专利名称：具有神经原活性的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有神经原活性的化合物，方法和药物组合物。该化合物和组合物可以单独使用或与神经营养因子，如神经生长因子联合使用，用于治疗或预防由疾病或生理外伤引起的神经原损伤的方法中。
神经病学疾病与神经原细胞的死亡和损伤有关。例如，黑质中多巴胺能神经原的损失是帕金森氏病的病因。虽然在阿耳茨海默氏病中神经变性的分子学机理尚未建立，但炎症和β-淀粉蛋白和其它这类试剂的沉积会危害神经原的功能或生存。当患者患有大脑局部缺血或脊髓损伤时，可以观察到大量的神经原细胞死亡。目前，对于这些疾病还没有令人满意的治疗方法。
一种治疗神经病学疾病的方法包括使用能够抑制神经原细胞死亡的药物。最近的一种方法包括通过药物刺激轴突突起而促进神经细胞再生。
轴突突起可以用神经生长因子，如NGF进行体外刺激。例如神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)证明在体内和体外均具有神经营养活性，并且目前被尝试用于帕金森氏病的治疗。胰岛素和类胰岛素生长因子在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中和在培养的交感神经和感觉神经原显示具有刺激神经生长活性[Recio-Pinto等，J.Neurosci.，6，pp.1211-1219(1986)]。胰岛素和类胰岛素生长因子也可在体内和体外刺激受损的运动神经[Near等，PNAS，pp.89，11716-11720(1992)；和Edbladh等，BrainRes.，641，pp.76-82(1994)]。类似地，成纤维细胞生长因子(FGF)刺激神经细胞繁殖[D.Gospodarowicz等，Cell Differ.，19，p.1(1986)]和生长[M.A.Walter等.，Lymphokine Cytokine Res.，12，p.135(1993)]。
但是，使用神经生长因子治疗神经学疾病有多种缺点。它们不能快速地通过血-脑屏障。它们在血浆中不稳定。而且它们的药物转递特性也差。
最近，小分子化合物在体内显示有刺激轴索突起的活性。在患有神经学疾病的患者中，这种轴突突起的刺激可以保护神经原不再进一步退化，并加速神经细胞的再生。例如，雌激素具有促进突索和树突生长的活性，它们是生长中或受损的成人大脑中的轴突进行相互联系而通过神经细胞伸出的部分[(C.Dominique Toran-Allerand等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，56，pp.169-78(1996)；和B.S.McEwen等，Brain Res.Dev.Brain.Res.，87，pp.91-95(1995)]。通过给妇女服用雌激素而减缓阿耳茨海默氏病的发展。假设雌激素能够补充NGF和其它神经营养素并且因此帮助神经原的分化和生存。
据报道具有与FK506结合蛋白(FKBP)亲和并抑制该蛋白的旋转异构酶活性的化合物也具有神经生长刺激活性。[Lyons等，PNAS，91，pp.3191-3195(1994)]。很多这类化合物也具有免疫抑制活性。
免疫抑制药物，FK506(藤霉素)被证明在PC12细胞中刺激轴突突出和感觉神经节时与NGF有协同作用[Lyons等，(1994)]。这些化合物对病灶的大脑局部缺血具有保护作用[J.Sharkey和S.P.Butcher，Nature，371，pp.336-339(1994)]并加速受损的坐骨神经轴索的再生[B.Gold等，J.Neurosci.，15，pp.7509-16(1995)]。
但是，使用免疫抑制化合物显然是有缺陷的。除危害免疫功能外，长期用这些化合物治疗可导致肾毒性[Kopp等，J.Am.Soc.Nephrol.1，p.162(1991)]，神经机能缺损[P.C.DeGroen等，N.Eng.J.Med.，317，p.861(1987)]和高血压[Kahan等，N.Eng.J.Med.，321，p.1725(1989)]。
最近，与FKBP亚型结合而具有抑制旋转异构酶活性，但没有免疫抑制活性的化合物被用于刺激神经生长[见美国专利5,614,547；5,696,135；WO96/40633；WO96/40140；WO97/16190；J.P.Steiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，pp.2019-23(1997)；和G.S.Hamilton 等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，7，pp.1785-90(1997)]。当这些化合物被认为避免了某些不期望的具有免疫抑制的FKBP结合化合物的副作用时，它们仍然与FKBP结合并且抑制其旋转异构酶活性。后者的特性仍然导致了不希望的由于FKBP在哺乳动物体内的作用引起的副作用。
