用哌嗪环氧乙烷衍生物诱导肿瘤细胞死亡的方法

专利名称：用哌嗪环氧乙烷衍生物诱导肿瘤细胞死亡的方法
背景发明领域本发明是关于用哌嗪衍生物诱导肿瘤细胞死亡，以及加强化疗治疗肿瘤细胞效果的方法，并且，特别是关于激活肿瘤细胞的渐进性细胞死亡以及逆转肿瘤细胞中多药物抗性的一种方法。本发明还涉及哌嗪衍生物在药物制备中的应用。技术背景已经知道，某些环氧化物可在包括癌症治疗的多种医药领域中，作为药理活性化合物。已经合成了许多种环氧化物，用于各种目的。例如，Masaki等的(美国专利)Nos.4,507,297和4,596,803公开了几个以用于抑制心肌梗塞为目的的，具有环氧化物基团的哌嗪衍生物，包括NCO-700。Omura等的美国专利No.5,336,783公开了一种含有氨基甲酰基的吡咯衍生物，它具有Calpain(钙激活的中性蛋白蛋白酶)抑制活性。Yaginuma等的美国专利No.4,732,910公开了一种含有胍基和苄基的环氧化物，它对硫醇蛋白酶具有很强的酶抑制活性。Tamai等在美国专利Nos.4,333,879和4,382,889中公开了一种具有硫醇蛋白酶抑制活性，特别是具有钙-激活的中性蛋白酶(CANP)抑制活性的化合物EST。Tamai等又在美国专利4,418,075和4,474,800中公开了几种具有类似于EST化学结构的化合物，但是它们比EST多包含有一个亚氨基。
上述化合物都具有硫醇蛋白酶抑制活性，特别是对CANP(也可称为Calpain)具有抑制活性。但是，没有报导上述化合物中的任何一个在直接治疗癌细胞中是有效的，尽管Calpain抑制剂对人具有某些药物作用。
已经公布了具有不同效用的其它一些Calpain抑制剂。例如，Malfroy-Camine等在美国专利No.5,403,834中公布了具有强抗氧化剂性能和/或自由基清除性能的Salen-转换金属络合物。据说这些化合物能防止或减少对危象组织如心肌和中枢神经系统的局部缺血性损伤/再灌注性损伤。Nixon等在美国专利No.5,328,922中公布了二个相关的内源性神经，特别是人脑，钙-激活中性蛋白酶(CANP或calpain)抑制剂，被称为高分子量Calpastatin(HMWC)和低分子量Calpastatin(LMWC)。Kozarich等在美国专利No.5,268,164中公布了几个具有核心氨基酸序列或氨基类似序列的肽(促通透剂A-7)，它们可增加动物血-脑屏障的通透性。Ando等在美国专利Nos.5,424,325,5,422,359,5,416,117,5,395,958,和5,340,909中公布几个氨基酮衍生物(′325中),α-氨基酮衍生物(′359中),以及环丙烯酮衍生物(′117,′958和′909中),它们是对硫醇蛋白酶如Celpain的可逆性抑制剂。据说这些化合物在组织分布，细胞膜通透性，以及口服给药吸收等方面具有极好的性能。没有谈到关于这些化合物对癌细胞的治疗作用。
国际专利申请公报No.WO 94/00095公布了使用各种Calpain抑制剂，以便使细胞周期同步化。同步化作用被公布能缩短对癌症化疗的时间，并且能增加化学治疗剂的活性。其原理是，使所有的细胞同步化在S期，将使它们变得对化学治疗剂更敏感。此参考资料指出，在将Calpain抑制剂用于治疗癌症中，Calpain抑制剂必须在用主要化学治疗剂治疗之前使用。除此之外，没有任何关于治疗具有多药物抗性癌细胞的公开内容或提示。并且，决没有任何关于单独给予Calpain抑制剂诱导癌细胞死亡的公开内容或提示，也就是说，没有公布Calpain抑制剂具有有效的作用，除非在使用主要化学治疗剂治疗癌症之前，先以它们给药。
Shoji-Kasai等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:146-150(1988)中显示，培养在化学成分限定培养基中的表皮样癌A431细胞，可被E-64-d停滞在有丝分裂后期，E-64-d是硫醇蛋白酶-特异性抑制剂E-64的一种膜通透性衍生物。这些资料表明，CANP抑制剂对延缓某些癌的生长似乎有显著的作用。但是，当癌细胞具有多药物抗性时，这些作用将不能显示出，并且也不能导致癌细胞死亡。
限制抗癌药物临床效用的主要因素是在肿瘤中形成药物抗性。许多用抗癌药如长春花生物碱(长春花碱)和antracycline(阿霉素)治疗的肿瘤会对这些药物发展耐变性，并且还显示对其它抗癌药物也有交叉抗性。在某些情况下，患者对最初的化学治疗完全没有反应，在这种情况则认为该肿瘤具有内在的药物抗性。据认为这种药物抗性的机制之一，是由于被称为mdr(多药物抗性)蛋白的表面蛋白，将抗癌药物主动排出癌细胞(Gottesman et alJ Clinical Oncology 7:409-411,1989,Goldstein et alJ Nat′l Cancer lnst.81:116-124,1989,Fojo et alCancer Res.45:3002-3007,1985)。这种蛋白质可有效地降低癌细胞中抗癌药物的浓度，导致肿瘤存活生长。已经鉴定mdr蛋白为一种170,000道尔顿的能量-依赖性糖蛋白，当癌细胞获得药物抗性时，这种糖蛋白在细胞中被大大扩增。据认为，这种泵能识别和排除多种疏水性药物，并且认为，它在体内的正常作用是作为一种认别和从细胞清除可能的毒性化合物的泵。
已报导许多化学的化合物能阻碍mdr泵的活性，使抗癌药物能累积在靶细胞中。认为这些化合物是通过作为多药物泵系统的底物而起作用，并且通过破坏这种泵而阻止抗癌药物排出，导致癌细胞死亡。这些mdr-阻滞化合物中，研究最多的是异搏定，这是一个具有另一不同临床用途，即治疗高血压的钙通道阻滞剂。不论在临床前的临床研究中(Gottesman et al.J Clinical Oncology 7:409-411,1989)，都已显示异搏定在抑制mdr泵，导致增强杀灭癌细胞中有良好的活性。不幸的是，抑制这种泵所需要的异搏定剂量是如此之高，以致发现对患者有中毒性心血管副作用，因此阻碍了进一步发展将此药用于癌症患者。然而，仍需要发展能逆转mdr泵的非毒性药剂，并且这对治疗癌症患者将是一个重要的补充。如下面在表1中所示，在美国，形成了药物抗性的癌症患者的数目大约是30％，因此，对安全，有效的mdr泵阻滞剂的市场需求是巨大的。
表1在美国癌症患者的药物抗性1癌症患者的数目(U.S)1,200,000每年新增患者的数目 900,000患有药物抗性癌症患者的估计数目 350,0001数目引证自“生物技术新闻”和“国家癌症研究所杂志”关于多药物抗性癌细胞的治疗，美国专利No.5,371,081公开了一类N-取代的吩噁嗪。这些化合物的化学结构与上述环氧化物和Calpain抑制剂无关。并且，也未公布此类化合物单纯给药时是有效的，此类化合物的毒性也很可能是临床使用的障碍。
存在于传统化学治疗中最严重的问题之一是化学治疗剂的毒性。例如，作为代表性化学治疗剂的长春花碱和阿霉素，具有不可避免的副作用如脱发，体重减轻，以及肝和肾损伤。由于其高毒性，它们不能长时间每天给药。例如，这些化学治疗剂通常是一周给药几天，连续二个月或三个月，在停止给予这类化学治疗剂，恢复几星期之后，再用它重复给药。没有一个传统的化学治疗剂和增强剂是没有毒性的。
总之，没有任何现有的技术资料公布或提示了实际上它们本身能够诱导癌细胞死亡的Calpain抑制化合物或环氧化物。并且，没有任何关于如下化合物的公开内容它们具有杀灭癌细胞的功能，不论癌细胞是否存在多药物抗性，并且没有明显的副作用或毒性。
发明概述本发明开发了环氧化物衍生物在治疗癌症中的应用，并且特别是为了治疗不论是否存在多药物抗性的癌细胞，当实质上在使用其它化学治疗剂的同时，用具有环氧基的哌嗪衍生物作为主要化学治疗剂或作为辅助治疗。本发明的一个目的是，提供一种使用具有环氧基的哌嗪衍生物，明显地诱导癌症细胞死亡的方法，在药理学上它完全不同于现有技术所述的防止癌症转移或其它类似的方法。本发明的另一个目的是，提供一种单独使用具有环氧基的哌嗪衍生物，或者以它作为主要化学治疗剂，而明显地诱导癌症细胞死亡的方法。换句话说，哌嗪衍生物是基于不同于传统抗癌药物的机理，其本身作为抗癌药物发挥功能，不论在癌细胞中是否存在多药物抗性。本发明还有另一个目的是，提供一种通过实质上在使用其它化学治疗剂的同时，用具有环氧基的哌嗪衍生物作为辅助治疗而逆转癌细胞多药物抗性的方法。
也就是说，本发明的一个主要方面是一种用于诱导肿瘤细胞之细胞死亡的方法，包括给有肿瘤细胞的患者，以足以对该肿瘤细胞诱导细胞死亡的剂量，给予式Ⅰ的化合物或其可药用的盐
其中R1是羟基，C1-4烷氧基，C1-4烷羰氧基甲氧基，苯基C1-2烷氨基，2,5-吡咯烷二酮-1-烷氧基(C1-4)，或
其中X1是一个化学键或C1-2亚烷基，X2是H或者当X1是亚甲基时X2是与X1一起形成5-元环的羧基，X3是H或C1-2烷基，X4是H或C1-2烷基，或者X3和X4共同形成一个5-元环，其中X2,X3，和X4中至少一个是H,R2是C3-4烷基，R3是C1-4烷基，
其中n是一个0-3的整数。
在上述方法中，该化合物优选地具有如下结构式
在此R4选自如下的基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2，和-C(CH3)3基团。
在上述方法中，该化合物还可以优选地具有如下结构式
在此R4选自如下的基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2，和-C(CH3)3基团。
上述化合物对诱导癌症细胞死亡是有效的，即使当这些癌细胞具有多药物抗性。该化合物优选的是其盐形式。
上述化合物包括Masaki等在美国专利Nos.4,507,297和4,596,803中，以及在日本专利公开Nos.63-275575(1988)和63-275576(1988)中公布的哌嗪衍生物。在此引入这些专利作为参考。但是，在′297和′803中的哌嗪衍生物，仅仅是被报告用于抑制心肌梗塞的目的。上述特殊基团的哌嗪衍生物，对肿瘤，特别是对具有多药物抗性的肿瘤，表现出令人吃惊和出乎预料的高度抗肿瘤活性。可被有效治疗的肿瘤细胞包括选自如下的种类人乳腺癌细胞，人黑素瘤细胞，人卵巢癌细胞，人结肠癌细胞，人胰腺癌细胞，以及人前列腺癌细胞，特别是未分化的癌细胞。
