专利名称：防止移植排斥的方法
技术领域：
本发明涉及提供治疗用同种移植物的方法和防止受体对同种移植物排斥作用的方法。具体地说，它涉及用光动力治疗技术处理供体组织，以消耗抗原提呈细胞，并降低其中细胞的免疫原性。
背景技术：
同种移植物在宿主中的移植成功取决于这些因素被移植组织上的抗原，它们被受体识别为异源物质并能够引起排斥反应，介导排斥反应的受体系统中的细胞，和改变异源抗原的提呈或细胞应答的反应。已知，同种移植物排斥反应的一个重要原因是供体组织中有非实质细胞存在(过客白细胞)。
还已知，主要组织相容性复合体(MHC)的产物在介导移植物组织对受体的攻击中起着重要作用。MHC通常是复合物，因为它们包括许多不同的基因座，各自编码不同的细胞表面抗原，还因为基因座具有广泛的多态性。MHC的基因座根据它们的组织分布，所表达的抗原结构和它们的功能归于I类或II类中的一类。I类抗原，存在于所有具核细胞上，是细胞毒T(CD8+)淋巴细胞的主要目标。II类抗原不广泛存在于组织中，是辅助T(CD8+)淋巴细胞的主要目标。
人类MHC即人类白细胞抗原(HLA)的各个基因座的多态性形式已经利用抗体和多种用于体外测试T淋巴细胞识别的技术被认识。由受体对供体多态性的识别所介导的这些反应与体内发生的强烈排斥作用有关。对移植物排斥的细胞基础的体外和体内研究发现，CD4+和CD8+淋巴细胞参与了排斥反应。
至今，在实验模型和医疗实践中，延长移植后同种移植物和异种移植物存活期的努力主要注重对受体免疫器官的抑制。作为其目的，这种治疗包括预防性免疫抑制和/或对移植物排斥的治疗。
用于免疫抑制的药物实例包括细胞毒药物、抗代谢药、皮质类甾醇和抗淋巴细胞血清。被发现在预防性免疫抑制方面特别有效的非特异性免疫抑制剂(硫唑嘌呤、溴隐亭、甲泼尼龙、泼尼松和环胞多肽A)显著提高了移植的临床成功率。肾移植后环胞多肽A的肾毒性已经通过联用泼尼龙，或泼尼龙和硫唑嘌呤之类的甾醇得以降低。此外，已经通过在抗淋巴细胞球蛋白之后使用环胞多肽A成功进行了肾脏移植。另一种治疗方法是在移植前进行全淋巴系统照射，然后在移植后进行最低的免疫抑制。对排斥的治疗使用了甾醇、2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶，异源抗淋巴细胞球蛋白和对多种白细胞群的单克隆抗体。
使用免疫抑制药物的主要并发症是感染。此外，系统性免疫抑制伴随有不良的毒性作用，例如在肾移植后使用环胞多肽A时的肾中毒和造血干细胞水平的下降。免疫抑制药还可能导致肥胖、愈伤能力差、甾醇性高血糖、甾醇性精神病、白细胞减少、胃肠道出血、淋巴瘤和高血压。
由于这些并发症，移植免疫学家已经开始寻找以抗原特异性方式抑制免疫反应的方法，从而只丧失对供体同种抗原的反应。一般通过改变移植组织或能够介导排斥反应的特异性细胞的抗原性已经做到了这种特异性的免疫抑制。在某些情况中，是否会引起免疫性或耐受性取决于抗原被提呈给免疫系统的方式。其它抗排斥方法注重于在移植前消除或弱化供体组织中携带MHC的过客白细胞，即抗原提呈细胞(APC)。
已报道的以此为目的的方法包括延长供体组织的培养时间(Lafferty等，“器官培养一段时间后降低了甲状腺同种移植物的免疫原性”(“Throid AllograftImmunogenicity is Reduced after a period in Organ Culture”)，科学(Science)，188259(1975))。在两个鼠类模型中发现，移植前通过同种移植组织在组织培养中生长来对其预处理，产生了跨越MHC障碍的永久接受性(Lafferty等，移植(Transplantation)，22138-49(1976)；Bowen等，柳叶刀(Lancet)，2586-86(1979))。据假设，这种处理消耗了过客淋巴细胞，因而没有了组织免疫原性所必须的刺激细胞群。例如，已经在如血管移植和肾脏移植中以及有时在输血前，进行供体-受体HLA的配型。
已经有人用生长因子例如TGF-β处理供体组织(Czarniecki等，1992年8月4日的美国专利5,135,915)，有时结合以延长培养时间(Orton，1993年3月9日的美国专利5,192,312)。
可以用UV光来处理供体组织(Reemtsma等，1990年8月7日的美国专利4,946,438；和Lau等“通过紫外光直接照射移植物延长了大鼠胰岛同种移植物的存活期”(“Prolongation of Rat Islet Allograft Survival by Direct Ultraviolet Irradiationof the Graft”，科学(Science)，223607(1984))，有时结合以微囊化作用(Weber等，1993年7月13日的美国专利5,227,298)。已有其它研究者只使用屏障膜，例如双层膜，包含非细胞毒的第一层和1987年9月29日Cochrum的美国专利4,696,286所述的生物相容性半透性聚合物外层的第二层。