令人惊奇地，现在知道与FKBP结合并不是神经原活性所必需的。美国未决专利申请号08/748,447，08/748,448，08/749,114分别描述了用非FKBP结合，非-免疫抑制化合物刺激神经细胞生长并防止神经变性。由于与FKBP没有亲和性，这些化合物可有利地避免任何与FKBP有关的生化途径中潜在的干扰。而且，这些化合物确实能够通过抑制p-糖蛋白和NRP而抑制多抗药性(“MDR”)。当这些化合物需要刺激神经生长和预防神经变性的剂量小于MDR作用的剂量时，仍然需要得到对神经原活性专一而没有其它显著的作用机制的化合物。
虽然很多神经学退化疾病可以通过刺激轴突突起来治疗，但具有这种特性的化合物还是相对较少。而且，新的非免疫抑制化合物也仅仅在最近才在或组织中进行试验。这样，仍然需要发现新的能够刺激患者的轴突突起和预防神经变性而不引起免疫抑制，不干扰FKBP和不影响细胞泵，如p-糖蛋白或MRP的药用化合物和组合物。
申请人发现了几类不结合FKBP，不抑制MDR，但具有有效的神经原活性的化合物。
此处所用术语“神经原活性”，包括损伤的神经原的刺激，神经原再生的刺激，神经变性的预防和神经学疾病的治疗。本发明化合物同时具有外周神经和中枢神经系统活性。
有两类亚结构的化合物落入WO92/21313公开的化合物通式中。这些化合物的特征是具有下式结构
本发明的另外两类化合物具有下列通式
本发明也包括任何式(I)至(IV)化合物的药用衍生物。
在每类化合物中，A和B分别选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中A或B中所述烷基，链烯基或炔基链上任何一个CH2基均可以被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替代；其中R选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；Ar选自苯基，1-萘基，2-萘基，茚基，薁基(azulenyl)，芴基，蒽基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡咯基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，吡唑基(pyraxolyl)，2-吡唑啉基，吡唑烷基，异噁唑基，异噻唑基，1，2，3-噁二唑基，1，2，3-三唑基，1，2，3-噻二唑基，1，3，4-噻二唑基，1，2，4-三唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，4-噻二唑基，苯并噁唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，1，3，5-三嗪基，1，3，5-三噻嗪基(trithianyl)，中氮茚基，吲哚基，异吲哚基，3H-吲哚基，二氢吲哚基，苯并[b]呋喃基，苯并[b]噻吩基，1H-吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，4H-喹嗪基，喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，异喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，喹唑啉基，喹恶啉基，1，8-二氮杂萘基，哌啶基(peridinyl)，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基或吩恶嗪基或其它化学上可行的单环，双环或三环系统，其中每个环由5至7个环原子组成并且其中每个环含有0至3个分别选自N，N(R)，O，S，S(O)，或S(O)2的杂原子，并且其中每个Ar任选地被一至三个分别选自下列的取代基所取代卤原子，羟基，硝基，-SO3H，三氟甲基，三氟甲氧基，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基，O-[(C1-C6)-直链或支链烷基]，O-[(C2-C6)直链或支链链烯基，O-苄基，O-苯基，1，2-亚甲二氧基，-N(R1)(R2)，羧基，N-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰氨基，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰氨基，N-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，吗啉基，哌啶基，O-Z，CH2-(CH2)q-Z，O-(CH2)q-Z，(CH2)q-Z-O-Z，或CH＝CH-Z；其中R1和R2分别选自(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，氢原子或苄基；或其中R1和R2与和它们相连的氮原子一起构成5-7员杂环；Z选自4-甲氧基苯基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡唑基(pyrazyl)，喹啉基，3，5-二甲基异噁唑基，异噁唑基，2-甲基噻唑基，噻唑基，2-噻吩基，3-噻吩基，或嘧啶基；和q是0，1，或2；X是N，O，或CH；当X是N或CH时，Y选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；当X是0时，Y是孤电子对；n是0，1或2；m是0，1或2；n+m小于4并大于0；在通式II和IV中的环是饱和的，部分不饱和的或不饱和的；在通式II和IV的环中有1至2个碳原子可以选择地被分别选自O，S，S(O)，S(O)2或NR的杂原子替换；且通式II和IV中所述杂环可任意地与苯稠合。