本发明的另一个重要方面是一种用于治疗肿瘤细胞的方法，主要包括对有多药物抗性肿瘤细胞的患者，以足以对该肿瘤细胞诱导细胞死亡的剂量，给予一种主要由上述结构式Ⅰ化合物或其可药用的盐组成的组合物。上面的方法可使用前述优选的化合物和用于有效治疗上述肿瘤。即使不使用其它任何化学治疗剂，哌嗪衍生物本身在本发明中对癌细胞也证明有非常高的抗肿瘤活性。除了逆转由活性mdr基因表达的多药物抗性之外，这个意外发现似乎是基于“凋谢”，即只是在最近才被认识的渐进性细胞死亡(Desoize BAnticancer Res.14:221-2294,1994)。这种用本发明的哌嗪衍生物，通过使之凋谢和多药物抗性逆转而对癌症细胞死亡的显著诱导作用，在药理学上是非常不同于、并且是优于例如已报导的通过具有环氧基但没有哌嗪环的硫醇蛋白酶特异性抑制剂E-64-d对癌症转移的防止作用(Shoji-Kesai et alProc.Natl.Acad.SciUSA 85:146-150,1988)。进而，基本上在使用其它化学治疗剂的同时，使用本发明的哌嗪衍生物作为主要的化学治疗剂或者作为辅助治疗，也完全不同于已报导的使用Calpain抑制剂，它必须在以主要化学治疗剂对癌症治疗之前使用(国际专利申请公开No.WO 94/00095)。
关于凋谢，已有报导认为Calpain抑制剂是作为凋谢抑制剂，而不是凋谢诱导剂(Thompson,Science Vol.267 10 March 1995,pp.1456-1462)。另一方面，已有报导Calpain抑制剂1和N-苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-酪氨酸重氮甲基酮是作为凋谢诱导剂(Biochemical andBiophysical Research Communications Vol.214,No.3,25 September 1995,pp.1130-1137)。从这些矛盾的报导，显然可见，凋谢的诱导或抑制不能简单地用Calpain抑制活性来解释。另外，对于细胞特异性(例如对正常细胞的毒性)也很少考虑，虽然此特征是极端重要的。令人吃惊的是，本发明特定的哌嗪化合物能以出乎意料高的程度特异性地诱导肿瘤细胞凋谢。
上述哌嗪衍生物与化学治疗剂如长春花碱和阿霉素共同使用也是有效的，即通过在实质上与使用此化学治疗剂的同时，对有肿瘤细胞，特别是携带有活性mdr基因的肿瘤细胞的患者，给予该哌嗪衍生物。
因此，本发明的另一个重要方面是一种对肿瘤细胞进行更有效化学治疗的方法，包括对有多药物抗性肿瘤细胞的患者，在实质上与化学治疗的同时，以足以加强该化学治疗的剂量，给予上述结构式Ⅰ的化合物或其可药用的盐。前述优选的化合物和治疗有效的肿瘤可用于上面的方法。这类哌嗪衍生物在本发明中，对于逆转能对抗抗癌药物的人癌细胞和肿瘤的药物抗性是高度有效的，是通过在这些癌细胞内高度积累抗癌药物，因此增加了对这些癌细胞的杀灭。
另外，本发明还包括其它几方面前述的哌嗪衍生物在制备用于在肿瘤细胞中诱导细胞死亡的药物中的应用，前述的哌嗪衍生物在制备用于对治疗多药物抗性肿瘤细胞增加化学治疗效果的药物中的应用。以上这些药物本身也是本发明的重要方面。
附图简要说明

图1的曲线显示在对人卵巢癌细胞系SW-626和AN-3-CA的癌细胞死亡测定中，LDH释放和NCO-700浓度之间的关系。
图2的曲线显示在对黑素瘤细胞系B16F10(小鼠系)和SK-Mel-2(人系)的癌细胞死亡测定中，LDH释放和NCO-700之间的关系。
图3的曲线显示在对100,000个细胞和250,000个细胞的人细胞系SK-Mel-2(黑素瘤)的癌细胞死亡测定中LDH释放和NCO-700浓度之间的关系。
图4的曲线显示在对人癌细胞系MCF-7(乳腺)，HL-60(白血病)，以及HEP-129(肝)的癌细胞死亡测定中LDH释放和NCO-700浓度之间的关系。
图5的曲线显示在对人癌细胞系HS-578T(乳腺)，T-47D(乳腺)，以及DU-145(前列腺)的癌细胞死亡测定中LDH释放和NCO-700浓度之间的关系。
图6的曲线显示在对人癌细胞系MCF-7(乳腺)，MDA-MB231(乳腺)，以及LS-174T(结肠)的癌细胞死亡测定中LDH释放和NCO-700浓度之间的关系。
图7的曲线显示在对人癌细胞系HS-578T(乳腺)的癌细胞死亡测定中LDH释放和NCO-700,TOP-008,TOP-009,TOP-013，以及TOP-017浓度之间的关系。
图8的曲线显示在人癌细胞系HS-578T(乳腺)，DU-145(前列腺)，PC-3(前列腺)，以及WIDR(结肠)的癌细胞死亡测定中LDH释放和TOP-008浓度之间的关系。
图9的曲线显示在对人癌细胞系SK-Mel-2(黑素瘤)的癌细胞残活测定中，目标面积(通过计算机计算的残活癌细胞的数量)和NCO-700浓度之间的关系。
图10的曲线显示在对人癌细胞系LS-174T(结肠)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图11的曲线显示在对人癌细胞系T-470(乳腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图12的曲线显示在对人癌细胞系HS-578T(乳腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图13的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系DU-145(前列腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图14的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系PC-3(前列腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图15的曲线显示在对人癌细胞系LN(前列腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图16的曲线显示在对1000个细胞/孔的人癌细胞系W1DR(结肠)的癌细胞残活测定中，目标面积和NCO-700浓度之间的关系。
图17的柱状图显示在对BDF/1小鼠体内人前列腺癌的肾被膜下试验中，肿瘤大小改变平均数(Δ平均数)和NCO-700剂量之间的关系。
图18的柱状图显示在对BDF/1小鼠体内人乳腺癌的肾被膜下试验中，肿瘤大小改变和NCO-700剂量之间的关系。
图19的柱状图显示在对BDF/1小鼠体内人结肠癌的肾被膜下试验中，肿瘤大小改变和NCO-700剂量之间的关系。
图20的柱状图显示在对人癌细胞系DU-145(前列腺)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图21的柱状图显示在对人癌细胞系HS-578T(乳腺)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图22的柱状图显示在对人癌细胞系T-47D(乳腺)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图23的柱状图显示在对人癌细胞系SK-MEL-2(黑素瘤)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图24的柱状图显示在对人癌细胞系W1DR的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图25的柱状图显示在对人癌细胞系LS-174T(结肠)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图26的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系HS-578T(乳腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图27的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系T-47D(乳腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图28的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系DU-145(前列腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图29的曲线显示在对500个细胞/孔和1000个细胞/孔的人癌细胞系PC-3(前列腺)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图30的曲线显示在对1000个细胞/孔和2000个细胞/孔的人癌细胞系LS-174T(结肠)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图31的曲线显示在对500个细胞/孔的人癌细胞系WIDR(结肠)的癌细胞残活测定中，目标面积和TOP-008浓度之间的关系。
图32的柱状图显示在对人癌细胞系HS-766T(胰腺)和ASPC-1(胰腺)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物以25μM浓度刺激的LDH释放。
图33的曲线显示在对人癌细胞系DU-145(前列腺)的癌细胞死亡测定中，LDH释放和NCO-700及Colpain抑制剂1浓度之间的关系。