已经可用多种物质处理供体组织，例如对皮肤移植物外用环胞多肽，如1991年2月26日Hewitt等的美国专利4,996,193中所述，以及用淋巴细胞分裂抑制素灌注供体肾脏，如1981年10月13日Jones等的美国专利4,294,824所述。在移植到实验室动物之前，用可的松、沙利度胺或乌拉坦体外处理皮肤移植物，延长了其存活期。局部使用于皮肤的药物量通常少于为获取相同效果而给受体全身性注射所需的药物量。已有人在移植前用链激酶/链道酶，受体的RNA和DNA制剂，或戊二醛处理供体皮肤，以降低移植皮肤的免疫原性。
更完善的方法涉及用针对MHC产物的单克隆抗体和补体处理供体组织(Faustman等，“用直接针对Ia决定簇的抗体预处理鼠胰岛延长了该同种移植物的存活期”(“Prolongation of Murine Islet Allograft Survival by Pretreatment of Isletswith Antibody Directly to Ia Determinants”)，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，785156(1981))，或用针对MHC的抗体免疫复合物处理供体组织(Shizure.J.A等，“用抗Ia免疫毒素抑制大鼠混合淋巴细胞泛反应性胰岛培养物”(“Inhibitionof Rat Mixed Lymphocyte Pancreatic Islet Culture with Anti-Ia Immunotoxin”)，移植(Transplantation)，42660(1986))。利用上述方法获得的结果是不恒定的。所以，本领域中需要一种在移植手术中延长移植物存活期的方法，它尽可能降低毒性以及使用大剂量免疫抑制剂造成的其它不良作用。
本发明使用的选择性破坏APC细胞的技术涉及令供体组织与光敏剂接触，再光照，然后移植。早先，类似的光动力方法主要用于破坏例如肿瘤组织等组织，动脉粥样硬化斑，表皮疾病和血液中不需要的病原体(Levy等，1994年2月1日的美国专利5,283,255；1989年11月28日的美国专利4,883,790；1990年4月24日的美国专利4,920,143；1992年3月10日的美国专利5,095,030和1992年12月15日的美国专利5,171,749，以上专利的内容均在此引用参考)。同时参见，Dougherty等，1990年6月12日的美国专利4,932,934；1989年12月26日的美国专利4,889,129；1991年7月2日的美国专利5,028,621；1989年12月26日的美国专利4,889,129；1989年9月12日的美国专利4,886,168；1992年9月8日的美国专利5,145,863；1992年9月8日的美国专利5,145,863和1987年3月10日的美国专利4,649,151；，以上专利的内容均在此引用参考。
例如，Dougherty等的美国专利4,886,168公开了一种商品名为“Photofrin II”的组合物，它是通过回收血卟啉衍生物中的高聚集分子量部分制得的。作为另一个具体实例，Levy等的美国专利4,883,790公开了将名为“单羟基苯并卟啉”的一组相关化合物用于类似的目的。
此外，许多具有类似结构的光敏剂的使用也已有说明。例如参见，(1-羟乙基)次卟啉的衍生物，疏水血卟啉醚和由甲基脱镁叶绿甲酯一酸制得的化合物(Pandey等1991年3月26日的美国专利5,002,962)；脱镁叶绿甲酯一酸轭合物((Pandey等的美国专利5,314,905)；细菌叶绿素-a衍生物(Doutherty的美国专利5,171,741和5,173,504)；单乙烯基醚和双乙烯基醚交联二聚物(Ward的美国专利4,961,920)；苯并卟啉衍生物(Allison等的美国专利5,214,036)；二苯并卟啉化合物(Dolphin等的美国专利5,308,606和5,149,708)；所谓“绿”卟啉，例如单苯卟啉衍生物(Jamieson等的美国专利5,087,636)；含有环外双键的卟啉化合物(Chand等的美国专利5,064,952)；和porfimer sodium组合物(Clauss等的美国专利5,244,914)。上述专利的公开内容均在此引用参考。通常，在第一近似法中，上述药物在光动力治疗中的使用被认为是可以相互替代的。
虽然光动力治疗主要涉及对肿瘤细胞的治疗，但也已经提出还有其它应用。例如，这些光敏药物可以用在消除动脉粥样硬化斑的治疗方案中，可以用于处理血液及其它体液以破坏感染性生物。但是，光动力治疗还未曾被用于消除供体同种移植组织中的过客白细胞。
