesc的活力，并且oct4和sox2蛋白水平呈剂量依赖性下降，同时pakt水平下降。相比之下，nanog蛋白水平在akti-1/2浓度高达20μm时仅略有下降，但在akti-1/2浓度增加到40um时显著下降。在mg132和lmb存在或不存在的情况下进行akti-1/2处理后对hesc进行免疫染色。在未处理的细胞中，oct4、nanog和sox2蛋白全部累积在细胞核中，而在akti-1/2处理后，oct4和sox2标记展现出较低强度的细胞核荧光。nanog标记在细胞核中展示出更强的荧光。mg132处理显著增加了具有来自经过akti-1/2处理的细胞的细胞质中oct4(从0到49％)、nanog(从0到45％)和sox2(从0到48％)的荧光的细胞的百分比。

评估将lmb添加到用akti-1/2和mg132预处理的细胞中后多能性因子的定位。结果表明，阻断细胞核输出逆转了mg132的作用并且由于细胞质中的oct4(从31％到8％)、nanog(从45％到5％)和sox2(从48％到0)而因此降低了具有荧光的细胞的百分比。

这些结果表明，akt的磷酸化在oct4、nanog和sox2的亚细胞分布中起重要作用，并且lrrn1沉默对多能性蛋白的细胞核易位和蛋白水解的作用可以通过akt抑制来介导，如图1所展示的。

抗体-药物缀合物

为了验证本发明的lrrn1e36单克隆抗体可以用作抗体-药物缀合物(adc)媒剂，使用荧光显微镜术在mcf7乳腺癌细胞中进行了抗体内化测定。将乳腺癌细胞在冰上用lrrn1e36单克隆抗体染色1小时并且然后在冰上与山羊抗人igg缀合的alexafluor-488一起另外掺入1小时。之后，将经过lrrn1e36单克隆抗体处理的乳腺癌细胞在4℃或37℃下温育3小时。参考图2a和图2b，免疫荧光分析示出，在37℃下，alexa488标记的lrrn1e36单克隆抗体内化到乳腺癌细胞中(在细胞内以绿色显露)，这表明有可能研发lrrn1e36单克隆抗体作为抗体-药物缀合物。

抗体依赖性细胞毒性(adcc)

使用具有lrrn1表达的人胚胎肾293t细胞进行体外研究以检查本发明的lrrn1e36单克隆抗体的adcc活性。用eutda细胞毒性试剂(美国珀金埃尔默公司(perkinelmer,usa))标记细胞，并在有或没有外周血单核细胞(pbmc)的情况下结合人igg(对照组)或lrrn1e36单克隆抗体培养。图3示出了与用仅igg或igg与pbmc处理的那些细胞相比，本发明的lrrn1e36单克隆抗体增强了靶细胞杀伤。

结果表明，lrrn1e36单克隆抗体通过抗体依赖性细胞毒性有效地抑制lrrn1表达性癌细胞。

序列表

<110>长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院（changgungmemorialhospital,linkou）

<120>新型富亮氨酸重复神经元蛋白1（lrrn1）抗体和其用途

<130>cgmh-lk-18005-pct

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