图34的柱状图显示在对人癌细胞系HS-578T(1000个细胞/孔)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008，及类似化合物刺激的LDH释放。
图35的柱状图显示在对人癌细胞系HS-578T(1500个细胞/孔)的癌细胞死亡测定中，由NCO-700,TOP-008及类似化合物刺激的LDH释放。
图36的图线显示在对人癌细胞系HS-578T的凋谢检测试验中，TOP-008的致凋谢活性测定结果。图36a,36b，和36c分别表示正常癌细胞，癌细胞加TOP-008(50μM)，和癌细胞加TOP-008(25μM)。
图37的曲线显示在用阿霉素治疗和未用阿霉素治疗的裸鼠中，肿瘤重量改变和NCO-700剂量之间的关系。
图38的柱状图显示，与TOP-008(表示为TOP-8),TOP-018(表示为TOP-18)及NCO-700(表示为NCO)相比较，TOP-009(表示为TOP-9)对HS 578-T细胞的作用。
图39的柱状图显示，与TOP-008(表示为TOP-8),TOP-018(表示为TOP-18)及NCO-700(表示为NCO)相比较，TOP-013(表示为TOP-13)对HS 578-T细胞的作用。
图40的柱状图显示，与TOP-008(表示为TOP-8),TOP-018(表示为TOP-18)及NCO-700(表示为NCO)相比较，TOP-017(表示为TOP-17)对HS 578-T细胞的作用。
图41的柱状图显示以TOP-008(表示为TOP),TOP-018(表示为TOP-18)，及NCO-700(表示为NCO)处理HS 578-T细胞(600个细胞/孔)的LDH测定结果。
图42的柱状图显示与TOP-008(表示为TOP-8)相比较，TOP-019(表示为TOP-19)对HS 578-T细胞的作用。
图43的柱状图显示与TOP-008(表示为TOP-8)相比较，TOP-020(表示为TOP-20)对HS 578-T细胞的作用。
图44的曲线显示在残活测定中，TOP-008(表示为TOP-8),009(TOP-9),013(TOP-13),017(TOP-17),019(TOP-19)，及020(TOP-20)对培养的HS 578-T细胞的作用。
图45的曲线显示在残活测定中，NCO-700(表示为NCO),TOP-008(表示为TOP-8)，及TOP-018(表示为TOP-18)对培养的HS 578-T细胞的作用。
图46的柱状图显示用肾被膜下试验，TOP-008对BDF/1小鼠中人前列腺癌的作用。
图47的柱状图显示用肾被膜下试验，TOP-009对BDF/1小鼠中人前列腺癌的作用。
图48的柱状图显示用肾被膜下试验，TOP-013对BDF/1小鼠中人前列腺癌的作用。
图49的柱状图显示用肾被膜下试验，TOP-017对BDF/l小鼠中人前列腺癌的作用。
图50的柱状图显示用肾被膜下试验，TOP-018,019和020对BDF/1小鼠中人前列腺癌的作用。
图51的柱状图显示TOP-008(表示为TOP),Calpain抑制剂1(表示为CAL1)，和N-Cbz-Leu-Leu-Tyr重氮甲基酮(表示为N-CBZ)对HS 578T细胞的作用。
图52的照片显示被植入S-180人肉瘤细胞的Swiss-Webster小鼠，用NCO-700(表示为NCO.700)或TOP-008(表示为TOP.008)治疗，或者不治疗(表示为对照)，其中在对照动物表现出腹部肿胀，表明在这些动物中负荷有大肿瘤。
图53的照片显示被植入S-180人肉瘤细胞的黑小鼠C57BL/6J，用NCO-700(表示为NCO.700)或TOP-008(表示为TOP.008)治疗，或者不治疗(表示为对照)，其中在对照动物表现出腹部肿胀，表明在这些动物中负荷有大肿瘤。
图54的照片显示来自图52中对照Swiss-Webster小鼠的肿瘤细胞，以吖啶橙(0.01％)染色，用共焦激光显微镜观察，其中核区内核酸明亮的球形染色显示出表明正在增殖或分裂细胞的高度有序的核物质。
图55的照片显示来自图52中NCO-700治疗Swiss-Webster小鼠的肿瘤细胞，以吖啶橙(0.01％)染色，用共焦激光显微镜观察，其中这些细胞内的核物质是小裂片状，无序的，是遭受渐进细胞死亡或凋谢细胞的典型核物质。
图56的照片显示来自图52中TOP-008治疗Swiss-Webster小鼠的肿瘤细胞，以吖啶橙(0.01％)染色，用共焦激光显微镜观察，其中这些细胞内的核物质是小裂片状，无序的，是遭受渐进细胞死亡或凋谢细胞的典型核物质。
图57的照片显示在从图54中对照动物取出的细胞内核酸荧光的分布，其中具有强染色度的肿瘤细胞内高度有序的DNA，可以被看作象是加在荧光分布(以蛋糕形状)(第二层和第三层分别是粉红色和黄色)上面的白色“糖霜”。
图58的照片显示在从图55中动物取出的细胞内核酸荧光的分布，其中在暴露于NCO-700的动物内高度有序的DNA显著减少(上部明亮的“白霜”)(第二层和第三层分别是粉红色和黄色)。
图59的照片显示在从图56中动物取出的细胞内核酸荧光的分布，其中对来自暴露于TOP-008的动物，其高度有序的DNA不存在(上部没有“白霜”)(第二层和第三层分别是粉红色和黄色)。
图60的柱状图显示NCO-700和TOP-008，以及它们的衍生物对HS 578-T细胞的作用，其中，虽然从TOP-101至TOP-115的衍生物具有为NCO-700和TOP-008所共有的结构，但是它们在细胞死亡测定中没有显示出作用。
优选实施方案的详述我们已揭示，本发明具有环氧基的哌嗪衍生物，可以用于在体内杀灭肿瘤细胞。我们的研究表明，例如当以该衍生物对带有药物抗性人肿瘤的裸鼠给药，可使肿瘤块的重量下降60％，而没有相应的体重丧失。并且，该药物不论是单独给药，或者在共同治疗中，即使对于表现出多药物抗性的癌细胞也是有效的。
如上在发明背景中所述，限制抗癌药临床使用的主要因素是在肿瘤内发展药物抗性。最近的研究表明，构成癌细胞中药物抗性基础的二个主要机制包括(ⅰ)mdr多基因家族的扩增和(ⅱ)渐进性细胞死亡(凋谢)的抑制。在mdr基因扩增的细胞中药物抗性的机制归咎于通过mdr蛋白将抗癌药主动排出癌细胞，这样有效地降低了癌细胞内抗癌药物的浓度。只是最近才被认识的癌细胞内药物抗性的第二个主要机制是，渐进性细胞死亡或凋谢的抑制，这样导致不仅对化学治疗，而且对放射治疗也产生了抗性(Desoize BAnticancer Res.14:221-2294,1994)。最充分鉴定的凋谢抑制剂是Bc1-2基因的蛋白质产物，它们在药物和放射抗性的癌细胞内被过度表达。在凋谢细胞内将发生多种快速的，性质不同的分子事件，例如核染色质固缩，细胞大小改变，以及导致产生寡心DNA片段的内源性核酸内切酶活性的激活。多药物抗性癌细胞具有凋谢抑制活性。
我们已发现，本发明中具有环氧基的哌嗪衍生物，在逆转对抗癌药物抗性的人癌细胞和肿瘤的药物抗性中是高度有效的。例如，该衍生物可在人癌细胞系内刺激积累5倍的抗癌药物，长春花碱。这将导致如在癌细胞残活试验中测定的对这些癌细胞的杀灭，非常显著地增加了。这些研究表明，具有环氧基的哌嗪衍生物在致敏药物抗性癌细胞对抗癌药物的杀灭作用中具有显著的活性，并且证明了将其用于癌症患者的高度潜力。
根据以下更详尽的论述，可认为本发明的药剂组合物对诱导癌细胞凋谢也是有效的。因此，这些组合物对克服癌症患者二种已知的主要药物抗性机制具有有益的效果。具有环氧基的哌嗪衍生物本发明中具有环氧基的哌嗪衍生物是以结构式1表示的化合物，
在此R1是羟基，C1-4烷氧基，C1-4烷羰氧基甲氧基，苯基C1-2烷氨基，2,5-吡咯烷二酮-1-烷氧基(C1-4)，或
其中X1是一个化学键或C1-2亚烷基，X2是H，或者当X1是亚甲基时X2是与X1一起形成5-元环的羧基，X3是H或C1-2烷基，X4是H或C1-2烷基，或者X3和X4共同形成一个5元环，其中X2,X3，和X4中至少之一是H,R2是C3-4烷基，R3是C1-4烷基，
其中n是0-3的整数。以结构式1表示的化合物典型地具有如下的结构式
在此R4选自如下的基团
其它典型的化合物还具有如下的结构式
在此R4选自如下的基团
实例化合物典型地包括如下取代基通式
R2A:-(CH2)2CH3B:-CH2CH(CH3)2C:-C(CH3)3
包括在具有环氧基哌嗪衍生物中的典型化合物有如下化合物(括号中的名称是下述实施例中指定的化合物的名称)No. R1R2R3备注1 A B A反式，钠盐2 A B B反式，钠盐(TOP-201)3 A B C反式，钠盐(TOP-202)4 A B D反式，钠盐5 A B D(2R,3R)，钾盐(TOP-207)6 A B D(2S,3S)，钠盐7 A B E反式，钠盐8 A B F反式，钠盐9 A B G反式，钠盐10A B H反式，钠盐11A B H(2R,3R)，钠盐(TOP-203)12A B H(2S,3S)，钠盐(TOP-204)13B B D反式，1/2硫酸盐(TOP-205)14B B D反式，钠盐15B B D(2R,3R)，1/2硫酸盐(NCO-700)16 B B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-008)17 B A D(2R,3R),1/2硫酸盐18 B A F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-019)19 B C D(2R,3R),1/2硫酸盐20 B C F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-020)21 C B D反式，1/2硫酸盐(TOP-206)22 D B D(2R,3R),1/2硫酸盐23 E B D(2R,3R),1/2硫酸盐24 F B D(2R,3R),1/2硫酸盐25 G B D(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-003)26 