J选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；或环己基甲基；K选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或环己基甲基；其中K中所述烷基，链烯基或炔基链中的任一CH2基可被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；D选自Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中D中所述烷基链中不直接与化合物中SO2相连的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或NR替换。
R3是(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中R3中的烷基，链烯基或炔基链中任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；其中R3中的烷基，链烯基或炔基链中除与氮原子相连的CH2基外的任一CH2基团可任选地被C(O)替换，条件是在式II中，当n是0且m是1时，R3的烷基链中第二个CH2基不能被C(O)替换。
此处公开的组合物包括本发明化合物，载体和选择性的神经原生长因子。
本文公开的刺激神经生长和预防神经变性的方法是单独使用上述化合物或将其与神经原生长因子联合使用。该方法可用于治疗和预防由各种神经学疾病和生理外伤引起的神经损伤也可用于体外的神经细胞再生。
申请人已经发现上述通式化合物具有神经原活性而不与FKBP结合，且没有多抗药性逆转活性。不受理论束缚，申请人认为本申请公开的化合物通过增加细胞浆Ca2+浓度而发挥其神经原活性。这可能是通过在神经细胞胞浆内的网状质上与钙释放通道，如利阿诺啶受体或肌醇1，4，5-三磷酸酯受体直接或间接相互作用取得的。
这样，根据一个具体方案，本发明提供了通过使具有下列特性的化合物与神经细胞接触而刺激神经生长或预防神经变性的方法a.增加细胞浆Ca2+浓度或与利阿诺啶受体结合；b.不与FKBP结合；且c.不具有MDR逆转活性。
根据相关的方案，本发明提供具有下列特性的化合物a.具有神经原活性；b.能够增加细胞浆Ca2+浓度或与利阿诺啶受体结合；c.不与FKBP结合；且d.不具有MDR逆转活性。
此处所用术语“增加细胞浆Ca2+浓度”是指在上述化合物存在下与适宜的对照物相比在下述的单通道记录测定试验中记录的通道电流有明显的增加。另外，此处所用术语“增加细胞浆Ca2+浓度”也可以是指在此处所述的细胞测定中的荧光光谱中有明显的位移。
此处所用术语“与利阿诺啶受体结合”是指在下述测定中化合物能够专一地与利阿诺啶匹配而结合到微粒体上。
此处所用术语“不与FKBP结合”是指化合物在至少一个下述的旋转异构酶抑制测定中具有10μM或更高的Ki值。
此处所用术语“不具有DMR逆转活性”是指在至少一个下述MDR测定中在浓度为2.5μM时，化合物具有的MDR比例小于7.0优选小于3.0。
单通道记录实验是用于测定本发明化合物引起的细胞浆Ca2+浓度的必要增加。该实验按照E.Kaftan等在CirculationResearch，78，p p.990-997(1996)中公开的方法进行，该公开插入此引作参考。单通道记录是在用一对通过CsCl汇合点与溶液接触的Ag/AgCl电极夹紧时的电压下进行。将囊泡加入顺式(cis)的槽中并与平坦的双层脂质融合，该脂质是由磷脂酰乙醇胺/卵磷脂组成(3∶1，30mg/ml在葵烷中，Avanti Polar Lipid)。反式(trans)槽中含有250mMHEPES和53mMBa(OH)2，PH7.35；顺式槽中含有250mMHEPES-Tris，PH7.35。将化合物溶解在甲醇中并加入顺式槽中。将通道电流用双层钳子放大器(BC-525A，Warner Instruments)放大并记录在VHS磁带上(Dagen Corp)。将数据在500Hz八-极Bessel过滤器上过滤，在2KHz数字化，转移到个人电脑上，并用pClamp型6.0(AxonInstruments)分析。在每一个化合物条件下单通道记录至少进行3次。
利阿诺啶结合可以通过将带有3H-利阿诺啶的微粒体蛋白在含有36mMTris PH7.2和50mMKCl的缓冲液中在有或没有试验化合物存在下温育进行。对照的最大结合是在0.72mM ATP和36μMCaCl2存在下进行。非特异性结合是在25μM未标记的利阿诺啶存在下进行。结合反应在室温下保温2小时，然后在30,000xg下离心15分钟。小丸溶解并且用闪烁计数法测定放射性。
另外，可将进入细胞的胞浆Ca2+流变成带有荧光的流动。例如，可以将神经原细胞用NGF和钙结合荧光染色剂，如Fura-2在含钙缓冲液中培养。使细胞在加入本发明的试验化合物前后均连续成像。然后将加入化合物前后的不同荧光强度以荧光单位在340nm和380nm的定量制图。