本发明的特殊优点之一在于，不同于给生物体使用光敏药物的治疗方法，供体组织可以在实际移植之前在体外接受最为合适的处理。由此，基本消除了有关确保例如对生物体内与靶细胞缔合的轭合物的适当光照水平的问题。
而且，本发明方法使得移植物在合适的宿主中具有免疫稳定性，具有生物功能，而且可以在移植前进行保存。所以，本发明使得建立一个用于短期保存的光动力处理过的移植物库成为可能。
发明内容
本发明提供了一种尽可能降低动物受试者中移植排斥作用的方法。在移植前，含有抗原提呈细胞(APC)的供体组织与某种光敏剂接触，并接受光敏剂吸收波长的光照，光照时间足以耗尽APC。这一处理并不杀死角质化细胞但可能改变其I类和/或II类抗原的表达以及其分泌的细胞因子，由此降低了皮肤本身的免疫原性。
在一种实施方式中，光敏剂是轭合物形式，其中包含加强光敏剂与靶APC之间相互作用的靶特异性组份。用光敏剂吸收的适当波长照射移植物时，光敏药物介导APC的破坏。
图1显示本发明中特别用作光敏剂的BPD化合物的结构。
本发明的实施方式根据本发明，供体组织在移植前与光敏剂接触。“供体组织”包括来自供体而不是受体的含有APC的任意类型的可移植组织。本发明使用的供体组织可以是许多组织中的任意一种，例如软组织如新生儿的羊膜，骨髓，造血前体细胞、胶原蛋白和刺激软骨生长的骨蛋白；器官如皮肤，心脏，肝，脾，胰，甲状腺叶、肺、肾、管状器官(例如肠道，血管，或食道)；以及心瓣膜之类的器官部分和胰岛细胞或肝细胞之类的分离细胞或分离细胞簇。
管状器官可用于置换损伤的食道，血管或胆管。皮肤移植物不仅用于烧伤，也可用作受损肠道的修复或闭合某些缺陷，例如膈疝。在特别好的实施方式中，供体组织是皮肤组织或胰岛细胞。
“移植物”在此指用于移植到受体内的来自供体的生物材料。“移植”及其相关的不同说法指将移植物植入受体内，不论移植是同种同源(供体与受体的基因相同)、同种异源(供体和受体是不同基因的生物，但属于同一种)或异种(供体和受体是不同种的)的。所以，在一个典型方案中，宿主是人，移植物是来自具有相同或不同基因起源的人的同基因移植物。在另一个方案中，移植物来自与受体不同的种，包括种系相差较远的动物，例如将狒狒的心脏移植到人宿主中。
供体组织可取自各种来源，不论是来自尸体或活的供体。合适供体的实例包括实验室动物之类的动物活体，例如狗、锚、大鼠、小鼠、沙土鼠、天竺鼠、母牛、灵长目动物或人。较好的供体是包括人在内的哺乳动物。
人供体最好是有血缘关系的自愿供体，体格检查正常，具有相同的ABO主血型，因为跨越主血型障碍会影响同种移植物的存活。但是，例如将O型供体的肾脏移植给A、B或AB型的受体也是可能的。
“同种移植物”指起源于或衍生自与受体同种的供体的细胞或组织。较好的是，供体与受体同种。
“受体”在此指任意相容的移植宿主。“相容”指宿主可以接受供体的移植物。潜在可用的受体实例包括动物，较好的是哺乳动物，例如牲畜如马、母牛或羊；家养宠物如狗或锚；实验室动物如小鼠、大鼠、沙土鼠或天竺鼠；或灵长目动物，如人。最好的是以人为受体。如果移植物的供体和受体都是人，它们最好是HLA II类抗原相互匹配的，由此提高组织相容性。
光敏剂通常，适用于传统光动力治疗的大量化合物中任意一种都适用于本发明。正如本领域一般技术人员众所周知的，已知光敏剂中主要的一类是卟啉相关化合物。正如前文部分详细说明中所述，这些药物包括血卟啉衍生物；血卟啉衍生物中的高分子量组份，商品名为PhotofinII光敏组合物，及其中的有效组份；各种合成的卟啉衍生物，例如单苯并卟啉，又称苯并卟啉衍生物或BPD；绿卟啉；以及许多其它多环化合物，它们被认为能在照射时产生单态氧而引起组织损伤。在前文所述的专利和在此引用的公开文献中已全面地说明了制备合适的光敏剂的方法。较好的是以BPD为光敏剂。
原则上，任何光敏剂的关键特征在于用光敏剂可吸收波长的光照射时，其在所在细胞上表现细胞毒作用的自然倾向性。虽然，在很多例子中，细胞毒被认为是因为在照射时产生了单态氧，但确切的作用模式对本发明而言并不重要。
正如前述Dougherty等的专利中较为详细的说明，有效光敏剂典型性地有许多其它关联特性。一般光敏剂其对实施本发明来说特别重要的特性包括，在没有光化学作用时，它对细胞相对地没有毒性，以及在没有特定细胞与光敏剂之间的靶特异性反应时，它可以从组织中方便地被清除。
本发明的光敏剂宜具有350nm至1200nm波长之间的吸收光谱，该光谱可根据要求的透射度利用已知方法进行调整，约400至900，最好是约600至800。
本发明光敏剂的剂量确定方式参照较好的临床实践，兼顾了移植和待治疗疾病的特性、供体的种类、受体个体的治疗情况、供体组织或受体机体中是否有其它药物存在，以及医生所知的其它因素。用于与移植物接触的光敏剂治疗有效量，即能够有效降低移植物的免疫原性，是使其与受体相容而不被排斥的量。此目的的一般有效量在约0.1至约10μg/ml之间，较好的是约0.1至约2.0μg/ml之间，最好的是约0.25至约1.0μg/ml之间。