H B D(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-015)27 H B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-017)28 I B F(2R,3R),1/2硫酸盐29 J B F(2R,3R),1/2硫酸盐30 K B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-010)31 L B D(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-005)32 L B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-013)33 M B D(2R,3R),1/2硫酸盐34 N B D(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-006)35 O B D(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-001)36 O B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-009)37 P B D(2R,3R),1/2硫酸盐38 Q B D(2R,3R),1/2硫酸盐39 R B F(2R,3R),1/2硫酸盐40 S B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-012)41 T B F(2R,3R),1/2硫酸盐42 U B F(2R,3R),1/2硫酸盐43 V B D(2R,3R),1/2硫酸盐44 B B F(2R,3R)，钠(TOP-007)45 C B F(2R,3R),1/2硫酸盐(TOP-018)
在上文中，R1和R2优选地分别是C2H5O-和(CH3)2CHCH2-。并且，在盐中硫酸盐是优选的。当R1是C4H9O-时，可以采用正-，仲-，叔-，和异-丁氧基中的任何一种。
特别定义的这些具有环氧基的哌嗪衍生物相信是通过环氧基而发挥作用，但E-64也含有环氧基。前述Shoji-Kasai等的参考文献揭示，类似于E-64的E-64-d表现出相关的作用，即能减缓癌细胞生长，并且具有与本发明例证性化合物部分地类似的结构。但是，E-64和E-64-d都不含有哌嗪环，而且已发现E-64对具有多药物抗性的癌细胞不是特别有效。尽管已报导E-64-d能延缓癌细胞生长。据信，不仅环氧基，而且哌嗪环对诱导癌细胞死亡都是必不可少的。已发现Calpai抑制剂1在上述范围内有轻微的效果，但它的毒性可能是一个障碍。已经测定了其它一些就存在哌嗪环和环氧基而论，具有类似于这些哌嗪衍生物的化合物(数据在此有略)，但是未观察到任何显著的作用，这意味着在特别定义的这些化合物中，发现它们对诱导癌细胞死亡有令人吃惊和出乎意料的作用，即反转mdr，并诱导癌细胞死亡，而对正常组织没有明显的毒性，这在药理学上似乎优越于防止癌转移。制备哌嗪衍生物基于通常的酰基卤法或混合酸酐法，可合成本发明中以结构式1表示的哌嗪衍生物，其详细过程在如下专利中已有描述Mesaki等的美国专利Nos.4,507,297和4,596,803，二者的标题都是“哌嗪衍生物和含有哌嗪衍生物的药物”，以及日本专利公开Nos.63-275575(1988)和63-275576(1988)，在此均被引入作为参考。
例如，在结构式1中R1是烷氧基的情况下，将通式(2)表示的亮氨酸衍生物与通式(3)表示的氨基衍生物反应，得到以通式(4)表示的化合物，
其中R2的定义与式1中的相同，R5是一个氨基酸的氨基保护基如叔-丁氧基羰基或其活性衍生物，R3与前面定义相同。随后用常规的方法除去保护基，并使这样得到的通式(5)表示的亮氨酰哌嗪衍生物同通式(6)表示的反式-环氧琥珀酸单酯或其活性衍生物反应，因此得到如下通式(7)表示的化合物，
在此R1的定义与式1中的相同，
另一种方法是，使上面结构式(6)反式-环氧琥珀酸单酯或其活性衍生物与亮氨酸反应，得到如下结构式(8)表示的环氧琥珀酰亮氨酸衍生物，
在此R1的定义与式1中相同，但不是羟基，或它的活性衍生物。然后将结构式(8)化合物同以上面结构式(3)表示的胺衍生物反应，因而得到上面结构式(7)化合物。
此外，结构式1化合物还可以通过如下缩合(脱水作用)反应得到
结构式(2)化合物与结构式(3)化合物的缩合反应，结构式(5)化合物与结构式(6)化合物的缩合反应，以及结构式(8)化合物与结构式(3)化合物的缩合反应，都可以常规的酰基卤法或混合酸酐法来进行，或者在已知的缩合剂如N-羟基琥珀酰亚胺和N,N′-二环己基碳化二亚胺存在下，在有机溶剂如二氯甲烷，氯化乙烯，氯仿，乙酸乙酯，或四氢呋喃等中，在-10°～+40℃，优选地是在-5°～+30℃进行这些缩合反应。
结构式(7)所表示化合物的酯残基，可借助任何一种现有的碱性水解法，容易地转化成相应的羧酸。
通过水解结构式(7)化合物的酯基，可以得到其中R1是羟基的化合物。
这样制备的哌嗪衍生物可任选地转化成其可药用的盐，例如钠盐，钾盐，钙盐或镁盐，或者转化成其三烷基胺，二苄胺，N-低级烷基哌啶，N-苄基-β-乙氧苯基胺，α-苯乙基胺，1-(1-萘基)乙基胺，以及盐酸，氢溴酸，甲酸，硫酸，富马酸，马来酸，或酒石酸的盐。另外，借助于采用旋光活性的反式-环氧琥珀酸单酯(6)例如可能根据Kenji Mori等(Tetrahedron,Vol.36(1),87-90,1980)或Japanese Patent Publication No.3-18629(1991)的方法合成的(2S,3S)-环氧琥珀酸单酯，或(2R,3R)-环氧琥珀酸单酯，通过上面提到的方法，也可能得到具有旋光活性环氧琥珀酸基的本发明结构式1化合物。药学用途本发明的另一方面是提供了用于诱导癌细胞死亡的药物，这种药物含有结构式1化合物或其可药用的盐作为活性成分。
本发明的结构式1化合物及其可药用的盐作为诱导癌细胞死亡药物的用途，通过它们对诱导癌细胞凋谢和转化癌细胞多药物抗性具有优良效果的事实已被证实了。
并且，根据用小鼠和大鼠的急性毒性试验，发现本发明的化合物对人使用是十分安全的。例如静脉注射NCO-700对大鼠的LD50是317mg/kg。该化合物的这种非毒性表现，使之有可能对患者长时间不间断地每天给予此化合物，直至癌肿被消灭，并且没有明显的副作用。该化合物的非毒性，致凋谢作用和反转多药抗性作用，将完全改变常规的化疗过程。
结构式1及其可药用盐的给药剂量取决于如下因素而有所不同癌症发展阶段，癌症类型，其多药物抗性的程度，以及可能同时进行的化疗的类型。一般情况下，为了能有效地引起癌细胞凋谢并逆转癌细胞的多药物抗性，它们对患者的给药剂量可以是大约15μg/kg-250mg/kg，优选地是大约250μg/kg-100mg/kg，更优选地是大约1mg/kg-50mg/kg。适合的靶癌细胞是人乳腺癌细胞，人黑素瘤细胞，人卵巢癌细胞，人结肠癌细胞，人胰腺癌细胞，人前列腺癌细胞，特别是当这些癌细胞处于未分化阶段时。
为了形成各种药物剂型，通常可以使结构式1化合物及其盐与药剂载体合并，配制成药剂组合物。载体的实例包括稀释剂，或者赋形剂如填充剂，粘合剂，崩解剂和润滑剂。
这样该药物可以形成多种剂型注射液，粉剂，胶囊，颗粒剂，片剂或安瓿。
在形成片剂的情况下，所采用的载体可选自本领域熟知的例如赋形剂如乳糖，蔗糖，氯化钠，葡萄糖溶液，淀粉，碳酸钙，结晶纤维素或硅酸；粘合剂如水，乙醇，丙醇，葡萄糖，淀粉溶液，明胶溶液，羧甲基纤维素，甲基纤维素或磷酸钾；崩解剂如干淀粉，海藻酸钠，琼脂粉，碳酸氢钠，碳酸钙，硬脂酸单酸甘油酯，淀粉或乳糖；或者润滑剂如硬脂酸盐，硼酸粉或固体聚乙二醇。理想情况下，该片剂还可有糖或明胶包衣，或者薄膜包衣。
在注射液的情况下，例如可采用选自如下的稀释剂水，乙醇，丙二醇，聚乙烯山梨糖醇，或脱水山梨糖醇酯。在这种情况下，可以加入足以形成等渗溶液量的氯化钠，葡萄糖或甘油。还可以方便地掺入通常使用的助溶剂，缓冲剂，止痛剂，或防腐剂。
该哌嗪衍生物可被单独给药，或者同另一化学治疗剂，或其它的治疗如放射治疗合并给药。在本哌嗪衍生物和另一化学治疗剂如长春花碱和阿霉素合并给药的情况下，哌嗪衍生物可基本上与此化学治疗剂同时被给予，为此，可使该哌嗪衍生物形成与此化学治疗剂一致的药剂形式。
将参照某些特定的实施例和测定实施例对本发明作更详细的阐述，目的仅在于说明，而不构成限制。根据上面说明的制备方法合成了每个待测化合物。打算用这些测定实施例说明结构式1化合物及其药剂学允许的盐，对于使癌细胞凋谢的反转癌细胞的多药物抗性表现出优秀的作用。实验1:NCO-700及相关类似物的单独的抗肿瘤活性NCO-700双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯]硫酸盐
TOP-008双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯]硫酸盐
TOP-009双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸苄酯]硫酸盐
TOP-013双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸苯酯]硫酸盐
TOP-017双[(2R,3R)-2-苄基氨基甲酰基-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷]硫酸盐
方法在此实验中，以3个不同的测定试验用于测定化合物抗肿瘤活性。
1．癌细胞死亡测定通过检测从受损伤或被杀灭细胞释放的细胞内标志性酶，乳酸脱氢酶(LDH)，对细胞死亡进行定量测定。在药物与癌细胞接触后24小时，测定释放进入细胞外液的LDH，按照Decker et al(J.Immunolog Methods 15:61-99,1988)的方法测定酶活性。