确认本发明化合物与FKBP12结合的Ki值为10μM或更高的试验可以通过现有技术中已知的多种方法取得。特别地，可以测定这些化合物有(或没有)抑制旋转异构酶的活性。这些测定发的例子是对FKBP12旋转异构酶抑制活性的测定可以是对人工底物--N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺的异构化--接着进行分光光度测定[M.W.Harding等Nature，34，pp.758-60(1989)；J.J.Siekierka等，Nature，34，341，pp.755-57(1989)；和S.T.Park等J.biol.Chem.，267，pp.3316-24(1992)]。测定包括顺式底物，FKBP12，试验化合物和胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶可以使对硝基酰苯胺从反式底物上裂开。测定释放的对-硝基酰苯胺。
其它的FKBP结合测定包括用标记的FK-506作报道配体的比较LH20结合试验。这些方法描述于M.W.Harding等的Nature，341，pp.758-60(1989)和J.J.Sielierka等 Nature，341，pp.755-57(1989)中。
为了确定本发明化合物是否满足MDR率低于7.0，有许多公开于美国专利5,543,423，5,717,092，5,726,184或5,744,485中的试验方法可以使用，这些公开插入此引作参考。
特别地，可以用已知的对具体药物具有抗药性的细胞系。这些细胞系包括，但不限于L1210，P388D，HL60和MCF7细胞系。另外，也可以开发出抗药的细胞系。将细胞系暴露于要拮抗的药物或试验化合物中；测定细胞的成活力并将其与暴露于有试验化合物存在的药物中的成活力进行比较(“MDR率”)。
根据方案，本发明提供下式化合物及其可药用衍生物
其中A和B分别选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中A或B中所述烷基，链烯基或炔基链上任何一个CH2基均可以被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替代；其中R选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，或(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；Ar选自苯基，1-萘基，2-萘基，茚基，薁基(azulenyl)，芴基，蒽基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡咯基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，吡唑基(pyraxolyl)，2-吡唑啉基，吡唑烷基，异噁唑基，异噻唑基，1，2，3-噁二唑基，1，2，3-三唑基，1，3，4-噻二唑基，1，2，4-三唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，4-噻二唑基，1，2，3-噻二唑基，苯并噁唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，1，3，5-三嗪基，1，3，5-三噻嗪基(trithianyl)基，中氮茚基，吲哚基，异吲哚基，3H-吲哚基，二氢吲哚基，苯并[b]呋喃基，苯并[b]噻吩基，1H-吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，4H-喹嗪基，喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，异喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，喹唑啉基，喹恶啉基，1，8-二氮杂萘基，吡啶基，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基或吩恶嗪基或其它化学上可行的单环，双环或三环系统，其中每个环由5至7个环原子组成并且其中每个环含有0至3个分别选自N，N(R)，O，S，S(O)，或S(O)2的杂原子，并且其中每个Ar任选地被一至三个分别选自下列的取代基所取代卤原子，羟基，硝基，-SO3H，三氟甲基，三氟甲氧基，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基，O-[(C1-C6)-直链或支链烷基]，O-[(C2-C6)直链或支链链烯基，O-苄基，O-苯基，1，2-亚甲二氧基，-N(R1)(R2)，羧基，N-(C1-C5-直链或支链烷基，C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰胺，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰基，N-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，吗啉基，哌啶基，O-Z，CH2-(CH2)q-Z，O-(CH2)q-Z，(CH2)q-Z-O-Z，或CH＝CH-Z；其中R1和R2分别选自(