光敏剂可以与一种或多种免疫抑制剂混合以加强对移植物的免疫抑制作用。这些其它药物的有效量取决于制剂中光敏剂的含量、移植的类型、移植的起因、药物输送位置、给药方式、给药疗程、或前述其它因素，以及医生已知的其它因素。
通常，在环境温度及合适的pH下，具有要求纯度的光敏剂与一种或多种经生理学认可的载体，即在所用的剂量和浓度对受体无毒的载体混合，由此配制光敏剂。制剂的pH主要取决于具体的用途和光敏剂浓度，但适宜范围一般均为约3至约8。
较好地，将光敏剂保持于中性pH(例如约6.5至约7.5)，以防止出现于接近生理pH值时它与所在容器的粘附，由此确保光敏剂的活化。所以，含有pH6.5的平衡盐缓冲液，但不含胎牛血清(FBS)的电解质溶液制剂是理想的实施方式。去除FBS是因为它含有会激化同种移植物反应的抗原性组份。如果光敏剂与被处理移植物所在的容器粘附，可以加入一定量合适的非抗原性组份，例如人血清白蛋白，该剂量不会干扰光敏剂向被处理移植物的扩散及与之粘附。
如果光敏剂制剂是外用的，例如，如果是在移植前涂在皮肤移植物上，最好使用凝胶之类的粘性溶液，而不是非粘性溶液。凝胶可如此制备，例如将光敏剂溶液与胶凝剂混合，胶粘剂如多糖，最好是水溶性多糖，如透明质酸、淀粉和甲基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素之类的纤维素衍生物。凝胶制剂中有多糖存在时，其含量通常为凝胶重量的约1-90％，1-20％更好。此用途的其它合适多糖的实例，以及多糖溶解度的测定可参见1988年5月11日的EP267,015，其内容在此引用参考。
如果被处理的移植物要做任意时间的保存，光敏剂最好配制在或加入到全氟化物乳液(作为血液的替代物)中以使高浓度的氧能够到达移植物。这样的乳液包含用表面活性剂乳化在水中的全氟萘烷和/或全氟丙胺。选择合适的全氟化物，使其对受体的毒性最小。
合适的表面活性剂包括poloxamer表面活性剂，这代表了一系列氧乙烯和氧丙烯的嵌段共聚物分子，它们单独存在或与卵磷脂之类的磷脂混合。另一个向GreenGross购得的乳剂实例是Fluosol-DA20％，其中含有用poloxamer表面活性剂Pluronic F-68乳化的全氟萘烷和全氟丙胺。在Bollands等，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，39，1021-1024(1987)中对全氟化物乳剂及其对哺乳动物的作用有更详细的说明，其内容在此引用参考。
用于治疗性给药的光敏剂制剂最好是无菌的。可以通过用(0.2微米)的膜过滤来方便地进行灭菌。一经配制和灭菌后，光敏剂可能对氧化变性不稳定。但是，例如，含有BPD的冻干制剂是适于保存的。
寻靶系统将光敏剂与靶特异性制剂结合加强了这些光敏剂对供体引发移植物抗宿主反应能力的破坏。具体地说，光敏剂可以与以下物质结合(1)直接且特异性地以供体组织中抗原提呈细胞(APC)为目标的部分；(2)特异性地以标记APC供轭合物寻靶的中间体为目标的部分；(3)针对移植物抗宿主情况的T细胞。在各种情况中，一旦供体组织通过与轭合物的相互作用而改性后，就可用前文所述的方法对其进行照射，以基本耗尽供体组织中的APC集群。
本发明提供了用于定向寻找同种移植供体组织中APC的特异性含光敏剂的轭合物，以及用一般光动力疗法(PDT)破坏供体组织中APC的方法。用于该方法的一种制剂主要包含光敏剂和将“引导剂”与光敏剂连接的系统。另一种制剂包含APC寻靶系统和与APC寻靶系统的引导剂结合的光敏剂。对于两种制剂，向APC输送光敏药物的最终目的是相同的。
可以利用多种不同的靶特异性试剂来接近作为目标的APC，其中包括对MHC糖蛋白产物具有免疫特异性的部分和在这些细胞上有受体的淋巴因子。典型的是，对于与MHC糖蛋白的反应来说，可以使用由这些糖蛋白引发产生的多克隆抗体或单克隆抗体。
以常规方法制备多克隆抗体，例如给合适的动物注射所需抗体的抗原，评价抗该抗原的血清中抗体水平，在效价较高时制备抗血清。单克隆抗体也可以用常规方法来制备，例如Koehler和Milstein的方法，自然(Nature)，第256卷，pp.495-497(1975)，“分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养”(“Continuous Cultureof Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”)和欧洲免疫杂志(European Jounal of Immunol)，第6卷，pp.511-519(1976)，“通过细胞融合诱导产生特异性抗体的组织培养物和肿瘤系”(“Derivation of Specific Antibody-ProducingTissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion”)，其中利用例如取自免疫过的动物的外周血淋巴细胞或脾细胞，通过病毒感染、与骨髓瘤融合，或其它传统方法使细胞无限增殖化，利用分离的集落就所需抗体的生成进行筛选。