2．细胞残活测定对培养的肿瘤细胞进行细胞残活测定。在24孔培养板中作细胞培养，500-1000个细胞/孔，并对药物暴露持续7天。对药物暴露完成之后，用计算机细胞图象分析技术确定残存在每个培养孔中活细胞的数量。根据这些数据制作残活曲线，并计算ED50(允许50％细胞残活的药物浓度)。
3．体内试验模型/肾被膜下(Subrenal Capsule)(SRC)肿瘤移植试验将人肿瘤植入小鼠的肾被膜中，形成肿瘤移植模型。此肿瘤可成功地摆脱小鼠免疫系统的作用，生长超过6天时间。此试验的优点是，可在体内测定化学治疗剂的作用。此模型是在Irvin加利福尼亚大学由Stratton等(Gynecologic Oncology 17:185-188,1984)形成的。在第一天植入人肿瘤，在第2-6天给药。在药物治疗前的0时间和治疗后的第5天末，测定植入物的大小，当与未给药的对照动物相比较时在第6天植入肿瘤的大小差异，被称为Δ平均数。使用的细胞系用于本研究的所有细胞系都是从American Type Tissue CultureLaboratory(美国模式组织培养实验室)得到，并按照它们的技术要求进行培养。全部都是人癌细胞系，除非另有注明。用于我们研究的是下列细胞系及其器官组织细胞系组织 注解1MCF-7乳腺 +雌激素受体2MDA-MB231乳腺 +雌激素受体3T-47D乳腺 +雌激素受体4HS-578T 乳腺 -雌激素受体5B16F10 黑素瘤小鼠系6SK-Mel-2 黑素瘤7SW-626 卵巢8AN-3-CA 卵巢9HL-60白血病10 Hep-129 肝11 LS-174T 结肠12 WIDR 结肠13 DU-145 前列腺-睾酮受体14 PC-3 前列腺-睾酮受体15 LN 前列腺+睾酮受体结果1)NCO-700和癌细胞死亡首先进行的试验是在对多种人癌细胞的细胞死亡测定中，测定NCO-700单独的抗肿瘤活性。这些实验结果被显示在图1-6中，其中制作了NCO-700对LDH释放百分数的剂量-反应曲线，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。根据这些测定可以看出，(ⅰ)在乳腺癌细胞系中，对NCO-700有反应的细胞是雌激素受体阴性细胞，雌激素受体阴性通常是与更多地未分化，因此是更恶性的肿瘤有关的特征；(ⅱ)在黑素瘤组中，所有的细胞系都显示对NCO-700敏感；(ⅲ)在前列腺癌细胞系中，睾酮受体阴性的细胞系(更恶性的)对NCO-700反应非常好；(ⅳ)结肠癌和卵巢癌细胞系是部分地有反应；以及(ⅴ)白血病和肝癌细胞系对NCO-700没有反应。但是，如按后述实验(实验7)中所示，在与标准的化学治疗剂如长春花碱和阿霉素共同使用时，NCO-700对药物抗性肿瘤也具有显著的抗肿瘤活性，即使此时NCO-700对肿瘤的凋谢不是明显有效。
2)NCO-700类似物和细胞死亡用癌细胞死亡测定法对一系列与NCO-700相关的类似物进行了测定。如在图7中所示，当通过乳腺癌细胞系HS-578T释放LDH进行测定时，若干类似物具有显著的抗肿瘤活性。与NCO-700相比较时，包括类似物TOP-008,TOP-009和TOP-013在内的三个类似物显示有较高的效果。特别是TOP-008显示了最高的效果，比NCO-700具有高出大约3倍的杀灭乳腺癌细胞的效率。应该着重指出的是，这些类似物都是单独测定，没有任何补充的化学治疗剂。
因为看来TOP-008是至今体外试验所测定的最有效的NCO-700类似物，所以测验了它对其它癌细胞系的抗肿瘤活性。图8中的剂量-反应曲线显示出TOP-008对杀灭乳腺，前列腺和结肠细胞系的作用。此类似物其本身显示有出色的对抗这些癌细胞系的活性。
3)NCO-700和癌细胞残活测定癌细胞残活测定是体外试验中评价化合物抗肿瘤活性的一个重要补充，因为它是使细胞长时间(7天)暴露于药物。图9-16显示随着NCO-700剂量增加，对几个癌细胞系残活的影响。残活试验研究证实了细胞死亡测定得到的结果，即NCO-700单独对若干种人癌细胞(乳腺癌细胞系T-47D和HS-578T，结肠癌细胞系LS-174T和WIDR，以及前列腺癌细胞系DU-145，PC-3，和LN)具有显著的抗肿瘤活性。在这些曲线图中，纵座标表示目标面积，它代表通过计算机计算的残活癌细胞数量。
4)NCO-700在SRC试验中对在体内生长的人前列腺癌细胞的作用人癌细胞可在小鼠肾被膜下生长，在此有限的时间内它们可不被小鼠的免疫系统发觉。这种测定法提供了一个便利的系统，用于在体内研究药物对肿瘤生长的作用。因为这是很费时间的试验，并且比体外试验需要更多药物，所以先测定了NCO-700对单一前列腺癌细胞系的作用。对3组动物(总共n=23)用3个NCO-700剂量浓度进行了测定，包括10mg/kg,20mg/kg和40mg/kg。如图17所示，NCO-700对于缩小小鼠体内肿瘤的体积具有剂量反应性作用。尽管NCO-700在10mg/kg没有作用，但在20mg/kg和40mg/kg的水平具有显著的抗肿瘤作用。在40mg/kg NCO-700的作用非常显著，P值＜0.001(见图17)。同样，这种抗肿瘤作用是单独使用NCO-700所见，没有任何辅助药物加入，表明NCO-700和相关化合物具有作为新型抗肿瘤剂的高度潜力。
5)NCO-700在SRC试验中对在体内生长的人乳腺癌细胞的作用借助SRC试验测定了NCO-700对乳腺癌细胞系的作用。对3组动物(总共n=18)用3个NCO-700剂量浓度进行了测定，包括10mg/kg,25mg/kg，和50mg/kg。如图18所示，NCO-700对于缩小小鼠体内肿瘤的体积具有剂量反应性作用。尽管NCO-700在10mg/kg没有作用，但是在25mg/kg和50mg/kg的水平具有显著的抗肿瘤作用。这些研究证实了NCO-700及相关的化合物具有作为新型抗肿瘤剂的高度潜力。
6)NCO-700在SRC试验中对在体内生长的人结肠癌细胞的作用借助于SRC试验测定了NCO-700对结肠癌细胞系的作用。对3组动物(总共n=18)用2个NCO-700剂量浓度进行了测定，包括50mg/kg和100mg/kg。如图19所示，NCO-700对缩小小鼠体内肿瘤的体积具有剂量反应性作用。尽管NCO-700在50mg/kg仅有轻微的作用，但是在100mg/kg的水平具有显著的抗肿瘤作用。这些研究证实了NCO-700及相关化合物具有作为新型抗肿瘤剂的高度潜力。结论实验1证实，NCO-700单独作为抗肿瘤剂对特定的肿瘤是高度有效的。NCO-700类似物TOP-008就其抗肿瘤效力而言，比NCO-700高3倍。NCO-700抗肿瘤活性的机制似乎是基于与凋谢有关的机制。实验2:TOP-008和其它NCO-700类似物单独的抗肿瘤活性TOP-001双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸苄酯]硫酸盐
TOP-012双[3-氧代-2-苯并氧杂环戊烷-1-基(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸酯]硫酸盐
TOP-015双[(2R,3R)-2-苄基氨基甲酰基-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷]硫酸盐
TOP-003双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸三甲基乙酰氧基甲基]硫酸盐
TOP-005双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸苯酯]硫酸盐
TOP-006双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸5-茚满基酯]硫酸盐
TOP-010双[2-(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)乙基(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸酯]硫酸盐
方法如在实验1中所述，以三种不同的测定法对这些化合物的抗肿瘤活性进行了测定。结果1)NCO-700类似物和癌细胞死亡首先进行的试验是以细胞死亡测定法测定NCO-700类似物对若干种人癌细胞的抗肿瘤活性。这些实验结果显示在图20-25中，其中的柱状图表示以LDH释放百分数测定的某一特定类似物的活性，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。所有的类似物都是以25μM的浓度进行测定。根据这些测定可以看出，NCO-700类似物的抗肿瘤活性是高度选择性的，某些类似物显示出比NCO-700本身显著更高的活性。即使这些类似物对肿瘤的凋谢不是显著地有效，在与标准的化学治疗剂共同使用时，它们对药物抗性肿瘤也将有显著的抗肿瘤活性。