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，氢原子或苄基；或其中R1和R2与和它们相连的氮原子一起构成5-7员杂环；Z选自4-甲氧基苯基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡唑基(pyrazyl)，喹啉基，3，5-二甲基异噁唑基，异噁唑基，2-甲基噻唑基，噻唑基，2-噻吩基，3-噻吩基，或嘧啶基；和q是0，1，或2；X是N，O，或C(R)；其中当X是N或C(R)时，Y选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；当X是0时，Y是孤电子对；K选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或环己基甲基；其中K中所述烷基，链烯基或炔基链中的任一CH2基可被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；n是0，1或2；J选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；环己基甲基；且D选自Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中D中所述烷基链中不直接与化合物中SO2相连的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或NR替换在式I的优选方案中，A和B不同时为氢原子。更优选的是A和B中至少有一个为末端被Ar(其自身可被取代或未取代)取代的(C1-C6)直链烷基。更优选地，A和B中至少有一个为末端被吡啶(其自身可被取代或未取代)取代的(C1-C6)直链烷基。
根据另一个优选方案是X是氮原子或氧原子的式I化合物。
在另一个优选方案的式I化合物中，J是(C1-C3)直链烷基。
在式I的另一个优选方案中，K是Ar-取代的(C1-C3)直链烷基。更优选的是K为末端被未取代的苯基取代的(C1-C3)直链烷基。
根据另一个优选式I方案，D选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；或-CH2-S(O)2-(C1-C4)直链或支链烷基。
更优选地，D选自氨基苯基，硝基苯基，异丙基，苄基，氟代苯基，氰基苯基，甲氧基苯基，二甲氧基苯基，甲磺酰甲基，亚乙基苯基，二硝基苯胺基苯基，N，N-二甲基氨基苯基偶氮苯基，N，N-二甲基氨基萘基或乙酰氨基苯基。
更优选地，D选自4-氨基苯基，2-硝基苯基，甲磺酰基甲基，苄基，亚乙基苯基，4-氟苯基，4-氰基苯基，3，4-二甲氧基苯基，4-甲氧基苯基，4-(2，4-二硝基苯氨基)苯基，4-((4-(N，N-二甲基氨基)苯基)偶氮)苯基，5-(N，N-二甲基氨基)萘基或4-乙酰氨基苯基。
根据另一个优选方案，Y是甲基。
在另一个优选方案中，n是0。根据另一个优选方案，本发明提供下式化合物及其药用衍生物
其中A，B，Y，D，n和它们附属的定义如上；m是0，1，或2；n+m小于4但大于0；在式II中的环是饱和，部分不饱和或不饱和的；在II的环中有1至2干个碳原子可任选地被分别选自O，S，S(O)，S(O)2或NR的杂原子替换；且所述式II中的环可任选地与苯稠合。
优选地，在式II中，n是0，m是2和环是完全饱和的。
根据其它优选的式II化合物是所述环中的一个碳原子可任选地被选自O，S，SO，或SO2的杂原子替换。
在式II化合物中各成分的方案是具有与上述式I化合物相同的定义。更优选的式I和II化合物列于下列表1和2中
表1.式I化合物
表2.式II化合物
根据另一个方案，本发明提供下式化合物及其药用衍生物
其中A，B，X，Y，K，J，n和其附属的定义与式I中各定义相同；且R3是(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中R3中烷基，链烯基或炔基中的任一CH2基可以被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；并且其中R3中烷基，链烯基或炔基中除与氮原子相连的CH2基以外的任一CH2基可以被C(O)替换。
根据另一个方案，本发明提供下式化合物及其药用衍生物；
其中A，B，X，Y，n，m和其附属的基固定义如式(II)化合物；及R3定义如式(III)化合物，条件是在式IV中，当n是0且m是1时，R3的烷基，链烯基或炔基链中的第二个CH2基不能被C(O)替换。
术语“R3的烷基链中的第二个CH2基”是指与氮原子相连的CH2基直接相连的CH2基(如下所示
优选地，在式III和IV化合物中A和B中至少有一个是Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基链。更优选的是A和B中至少一个是末端被苯基或吡啶基取代的(C1-C6)-烷基链。
根据另一个优选的方案在式III或IV中，X是N或O。
根据另一个优选的方案，在式III化合物中，K是Ar-取代的烷基。链烯基，炔基。更优选地，K是苄基。
根据另一个优选方案，在式III化合物，J是氢原子或烷基，优选甲基。