除抗体之外，也可以使用合适的免疫活性片段，例如Fab、Fab’，或F(ab)2片段。适用于形成寻靶机制的许多抗体在本领域中已经可以得到。例如，E.L.Morgan等在Scand.J.Immunol.第10卷，pp.395-402(1970)，“放射性标记的人IgG与Fc片段与鼠脾细胞结合作用的比较”(“Comparison of the Binding ofRadiolabelled Human IgG and Fc Fragments to Murine Spleen Cells”)和Hans P.Kocher等在免疫学杂志(The Journal of Immunol)，第122卷，第4期，pp.1190-1195(1979)，“IgD和IgE1的CH1区和VL区的胰蛋白酶降解”(“TrypticDegradation of the CH1 and VL Regions of IgD and IgE1”)中说明了使用免疫活性片段代替完全抗体。
除免疫活性之外，还可以利用以APC细胞表面的受体为目标的受体的配体，例如以受体与配体间的结构或电荷互补性，来进行寻靶。本文中，“受体的配体”指任何特异性地与APC细胞表面受体结合的天然或合成的物质。这些受体的配体包括淋巴因子例如IL2。
根据本发明的一个具体实施例，光敏剂与针对某中间体的靶特异性试剂结合，该中间体又是对APC特异性的。例如，以提呈Ia的大鼠细胞为例，可将小鼠的抗大鼠Ia抗体用作中间体。此时，光敏剂与抗小鼠抗体偶合而成的轭合物以用小鼠抗体标记的细胞为目标，其方式与含有抗大鼠Ia抗体的轭合物的寻靶方式完全相同。
结合方法寻靶系统可以利用本领域众所周知的和前文Levy等的专利中举例说明的常规方法和接头技术直接与光敏剂结合。对于Ig之类的蛋白质和其它多肽，可利用例如脱水剂如碳化二亚胺，在光敏剂和靶特异性组份中间形成一个直接共价键。当然，也可以通过使用能与两者的活性组份共价结合的双官能接头化合物来连接轭合物的活性部分。
本领域已知的、适用于结合两种化合物部分的有效技术都属于本发明的范围之内。应将接头部分广义地理解为一个共价键，或本领域中可以得到的接头部分或可以利用标准技术由它们衍生而得到的。
或者，可以通过添加特异性试剂来介导寻靶作用。例如，如下文所述，可将针对APC特异性抗体的第二抗体直接与光敏剂连接，可将MHC糖蛋白寻靶剂用作免疫轭合物与靶细胞之间的桥梁。
治疗方案根据本发明，APC的消除或功能弱化，或其它皮肤细胞例如角质化细胞的调节，是以一种相对直接的方式引发的，即将供体组织直接与光敏剂接触，光敏剂可以是轭合物形式，接触的条件能够在光敏剂(或含光敏剂的轭合物的靶特异性组份)与靶APC之间形成牢固缔合，同时将供体组织中的光敏剂浓度降至最低。
该接触适当包括将组合物涂在移植物的一侧或多侧表面，或用本发明的光敏剂培养或灌注器官移植物。处理一般进行至少1分钟，约1分钟至72小时较好，约2分钟至约24小时更好。接触时间取决于以下因素制剂中光敏剂的浓度，待处理的移植物，制剂的具体类型。可利用任意合适的方法进行灌注。例如，可利用配有压力调节器、提供恒定压力或灌流并在泵和器官之间呈溢流状态的设备来灌注器官。或者，可将器官封闭在高压舱中，利用泵将灌注液从储器中抽出并送至舱中，可以将使用后的灌注液通过阀门返回至储器中。
对于皮肤移植物，可将制剂涂在或喷洒在移植皮肤的下表面，由此在供体皮肤的下表面和受体组织之间形成一层光敏剂。但较好的是将整个皮肤移植物浸渍在光敏剂组合物中。
接触步骤可以在较宽的温度范围内进行，只需避免高得足以使移植物变性或产生其它不良影响的温度和低得足以降低细胞对光敏剂吸收的温度。较好的是，接触步骤在约5℃至40℃进行，约15℃至37℃更好，最好是在环境温度下进行。
在使光敏剂适当分布以确保其与靶APC适当缔合后，对如此处理过的供体组织进行光照，所用的光包含光敏剂的吸收波长，由此激活光敏剂的细胞毒性。当然，这样的光照完全是光动力疗法中的常规操作。在例如前述Dougherty等的专利中说明了用于此目的的典型方法和设备。
移植物在与光敏剂接触并接受光照后，可保存长至约24-48小时。但还是以立即用于移植过程为佳。如前所述，可在制剂中使用血液替代物(例如全氟化物乳液)，或如1985年4月9日公开的JP60061501中所述，用含有冷的等渗剂和抗凝剂的光敏剂制剂灌注移植物，然后用甘油灌注，如此可在冷冻移植物时使细胞损伤最小，由此来延长保存期。此外，可在将器官降温至冻点时使用不同的包括制剂的液体来保存移植物，以此半永久性地保存器官而不发生细胞坏死。