2)TOP-008和癌细胞残活测定图26-31显示随着TOP-008剂量增加，对几个癌细胞系的作用。残活研究证实，TOP-008是高活性的抗肿瘤剂(致凋谢剂)，并且在某些情况下活性比NCO-700高得多。例如，如果将NCO-700和TOP-008对抗人结肠癌细胞系WIDR的活性相比较(实验1中图16与图31相比较)，可发现在此特定试验中TOP-008的有效剂量低很多。实验3:NCO-700和相关类似物单独对胰腺癌细胞的抗肿瘤活性方法如在实验1中所述，进行癌细胞死亡测定以便测定如下化合物的抗肿瘤活性NCO-700,TOP-001,TOP-003,TOP-005,TOP-006,TOP-008,TOP-009,TOP-010,TOP-012,TOP-013,TOP-015，和TOP-017。采用的细胞系从American Type Tissue Culture Laboratory得到如下细胞系，并按它们的技术要求进行培养人胰腺癌细胞系ASPC-1和HS-766T。结果实验结果显示在图32中，其中的柱状图表明某一特定类似物的活性，以每个类似物24小时刺激的LDH释放的百分数表示，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。所有的类似物都以25μM的浓度进行测定。根据这些测定可以看出，某些类似物，特别是TOP-008和TOP-009显示出比NCO-700本身显著更高的活性。实验4以癌细胞死亡测定法中比较NCO-700和Calpain抑制剂根据上述实验1，以人癌细胞系DU-145的癌细胞死亡测定试验，对NCO-700和Calpain抑制剂1(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸，C20H37N3O4)的抗癌活性进行测定。图33显示Calpain抑制剂1和NCO-700的比较数据，此Calpain抑制剂1是从Boehringer-lngelheim得到。在图33中，显示NCO-700明显优于另一抑制剂。在100μM的浓度，NCO-700的效力几乎高出10倍。
在试图以长时间测定法(细胞残活试验)对Calpain抑制剂1进行测定时，正如根据其化学结构所预料的，它对细胞有毒性，并且Calpain抑制剂1的毒性将防碍以细胞残活试验或体内试验对此化合物的测定。实验5:NCO-700,TOP-008和相关类似物单独的抗肿瘤活性TOP-201(2RS,3RS)-3-[(S)-3-甲基-1-(4-苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
TOP-202(2RS,3RS)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(4-甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
TOP-203(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2-嘧啶基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
TOP-204(2S,3S)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2-嘧啶基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
TOP-205双[乙基(2RS,3RS)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯]硫酸盐
TOP-206双[(2RS,3RS)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸异丁酯]硫酸盐
TOP-207(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钾
TOP-007(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
根据上面实验1，以人癌细胞系HS-578T的癌细胞死亡测定试验，对NCO-700,TOP-008，和类似物TOP-201,202,203,204,205,206,207，及007的抗癌活性进行测定。在图34(1000个细胞/孔)和图35(1500个细胞/孔)中，柱状图表明某一特定类似物的活性，以LDH释放的百分数表示(DMSO，二甲基亚砜=对照)，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。所有的类似物都以25μM的浓度进行测定。根据这些测定可以看出，TOP-008(保存6个月的(OLD)和新合成的(NEW))具有非常好的抗肿瘤活性，TOP-206和NCO-700也具有相当好的抗肿瘤活性。被测定的其它类似物也显示有某些抗癌活性。硫酸盐形式似乎表现出较好的结果。实验6:TOP-008在凋谢检测试验中的抗肿瘤活性使用从R & D SYSTEMS(Minnesota)购得的凋谢检测试剂盒，按照说明书推荐的方案对TOP-008的抗肿瘤活性进行测定，试剂盒中，annexin Ⅴ，一种钙和磷脂结合蛋白，被用于对凋谢进行检测。对TOP-008以50μM的浓度，用人乳腺癌细胞系HS-578T进行了测定。将细胞在冷PBS中洗2次，再重新悬浮于少量1×结合缓冲液中。对此细胞加入荧光素标记的annexin Ⅴ和Propidum碘化物。在细胞膜外层表达磷脂酰丝氨酸的细胞可结合annexin Ⅴ，而细胞膜受损害的细胞允许Propidium碘化物结合于细胞内DNA。对所得到的细胞立即通过流动细胞计数技术进行分析时，可区分出三种可能的细胞群活细胞，未被二种荧光涂料中的任何一种染色，坏死细胞，能被二种荧光染料染色，以及遭受凋谢的细胞，只能被annexin Ⅴ-FITC试剂染色。分析是在装备有单色激光器的细胞计数器上进行，此激光器在488nm发射激发光。用FITC信号检测器(FL1)检测annexin Ⅴ-FITC产生的信号。结果显示在图36中，其中纵座标是荧光发射强度，横座标是细胞数目。图36a,36b和36c分别显示正常癌细胞(对照)，TOP-008(50μM)作用的癌细胞，以及TOP-008(25μM)作用的癌细胞。图36清楚地表明，TOP-008可诱导人乳腺癌细胞凋谢。实验7凋谢诱发的DNA断裂对前列腺癌细胞系PC-3分别用25μM TOP-008,50μM NCO-700，或水处理48小时。借助苯酚萃取法纯化来自每组样品的DNA，再通过琼脂糖凝胶电泳分辨DNA断裂。结果是，用TOP-008和NCO-700处理的二个样品显示出显著的DNA断裂，而对照样品(以水处理的)没有。已经阐明这种断裂作用是凋谢的一个指示(Jarvis et alCanc.Res.1154:1707-1714,1994,Pandey et alBiochem.Cell Biol.72:625-629,1994)。实验8其它相关化合物的抗肿瘤活性方法待测化合物的结构如上面所述，用三种测定试验评定如下化合物的抗肿瘤活性NCO-700,TOP-008,TOP-009,TOP-013,TOP-017,TOP-01 8,TOP-019，和TOP-020。TOP-018,TOP-019和TOP-020的结构显示如下双[(2R,3R)-3-[(S)-3-甲基-1-[4-(3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸异丁酯]硫酸盐
双[(2R,3R)-3-[(S)-1-[4-(反式-3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯]硫酸盐
状态白色无定形1H NMR(CD3OD)δ:0.85(6H,t,J=7.2Hz)1.20(6H,t,J=7.2Hz)1.24-1.33(4H,m)1.54-1.62(4H,m)2.95-4.13(20H,m)3.81(4H,d,J=7.3Hz)4.13-4.18(4H,m)4.69-4.72(2H,m)6.38(2H,dt,J=15.6Hz,7.3Hz)6.78(2H,d,J=15.6Hz)7.19-7.26(6H,m)7.42-7.44(4H,m)IR(KBr)Umaxcm-1:3435,2964,2937,1747,1651,1448,1275,1203,1120,1028双[(2R,3R)-3-[(S)-2,2-二甲基-1-[4-(反式-3-苯基-2-丙烯基)哌嗪-1-基羰基]丙基氨基甲酰基]-环氧乙烷-2-羧酸乙酯]硫酸盐
状态白色无定形1H NMR (CD3OD)δ:0.90(18H,s)1.19-1.22(6H,t,J=7.2Hz)2.97-4.22(20H,m)3.52(2H,d,J=2Hz)3.72(2H,d,J=2Hz)4.12-4.22(4H,m)4.72(2H,s)6.34-6.42(2H,dt,J=15.6Hz,7.3Hz)6.75-6.79(2H,d,J=15.6Hz)7.17-7.26(6H,m)7.42-7.44(4H,m)IR(KBr)Umaxcm-1:3423,2966,1747,1647,1448,1371,1259,1203,1119,1028,958,750,694癌细胞死亡测定通过检测从受损伤或被杀灭的人乳腺癌细胞HS578-T释放的细胞内标志酶，乳酸脱氢酶(LDH)，对细胞死亡进行定量测定。在药物与癌细胞接触后24小时，测定释放进入细胞外液的LDH，按照Decker等(J.Immunolog Methods 15:61-99,1988)的方法测定酶活性。
细胞残活测定对培养的人乳腺癌细胞HS 578-T进行细胞残活测定。在24孔培养板中作细胞培养，1000个细胞/孔，并对药物暴露持续7天。对药物暴露完成之后，用计算机细胞图象分析技术确定残存在每个培养孔中活细胞的数量。根据这些数据，制作残活曲线。
体内试验模型/肾被膜下(SRC)肿瘤移植试验(腹膜内注射给药)将人肿瘤植入小鼠的肾被膜中，形成肿瘤移植模型。此肿瘤可成功地摆脱小鼠免疫系统的作用，生长超过6天时间。此试验的优点是可在体内测定化学治疗剂的作用。此模型是在Irvine加利福尼亚大学由Stratton等(Gynecologic Oncology 17:185-188,1984)形成的。在第1天植入人前列腺瘤，在第2-6天给药。在药物治疗前的0时间和治疗后的第5天末，测定植入物的大小，当与未给药的对照动物相比较时，在第6天植入前列腺瘤的大小差异被称为Δ平均数。结果癌细胞死亡首先进行的试验是以细胞死亡测定法，测定NCO-700类似物对人乳腺癌细胞HS 578-T的抗肿瘤活性。这些实验结果被显示在图38-43中。每次测定试验中，类似物是以5个不同的剂量进行测定，包括1,5,10,25，和50μM。此外，某些试验还包括TOP-008,TOP-018和NCO-700的25μM剂量，以便能使新类似物同以前测定的化合物直接进行效力比较。在图38-43中，柱状图表示以LDH释放百分数测定的某一特定类似物的活性，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。根据这些测定可以看出，新类似物除了TOP-017和TOP-020之外，在此测定中都比NCO-700更有效。