在式III和IV中，R3优选是氢原子，(C1-C6)-烷基，末端被吡啶基，或3，4，5-三甲氧基苯甲酰基甲基取代的(C1-C6)烷基。
在式III的优选方案中，n是0。
在优选方案中式IV中的环是完全饱和的。
在式IV化合物的优选方案中，m+n是1或2。甚至更优选的是n为0而m为1或2。更优选地，n是0且m是2。
式III和IV化合物最优选的方案列于下列表中，并且描述于实施例表3.式III和IV化合物
本发明包括式I至IV化合物的所有光学和外消旋异构体，及其药用衍生物。
此处所用“药用衍生物”是指任何可以提供(直接或间接)具有神经原活性的本发明化合物，或其代谢产物或残余物的任何药用盐，酯，前药，或这些酯或前药，能够给患者服用的本发明化合物或其他化合物的盐。
令人惊奇地和出人意料地，本发明的式(I)至(IV)化合物不与FKBP结合，不抑制旋转异构酶活性并且没有免疫抑制作用。但是，虽然本发明化合物与已知的逆转多抗病性化合物(见美国专利5,543,423，WO95/26337和WO94/07858)在结构上有些类似，但本发明化合物没有显示抗MDR活性。这样，本发明公开的化合物优选具有神经原活性，而没有结构类似的化合物副作用。
本发明化合物的神经生长活性最初可以用现有技术中已知的多细胞培养试验来测定。例如，本发明化合物在轴突突起中的试验可以按照Lyon等在PNAS，91，pp.3191-3195(1994)中描述的方法用嗜铬细胞瘤PC12细胞进行。相似的试验可以用SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞进行。另外，也可以使用此处引作参考的美国专利5,614,547或G.S.Hamilton等在Bioorg.Med.Chem.Lett.，(1997)上描述的鸡背侧底部神经节试验。
本发明化合物也可以用帕金森氏病的大鼠模型进行体内神经生长活性试验[J.P.Steiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，pp.2019-23(1997)美国专利5,721,256]或继续用外科手术将大鼠的坐骨神经碾碎。
根据另一个方案，本发明提供含有任意式(I)至(IV)化合物和药用载体的组合物。优选地，本发明的组合物可以制成制剂给哺乳动物服用(如药物组合物)。
本发明化合物的药用盐也可以用于该组合物中，这些盐优选是从无机或有机酸或碱衍生的。与酸形成的盐包括下列乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天门冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡糖酸盐，十二烷硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，富马酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，羟乙酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，磷酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，水杨酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其它酸，如草酸，虽然其本身不可药用，但可以用与制备用于获得本发明化合物及其药用加成盐的中间体的盐。
碱盐包括铵盐，碱金属盐，如钠盐和钾盐，碱土金属盐，如钙盐和镁盐，与有机碱所成的盐，如二环己胺盐，N-甲基-D-葡糖胺，和与氨基酸所成的盐，如精氨酸，赖氨酸和N-(C1-4烷基)4+盐。
而且，碱性含氮基团可以用一些试剂季铵化，这些试剂例如是低级烷基卤化物，如氯，溴和碘甲烷，乙烷，丙烷和丁烷；二烷基硫酸酯，如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸酯，长链卤化物，如癸基，月桂基肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物，溴化物和碘化物，芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物等等。因此可得到水或油溶性或分散产品。
本发明方法和组合物中的化合物也可以通过添加适宜的功能基的修饰以增强选择的生物活性。这种修饰是现有技术中已知的并包括那些增加生物渗透进入所给的生物系统(如血液，淋巴系统，中枢神经系统)以增加口服的生物利用度，增加允许注射的溶解性，改变代谢和改变排泄率的修饰。