在移植前，最好通过例如将其浸在生理盐水中，或利用适用于此目的的其它方法洗尽移植物中的光敏剂组合物。而且，在移植前，可用PDT处理过的外周血单核细胞对受体进行一次或多次供体特异性输血，以帮助移植物的存活。另一种方法是在移植手术前对受体进行全淋巴系统照射。可以进行其它任何有利于特定移植受体的移植前处理方法，将其作为本发明方法的组成部分。
有时，要求通过例如使用合适的氨基酸或聚合物，或连接以生理学认可的带电官能团来改性移植物表面以提供正电或负电基团。例如，带负电的表面适宜于血管以减少血液凝结。在有些环境中还要求为表面提供以表面疏水性或亲水性基团，例如苯丙氨酸、丝氨酸或赖氨酸。对这类表面改性作用特别有效的一种免疫抑制剂是戊二醛。
移植过程本身取决于具体的被治疗的疾病，病人的状态等条件。在任何具体情况中医护人员都将知道采取合适的方法。也可以在术后关键期(前3个月)利用各种合适的方法例如放射性核素静脉血管成像，对移植进行系统的监测。移植后，经常使用合适的免疫抑制剂进行免疫抑制疗法来确保移植物的存活。
作为本发明方法的补充或联用治疗，可同时系统性地对供体、体外供体组织或受体，局部或全身性地使用相同剂量或减量的免疫抑制剂。“免疫抑制剂”在此指抑制或遮蔽移植物移植宿主的免疫系统的物质，包括抑制细胞因子产生、负调节或抑制自身抗原表达，或遮蔽HMC抗原的物质。
这类药物的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶、硫唑嘌呤或环磷酰胺、溴隐亭、戊二醛、HMC抗原的抗独特型抗体、环胞多肽A、一种或多种甾醇，较好的是皮质类甾醇或糖皮质类甾醇，例如泼尼松，甲泼尼龙和地塞米松；抗γ干扰素抗体；抗α肿瘤坏死因子抗体；抗β肿瘤坏死因子抗体；抗白细胞介素-2抗体；抗细胞因子受体抗体，例如抗IL-2受体抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体，最好是OKT-3单克隆抗体；CD4的抗体；链激酶、链道酶；宿主的RNA或DNA。
考虑上述情况而确定的有效量是防止发生受体对移植物排斥的免疫反应的最小量，但尽可能必须获得较长的移植物存活期。这样的量最好低于对受体有毒或会显著增加受体易感染性的量。本发明要求的免疫抑制剂量一般低于未预处理过的移植物的通常需要量，而且取决于移植时的各种情况和使用的免疫抑制剂的类型。
作为具体实例，当免疫抑制剂环胞多肽A的总治疗有效量进行非肠道给药时的单位剂量与目前常规免疫抑制治疗中使用的约5至15mg/kg/天环胞多肽A比较，在约每天0.1至20mg/kg病人体重之间。至于肾移植，未对移植物进行光动力预处理时的常用方法是在短时间内使用大剂量糖皮质类甾醇，例如每天使用数克甲泼尼龙，持续3至5天，然后使用20至100mg泼尼松。进行了本发明的预处理后，使用剂量将显著降低。
如前所述，这些免疫抑制剂的建议用量取决于大量治疗方面的考虑。选择合适剂量和给药程序的关键因素是欲获得的效果，即移植物的长存活期。例如，在治疗可能由抗体介导的移植物损伤引起的过激移植物排斥反应的早期，或在以移植物功能突然下降为特征的后期，可使用较高的剂量。
使用某种免疫抑制剂时，可以利用各种合适的方式给药，其中包括非肠道给药、需要局部免疫抑制治疗时的损害部位内使用。非肠道内输注包括肌内注射、静脉注射、关节内注射，腹膜内注射，或皮下注射。此外，使用某种免疫抑制剂时，它必须适合通过递减剂量的脉冲输注给药，或连续输注。
以下实施例是对本发明的说明而非限制。
实施例1BPD-Ra-MIq轭合物的制备在暗环境中，将图1所示的光敏剂BPD-MA在磷酸盐缓冲液中稀释成1mg/ml至200pg/ml，然后与已知量的大鼠抗小鼠Ig(RaMIg)混合，该抗体由Cedar Lane实验室提供，或通过用小鼠的免疫球蛋白免疫大鼠，然后用免疫吸附柱色谱纯化来制备。混合物在室温下在暗环境中孵育1小时，用可透过分子量低于12至14kd的分子的膜，用4℃的PBS 3升通宵透析形成的轭合物。利用标记过的BPD-MA的模型研究显示，滞留轭合物的BPD∶Ab之比为10-20。然后将透析截留物冷冻干燥保存在暗环境中。
实施例2用轭合物处理同种移植物如下从大鼠中分离供体胰岛组织雄性SD大鼠(200-250g)经腹膜内注射乌拉坦(100mg/kg)进行麻醉，通过中线剖腹术，利用双侧气胸诱导心呼吸停止。在主胆管的近端插入套管，封闭其进入十二指肠位置的远端。用冷的(4℃)0.42mg(650U)/ml胶原酶溶液(XI型，SigmaChemicals)退行性扩张胰腺。原位胶原酶扩张后，进行全胰腺切除。