癌细胞残活测定癌细胞残活测定是体外试验中评价化合物抗肿瘤活性的一个重要补充，因为它是使细胞长时间(7天)暴露于药物。图44和45显示，1,5,10,25,和50μM浓度的NCO-700类似物对人乳腺癌细胞HS 578-T残活的作用。这些残活试验研究证实，这些类似物中的几个具有高效力。
体内生长的人前列腺瘤如前面所述，人癌细胞可在小鼠肾被膜下生长，在此有限的时间内它们可不被小鼠的免疫系统发觉。这种测定法提供了一个便利的系统，用于在体内研究药物对肿瘤生长的作用。我们以二个不同的药物浓度，25mg/kg和50mg/kg，测定了NCO-700类似物对人前列腺瘤的作用。每个实验组包括6只动物，如果在较高剂量50mg/kg观察到有活性，则再以较低剂量(25mg/kg)给药。如在图46-50中所示，TOP-008,TOP-009和TOP-017在25mg/kg和50mg/kg剂量，对缩小肿瘤都有统计学显著性作用，而TOP-013在所测的最高剂量也仅有较小的作用。TOP-018,TOP-019和TOP-020在此测定中未显示出活性。TOP-018在体内试验缺乏活性是特别令人奇怪的，因为在体外试验它表现出强效力，因此可能反映出此化合物的生物有效度问题。实验9借助于共焦激光显微镜检测NCO-700和TOP-008对癌细胞凋谢的诱导作用此实验证实本发明的化合物在体内能引起癌细胞凋谢。用人肌瘤癌细胞进行癌细胞测定，先使此细胞在细胞培养基中生长成高密度，然后直接注射进入小鼠的腹膜腔。肿瘤细胞在小鼠腹腔生长之后，对动物以NCO-700或TOP-008进行治疗。然后借助共焦激光显微镜检测经治疗的癌细胞。这种技术使对癌细胞核中核物质有序结构的探查成为可能，并且可对细胞凋谢进行直接目视观测。方法借助于共焦激光显微镜测定以NCO-700和TOP-008治疗后癌细胞的凋谢细胞核中核酸断裂和无序化是细胞萎缩的标志。这种现象可通过先对癌细胞的核酸(DNA和RNA)作原位标记，随后借助于共焦激光扫描显微镜对核酸作目视观察来研究(Smith GJ et al.J ElectronMicrosc Tech 18:38-49,1991；Kressel M and Groscurth PI,CellTissue Res.278:549-561,1994)。
以1×107S-180人肌瘤癌细胞，通过腹膜腔内注射对20-22g的Swiss-Webster小鼠进行接种。待癌细胞在动物体内生长定居48小时之后，以NCO-700或TOP-008对动物腹膜内给药，每日给药一次，每只动物给2mg。药物治疗持续进行8天，在这段时间可从动物体内分离出癌细胞，并用共焦激光扫描显微镜观察，详细步骤参见上面引证的二篇参考文献。还用纯系黑小鼠c57BL/6J(Jackson Lebs)进行了补充实验。
在用共焦显微镜观察之前，先用吖啶橙对癌细胞染色。吖啶橙是一种核酸染色的特异性染料，它与核酸结合之后能发出荧光。可对单个癌细胞绘制荧光分布图，每个图形上显示的染色度反映出DNA的完整性，最高色度(白色)指示出致密的，高度有序的核酸，是健康癌细胞的典型核酸，而较低的色度是缺少致密，无序DNA的指示，是凋谢癌细胞的特征，其中正在发生DNA断裂(Kressel M and Groscurth PI,Cell TissueRes.278:549-561,1994)。用Meridian Instrument(Okemos.MI)激光共焦扫描显微镜进行显微镜观察。
癌细胞死亡测定以细胞死亡测定法对选定的化合物进行测定，包括TOP-008,Celpain抑制剂1和N-Cbz-Leu-Leu-Tyr重氮甲基酮(Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.214,No.3,Sep,25,1995,pp.1130-1137)。通过检测从受损伤或被杀灭的人乳腺癌细胞HS 578-T释放的细胞内标志酶，乳酸脱氢酶(LDH)对细胞死亡进行定量测定。在药物与癌细胞接触后24小时，测定释放进入细胞外液的LDH，按照Decker等(J Immunolog Methods15:61-99,1988)的方法测定酶的活性。结果癌细胞死亡测定以细胞死亡测定试验测定了TOP-008(TOP),Calpain抑制剂1(CAL.1)和N-Cbz-Leu-Leu-Tyr重氮甲基酮(N.CBZ)对人乳腺癌细胞HS 578-T的抗肿瘤活性。此实验结果显示在图51中。在此试验中，这几个化合物是以图中以μM量标明的浓度进行测定。图51中，柱状图表示以LDH释放百分数测定的某一特定化合物的活性，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。根据这些测定可以看出，所有被测定的化合物都具有抗肿瘤活性，TOP-008最有效。以最高浓度(50μM)测定的N-CBZ沉淀在培养基中。虽然N-CBZ有一定程度的杀灭癌细胞作用，但是N-CBZ借以杀灭癌细胞的机制可能反映了它对细胞的毒性。
借助于共焦激光显微镜测定以NCO-700和TOP-008治疗后癌细胞的凋谢对其腹膜内带有人肌瘤的小鼠以TOP-008或NCO-700治疗8天(2mg/kg，腹膜内注射)，导致动物体内的肿瘤负荷显著减少。代表性的动物照片显示在图52和53中。图52显示以人肌瘤细胞S-180植入的Swiss-Webster小鼠。对照动物腹部肿胀显而易见，指示这些动物体内有大肿瘤负荷。以NCO-700或TOP-008治疗的动物显示出非常小的肿瘤负荷。在图53中可见到类似的结果，在此是以这二个药物的同样剂量对c57BL/6J黑色小鼠进行了治疗。在这种小鼠中，NCO-700对减少腹膜内肿瘤负荷显得更有效。
在第8天末从动物体内取出腹膜液，并用吖啶橙(0.01％)对液体中的肿瘤细胞染色，用共焦激光显微镜观察。图54-56显示通过单个癌细胞的代表性扫描图形，这些癌细胞是从植入了人肌瘤细胞S-180的对照和药物治疗Swiss-Webster小鼠得到的。图54是对照动物典型的细胞，核区内明亮的核酸球形染色指示高度有序的核物质，表明是健康的，正在分裂的癌细胞。相反如图55和56所示，它们显示取自NCO-700(图55)和TOP-008(图56)治疗动物的典型癌细胞，这些细胞中的核物质是小裂片状，无序的，是遭受渐进性细胞死亡的或凋谢细胞典型的核物质。
共焦激光显微镜还能计算出健康癌细胞中典型的高度有序核物质的相对含量，并与遭受凋谢细胞内特征的较少有序的核物质含量相比较。图57-59显示取自与图54-56中相同动物的细胞中这样一种核酸荧光分布。在对照动物中(图57)，存在相当高百分数的高度有序的核酸(DNA和RNA)。高度有序的DNA具有高染色度，可以被看作是图57中荧光分布(蛋糕状图形)顶部的白“霜”。相反，在暴露了NCO-700的动物中(图58)这种高度有序的DNA显著减少了，而在暴露于TOP-008的动物中(图59)则不存在。这些结果表明，从药物治疗动物分离的癌细胞中正在发生凋谢，证实凋谢作用很可能是NCO-700和TOP-008的抗癌作用机制。实验10(比较实施例)相关化合物的抗肿瘤活性方法待测化合物的结构按照与上述相同的方式，以癌细胞死亡测定试验用于评价TOP-101至TOP-115(WO 9630378,WO 9630354)的抗肿瘤活性，并与NCO-700和TOP-008相比较，其中使用了乳腺癌细胞系HS 578T(最敏感的细胞系之一)。这些化合物的结构如下
(2R,3R)-3-[(RS)-3-甲基-1-苯基丁基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
(2S,3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸钠
(2S,3S)-3-[4-甲基-1-(3-甲苯丁基)戊基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠
(2S,3S)-3-二苯基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸乙酯
(2S,3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基-2-乙基氨基甲酰基环氧乙烷 -1-哌嗪基]甲基二膦酸二钠盐 甘氨酰]氧基哌啶基]亚甲基二膦酸二钠盐 -氧基哌啶基]亚甲基二膦酸二钠盐 甘氨酰]-1-哌嗪基]亚甲基二膦酸二钠盐 -L-亮氨酰]-1-哌嗪基]亚甲基二膦酸二钠盐 -L-亮氨酰]-1-哌嗪基]亚甲基二膦酸三钠盐 -L-亮氨酰-L-亮氨酰]-1-哌嗪基]亚甲基二膦酸二钠盐 -L-亮氨酰]-1-哌嗪基]-3-氧代]丙烷-1,1-二膦酸二钠盐 -L-亮氨酰-L-亮氨酰]-1-哌嗪基]亚甲基二膦酸三钠盐 环氧乙烷-2-羰基]氧基哌啶基]亚甲基-二膦酸二钠盐结果在用乳腺癌细胞的细胞死亡测定中，NCO-700类似物的抗肿瘤活性被显示在图60中，在此柱状图表示以LDH释放百分数测定的某一特定类似物的活性，释放的LDH值越高，表明抗肿瘤活性越强。所有类似物都以25μM的浓度进行测定。根据这些测定可以看出，与前面报告的相同，NCO-700和类似物TOP-008具有良好的抗肿瘤活性。被测定的其它类似物中，仅TOP-104显示有一些抗肿瘤活性，但比较弱。实验11:NCO-700对人肿瘤多药物抗性的逆转作用上述实验已经证实，本发明哌嗪衍生物的新特点是凋谢作用，也就是说，这些衍生物单独作为抗肿瘤剂是高度有效的。下面的实验是表明该哌嗪衍生物对药物抗性肿瘤具有显著抗肿瘤活性的一个实施例，是当该哌嗪衍生物与标准的化学治疗剂如长春花碱和阿霉素共同使用时，即使此时该化合物对某些癌细胞系的凋谢不是明显有效。方法和结果在此实验中，以4种不同的试验用于测定NCO-700阻断或反转药物抗性表型癌细胞或肿瘤的能力。这些试验包括1．药物积蓄试验以此测定NCO-700对培养的药物抗性和药物敏感性癌细胞中摄入一种抗癌药即放射性(3H)-长春花碱的影响(参考文献3)2．细胞残活试验以此测定NCO-700增强长春花碱杀灭癌细胞的作用。