腺体在37℃的水浴中消化22分钟。通过无菌硅化移液管研磨分散消化后的腺体。粗组织浆状物经200微米的过滤网过滤去除未消化的胆管、血管和淋巴结，然后进行比重分别为1.065和1.031的两个单层构成的不连续葡聚糖梯度离心。从单层界面吸取密度较低的胰岛组织，洗涤，然后通过在解剖显微镜下手工挑选来进一步纯化。使用此技术，从每个胰腺可收获300至400个功能及形态都完好的胰岛。
胰岛在补充了25％牛血清、15mM HEPES缓冲液和1％strepfungizone的HamF-12培养基中体外培养1天。培养后的胰岛先用0.2mg/ml购自SeraLab的小鼠抗大鼠Ia单克隆抗体(OX-6)在/C培养数小时。OX-6对II类MHC产物具有免疫特异性。
将OX-6处理过的胰岛分成几份，分别与以下物质在20℃避光培养2小时(1)BPD∶lAb之比为6.5的Ra-MIgG-BPD轭合物；(2)BPD∶lAb之比为20的上述轭合物；(3)BPD∶lAb之比为6.5的BPD与非相关抗体GA-7sIgG轭合物；(4)单独的BPD；和(5)单独的培养基。然后，培养混合物接受能量为10J/cm2，波长为400至800nm的光照。然后对照射后的培养物进行组织学检测，并检测其中APC的消耗。
实施例3供体组织的鉴定在组织学研究中，将用BPD∶lAb之比为6.5的轭合物处理过的75至100个胰岛移植到作为受体的同基因SD大鼠和同种异基因WF大鼠的肾上腺下方。在同基因和同种异基因的两种受体中，移植均获得成功。具体地说，在同基因和同种异基因移植中，观察到了伴有淋巴细胞浸润的移植物完全取代，但没有可鉴定的内分泌组织。
在APC消耗研究中，胰岛先用OX-6抗体免疫染色。如此处理后的细胞再用FITC标记的山羊抗小鼠Ig(Jackson实验室)二次染色，然后进行荧光显微镜检。在用轭合物处理过的制剂中，没有看见可鉴定的MHC II类细胞。但是，在对照中(非相关抗体轭合物、单独的BPD和单独的培养基)，由于FITC标记的第二抗体标记了APC并发出绿色的荧光，荧光显微镜检由此检测出这些细胞的存在。
皮肤同种移植物排斥的防止为了确定代表最小排斥作用的基线，按照标准方法(Billingham等，“哺乳动物中游离皮肤移植技术”(“The technique of free Skin grafting in Mammals”)，实验生物学杂志(J.Exp.Biol.)，28383-99(1951))，如下对9个BALB/c小鼠进行同基因移植(供体动物与受体动物相同)将移植鼠躯干皮肤剔须脱毛。然后腹膜内注射20T1盐酸氯胺酮，10T1赛拉嗪和70T1 PBS混合物麻醉小鼠，然后仔细地切取完整厚度的皮肤(1cm×1cm)，留下适当的移植床，注意保持肉膜完整。
然后，将自身皮肤移植物重新放置在移植位置，并通过在移植物与移植床界面滴以4滴Vetbond组织粘合剂固定到位。用石油凝胶涂覆的纱布海绵向下按压移植物，然后用Vetrap绷带将移植物和海绵原位固定，绕躯干包扎，形成一个“躯体模”。
就长期存活即超过120天同基因移植物获得成功的鼠超过90％。如果移植物坏死达至少80％，则认为发生完全移植物排斥。移植物存活期表示为平均存活期±标准偏差。
使用相同的上述方法，同时进行了C57BL/6小鼠(供体，H-2b)和BALB/c小鼠(受体，H-2d)之间的同种异基因皮肤移植作为对照，但取自供体鼠的皮肤移植物被用到不同的受体鼠的移植床。简而言之，将供体鼠的躯干皮肤剔须脱毛，然后获取完整的皮肤移植物(1cm×1cm)。受体鼠剔毛后腹膜内注射20T1盐酸氯胺酮，10T1赛拉嗪和70T1 PBS混合物进行麻醉。仔细地切去躯干皮肤(1cm×1cm)，注意保持肉膜完整，如此制备受体的移植床。将移植物放到同种异基因的移植位置上，用Vetbond组织粘合剂，石油凝胶涂覆的纱布海绵和Vetrap绷带原位固定成“躯体模”。平均存活期为11.1天(标准偏差1.9)。
根据本发明的方法，移植在受体上的皮肤样本先在体外与光敏剂BPD的1.0Tg/ml溶液接触1小时。然后将皮肤在没有胎牛血清(“FBS”)的电解质溶液中悬浮30分钟，并用发光二极管(“LED”)发出的红光照射(在690±10nm处，10J/cm2)。光处理后，如上所述将光照后的皮肤移植给受体鼠。从移植后第8天起，监测动物的排斥反应。同种移植物的存活期延长至18.5天(标准偏差为2.1)。
为了方便比较，将上述结果列于表1。
表1移植类型 实验动物数 平均存活期(标准偏差)同种同基因移植9 不确定同种异基因移植16 11.1天(1.9)用预处理过的供体皮6 18.5天(2.1)肤进行的同种异基因移植以上结果显示，对移植组织进行光动力处理的免疫调节作用显著延长了移植物的存活期。
改变光敏剂BPD的浓度(0.25至1.0Tg/ml)，根据本发明重复以上实验，将同种异基因移植与标准的、对照同种异基因移植相比较。结果归纳在表2中。
表2移植类型(实验动物数)光敏剂及光照剂量平均存活期(标准偏差)同种异基因移植对照(10)0 7.5天(0.84)用预处理过的供体皮肤进行 1.0Tg/ml BPD，11.0天(0.0)的同种异基因移植(5) 10J/cm2LED用预处理过的供体皮肤进行 0.5Tg/ml BPD，14.3天(1.5)的同种异基因移植(5) 10J/cm2LED单独将光敏剂增至2倍似乎并不显著延长移植物的存活期，所以假设对移植组织进行的光动力处理的免疫调节作用可能依赖于对皮肤中细胞群的选择性作用，而并不一定是由于已知的光动力疗法的细胞毒作用。
实施例5移植皮肤的组织学检验为了检验在引起存活期延长的条件下用光动力疗法处理皮肤移植物的作用，如上所述获取皮肤样本并进行处理，所不同的是使用不同的光敏剂浓度范围，即0.25或0.50Tg/ml的BPD。部分组织单独培养在没有光敏剂的培养基中作为对照。全部组织样本都培养24小时以上，然后取代表性的数量接受光照。光照为能量为10J/cm2的红光。
然后将全部样本放在福尔马林中，进行组织学检验。单独培养在电解质溶液中的组织(对照样本)或培养在0.50Tg/ml BPD中的样本，没有接受光照，表现为正常。但是，用0.25或0.50Tg/ml的BPD处理，并接着用红光处理过的样本表现出以下变化细胞核增大，核周液泡化，上皮细胞的嗜曙红性下降，细胞质体积增大，和上皮表面角质化细胞间空隙增大。根据这些组织学发现假设，本发明的光动力处理引起一定程度的细胞损伤而不是细胞死亡。这一预料之外的非细胞毒作用机制是尚未为人所知的。
显然，对本领域熟练技术人员来说，可以对公开的主题进行修改和/或改变，均在后文本发明的权利要求范围之内。
权利要求
1.降低对含有抗原提呈细胞(APC)供体组织的同种移植物排斥作用的方法，包括a.将供体组织与光敏剂接触以获得改性供体组织；b.对所述的改性供体组织进行所述光敏剂可吸收波长的足够时间光照，以消耗供体组织中的APC；和c.将所述的消耗了APC的供体组织移植到受体组织中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的供体组织是皮肤组织或胰岛。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的光敏剂是BPD。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述光的至少部分波长在电磁波谱的可见光部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述光敏剂是溶液形式的，浓度为0.25至1.0μg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的光照步骤b中，所述的改性供体组织被悬浮在电解质溶液中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述光照过程b中的光剂量约为10J/cm2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述光敏剂的形式是包含靶特异性组份的轭合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的靶特异性药剂包含与APC特异性结合的药剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的靶特异性药剂是抗体、抗体片段，或APC表面上受体的配体。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述的靶特异性药剂包含与特异性结合APC的标记结合的药剂。
12.具有降低的同种移植物排斥易感性的供体组织，它是根据权利要求1所述的方法制备的。
13.组合物，其中包含含抗原提呈细胞(APC)的供体组织，该组织与含有光敏剂的轭合物混合。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述的轭合物还包含能够定向于供体组织中APC的靶特异性药剂。
全文摘要
本发明涉及降低对同种移植物的排斥反应的方法,这些同种移植物包含含有抗原提呈细胞(APC)的供体组织,该方法包括:a)在供体组织中加入光敏剂,制得改性供体组织;b)用光敏剂吸收波长的光照射改性供体组织足够长的时间以消耗其中的APC;和c)将消耗了APC的供体组织移植到受体组织中。通过对供体组织进行光动力治疗,移植物,尤其是同种皮肤移植物的存活期显著延长。光敏剂也可以是含有靶特异性基团的轭合物的一部分。
文档编号A61P37/06GK1192157SQ96191452
公开日1998年9月2日 申请日期1996年1月12日 优先权日1995年1月13日
发明者M·O·K·奥博奇, J·利维 申请人:夸德拉逻辑技术股份有限公司, 不列颠哥伦比亚省大学