3．体内致癌性模型以此测定NCO-700对阿霉素减少药物抗性肿瘤重量能力的影响。采用的细胞系在前二个体外试验，药物积蓄试验和细胞残活试验中，使用了对抗癌药物高度抗性的人咽癌细胞系(KB-V-1)。此细胞系是由国家癌症研究所(Nationel Cancer Institute)的Ira Pastan和MichaelGottesman博士，通过对药物抗性细胞在秋水仙素中逐步选择形成的。从它产生抗性细胞系的对照癌细胞系(KB-3)是对抗癌药物敏感的。与敏感株KB-3相比较，抗性KB-V-1细胞系对长春花碱的抗性高出大约275倍，并且具有产生可观测抗性的大大扩增的mdr基因。
对于体内致癌性模型，使用了由Pastan和Gottesman形成的，可在裸鼠体内生长成实体瘤的细胞系。此细胞系是一个非逆转性抗性细胞系，被定名为KB-CH8-5。所有这些细胞系都是由Gottesman博士慷慨赠送的。
下面的表2概括了药物积蓄试验得到的结果。借助于在Gottesman和Pastan博士实验室建立的方法(Foji et al,Cancer Res.45:3002-3007,1985)对[3H]-长春花碱的积蓄进行了测定。此方法，是将KB-V-1和KB-3细胞用24孔Costar培养板，在10％胎牛血清中以3×105个细胞/孔的密度作细胞培养。第二天，以Dulbecco改良的Eagle′s培养基替换生长培养基，加入或不加入(对照细胞)20μM NCO-700。10分钟之后，除去此培养基，以含有0.1μCi(13pmol)[3H]-长春花碱，加入或不加入20μM NCO-700的检测培养基(0.5ml)替换。再作用30分钟之后，除去培养基，以冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗培养板3次，用胰蛋白酶取下细胞，借助闪烁计数测定放射性。
表2NCO-700对长春花碱在抗性人癌细胞中积蓄的促进作用药物积蓄(Pmole长春花碱/mg蛋白)KB-V-1(抗性细胞) KB-3(敏感细胞)对照(单独长春花碱)0.29±0.032.29±0.1220μM NCO-700+长春花碱1.56±0.033.17±0.09如上面表2所示，由于mdr泵的作用，抗癌药长春花碱在药物抗性细胞系KB-V-1中的积蓄受到严格地限制。但是，将此细胞系暴露于20μM NCO-700时，保留在此癌细胞中的长春花碱含量则增加5倍。这将导致增强对药物抗性细胞的杀灭，如下面表3中所示。
表3NCO-700增强长春花碱对抗性癌细胞的杀灭细胞系 杀灭50％细胞的长春花碱量(ng)KB-3(敏感株) 3.2+25μM NCO-700 1.6KB-V-1(抗性株) 792+25μM NCO-700 148
是通过培养KB-3(敏感株)和KB-V-1(抗性株)细胞进行上面所示的细胞残活试验，在32mm孔的塑料培养板中，以300-500个细胞/孔的密度作细胞培养。在开始细胞培养后16小时加入长春花碱和NCO-700。37℃培养10天后，对细胞集落染色并计数。
如表3中所示，NCO-700对KB-V-1抗性癌细胞的残活具有惊人的影响。当此抗性细胞与30μM NCO-700共同温育时，杀灭50％肿瘤细胞所需的长春花碱含量从825ng下降至160ng。这种作用反映出对mdr泵的抑制或阻断，导致细胞内抗癌药物浓度增加。令人感兴趣的是，在此试验中对敏感性KB-3细胞的杀灭同样也有轻微的增强。
在下面的实验系列中，是以体内致癌性模型用于测定NCO-700对肿瘤重量的影响。用细胞系KB-CH-8/5进行了这些实验，它是由Gottesman和Pastan博士形成的细胞系，是特别作为来自实体肿瘤的细胞用于动物体内。对5-6周龄，体重25-30g的裸鼠皮下注射2-5×106个KB-CH-8/5细胞，并以阿霉素和加入或不加入NCO-700的阿霉素治疗14天，阿霉素的剂量是每天0.6mg/kg,NCO-700的剂量范围是每天0-80mg/kg。通过对切下的，包裹完整的肿瘤称重，并记录小鼠的体重，得到了显示在图37中的数据。图37明确地显示，NCO-700剂量增加显著地增强了阿霉素的效果，特别是在40mg/kg或更高的NCO-700剂量时。结论NCO-700促使抗癌药长春花碱在人癌细胞系内的积蓄增加了5倍。这导致对这些癌细胞的杀灭非常显著地增加。用NCO-700与阿霉素共同对携有抗性人肿瘤(KB-CH-8-5)的裸鼠给药时，肿瘤定量下降了60％，而不伴有体重丧失，虽然NCO-700单独不是明显地有效。
上面的实验是表明该哌嗪衍生物对药物抗性肿瘤具有显著抗肿瘤活性的一个实施例，是当该哌嗪衍生物与标准的化学治疗剂如长春花碱和阿霉素共同使用时，即使此时该化合物对某些癌细胞系的凋谢不是明显有效。因此，临床试验时，首先以本发明哌嗪衍生物的一个化合物，作为主要化学治疗剂对患有癌症(不论是否存在多药物抗性)的患者给药，当此化合物单独使用没有显出有效时，再补充实施另一种化学治疗作为附加的治疗，例如在基本上与该哌嗪衍生物的同时给予其它化学治疗剂。
此外，本发明的药剂还可用于治疗包括如下疾病的增殖细胞或癌变前细胞皮肤角化过度症，牛皮癣，乳腺和前列腺良性增生，Hodgkin′s病和其它淋巴瘤，白血病，以及结肠息肉。
本领域的技术人员将能理解，只有按照本发明的精髓才能形成本发明的多种变化和改进形式。因此，应清楚地理解到，本发明的这些形式仅是例证性的，并不打算对本发明的范围构成限制。
权利要求
1．式Ⅰ化合物或其可药用的盐在制备用于诱导增生性、癌变前或肿瘤细胞细胞死亡之药物中的应用
在此R1是羟基，C1-4烷氧基，C1-4烷羰氧基甲氧基，苯基C1-2烷氨基，2,5-吡咯烷二酮-1-烷氧基(C1-4)，或
其中X1是一个化学键或C1-2亚烷基，X2是H，或者当X1是亚甲基时X2是与X1形成5-元环的羧基，X3是H或C1-2烷基，X4是H或C1-2烷基，或者X3和X4共同形成一个5-元环，其中X2,X3，和X4中至少之一是H,R2是C3-4烷基，R3是C1-4烷基，
其中n是一个0-3的整数。
2．根据权利要求1的应用，其中所述化合物具有如下结构式
在此R4选自如下的基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2，和-C(CH3)3基团。
3．根据权利要求1的应用，其中所述的化合物具有如下结构式
在此R4选自如下的基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2和-C(CH3)3基团。
4．根据权利要求1的应用，其中所述化合物是硫酸盐的形式。
5．根据权利要求1的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞选自如下各种人乳腺癌细胞，人黑素瘤细胞，人卵巢癌细胞，人结肠癌细胞，人胰腺癌细胞，以及人前列腺癌细胞。
6．根据权利要求1的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞是未分化的癌细胞。
7．根据权利要求1的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞携带有活性mdr基团。
8．式1化合物或其药剂学允许的盐在制备用于增强对多药物抗性肿瘤细胞化学治疗的药物中的应用
在此R1是羟基，C1-4烷氧基，C1-4烷羰氧基甲氧基，苯基C1-2烷氨基，2,5-吡咯烷二酮-1-烷氧基(C1-4)或
其中X1是一个化学键或C1-2亚烷基，X2是H，或者当X1是亚甲基时X2是与X1形成5-元环的羧基，X3是H或C1-2烷基，X4是H或C1-2烷基，或者X3和X4共同形成一个5-元环，其中X2,X3，和X4中至少之一是H,R2是C3-4烷基，R3是C1-4烷基，
其中n是一个0-3的整数。
9．根据权利要求8的应用，其中所述的化学治疗是施用至少长春花碱或阿霉素。
10．根据权利要求8的应用，其中所述化合物具有如下结构式
在此R4选自如下基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2和-C(CH3)3基团。
11．根据权利要求8的应用，其中所述化合物具有如下结构式
在此R4选自如下的基团
R6选自-(CH2)2CH3,-CH2CH(CH3)2和-C(CH3)3基团。
12．根据权利要求8的应用，其中所述化合物是以硫酸盐的形式。
13．根据权利要求8的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞选自如下各种人乳腺癌细胞，人黑素瘤细胞，人卵巢癌细胞，人结肠癌细胞，人胰腺癌细胞，以及人前列腺癌细胞。
14．根据权利要求8的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞是未分化的癌细胞。
15．根据权利要求8的应用，其中所述被治疗的肿瘤细胞携带有活性mdr基团。
全文摘要
式(Ⅰ)的哌嗪化合物或其可药用的盐在制备用于诱导癌细胞死亡的药剂,作为主要的化学治疗剂,或者在制备用于增强对多药物抗性肿瘤细胞的化学治疗剂中的应用,在此R
文档编号A61K31/00GK1212623SQ97192668
公开日1999年3月31日 申请日期1997年1月24日 优先权日1996年1月26日
发明者G·F·艾隆, J·W·雅各布斯 申请人:日立化成工业株式会社, 日立化学研究中心, 日本化学医药株式会社