可用于这些药用组合物中的药用载体包括，但不限于，离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，自-乳化药物转递系统(SEDDS)如dα-生育酚，聚乙二醇1000琥珀酸酯，或TPGS，可用于药物制剂中的表面活性剂例如可以是吐温或其它类似聚合物转递基质，血清蛋白，如人血清白蛋白，明胶，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸部分甘油酯，水，盐或电解质，如鱼精蛋白硫酸盐，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶质硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙酰基聚乙二醇酸，柠檬酸，纤维素-物质，如HPC和HPMC，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸脂，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇，羊毛脂。环糊精，如α-，β-，和γ-环糊精，或化学修饰衍生物如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精，或其它可增溶的衍生物也优选用于增强本发明化合物的传递。
根据另一个方案，本发明的药物组合物还可以包括神经营养因子。此处所用术语“神经营养因子”是指能够刺激神经组织生长或繁殖的化合物。用于本发明的术语“神经营养因子”不包括此处所述的化合物。
现有技术中已经鉴定了大量神经营养因子并且这些因子中的任意化合物均可用于本发明的组合物中。这些神经营养因子包括，但不限于，神经生长因子(NGF)，胰岛素因子生长因子(IGF-1)和其活性切断衍生物如gIGF-1，酸性和碱性纤维原细胞生长因子(分别为aFGF和bFGF)，血小板-衍生生长因子(PDGF)，大脑衍生的神经营养因子(BDNF)，纤毛神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养素-3(NT-3)，神经营养素4/5(NT-4/5)，或WO97/36869，WO96/41609，WO97/16190，WO96/40633，WO97/18828，WO96/40140或WO98/13355中描述的任意化合物。本发明组合物中最优选的神经营养因子是NGF。
本发明的组合物可以口服，非肠道给药，通过吸入喷雾，局部给药，直肠给药，鼻给药，口腔给药，阴道给药或通过输液给药。此处所用术语“非肠道”包括皮下注射，静脉注射，肌肉注射，关节内给药，滑液内给药，膜给药，鞘内给药，病灶内给药(intralesional)和颅骨内注射或输液技术。优选地，组合物通过口服，腹膜内或静脉内给药。
本发明的药物组合物可以含有任意常规的无毒药用载体，辅料或载体。在某些情况下，可以用药用酸，碱或缓冲液调节制剂的PH以增强制剂的化合物或其传递形式的稳定性。
本发明组合物的无菌注射形式可以是水溶液或油质悬浮液。这些悬浮液可以根据现有技术中的已知技术用适宜的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂可以是在无毒非肠道用稀释剂或溶剂中的无菌可注射液或或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可接受的载体和溶剂可以用水，林格溶液和去离子氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油是常用的溶剂或悬浮介质。为此目的，任何无味不挥发油都可使用，包括合成的单-或双-甘油。脂肪酸，如油酸和其甘油衍生物可用于注射制剂中，作为天然药用油，如橄榄油或蓖麻油，特别是被聚氧乙基化后。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如Ph.Helv或类似的醇。
本发明的药物组合物可以以任何可口服的剂型口服给药，包括，但不限于，胶囊，片剂，水悬浮液或水溶液。对于用于口服的片剂，常用的载体包括乳糖，玉米淀粉，磷酸二钙盐和微晶纤维素(Avicel)。润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉也可经常加入。对于口服的胶囊，可用的稀释剂包括乳糖，干玉米淀粉和TPGS，也可使用其它用于片剂中的稀释剂。对于口服的软胶囊(填充本发明化合物的悬浮液或溶液)，可用的稀释剂包括PEG400，TPGS，聚乙二醇，阿拉伯醇，Gelucre，Transcutol，PVP和乙酸钠。当口服水悬浮液时，可将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合，如CMC钠，甲基纤维素，胶质和明胶。如果需要，可以加入甜味剂和/或调味剂和/或调色剂。
此外，本发明的药物组合物可以以栓剂的形式直肠给药。可以通过将试剂与适宜的无-刺激在室温为固体但在直肠温度下为液体的赋形剂混合而制备，该栓剂因此在直肠可以熔化而释放出药物。这种材料包括可可脂，蜂蜡，明胶，甘油和聚乙二醇。
本发明的药物组合物可以局部给药，特别是当需治疗的部位包括通过局部使用而易于吸收的体表和组织时，包括眼部疾病，皮肤病，或下肠道。适宜的局部给药制剂应制成适于这些体表或组织的形式。
对于下肠道的局部使用可以制成直肠栓剂(见上述)或适宜的灌肠制剂。也可以使用局部透皮膏。
对于局部使用，药物组合物可以制成适宜的含有活性成分悬浮于或溶解于一种或多种载体中软膏。用于本发明化合物局部给药的载体包括，但不限于，矿物油，液体凡士林，白凡士林，聚乙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蜡，硬脂酸，硬脂酸鲸蜡酯，鲸蜡醇，羊毛脂，氢氧化镁，高岭土和水。另外，药物组合物可以制成含有活性成分悬浮于或溶解于一种或多种药用载体中的洗液或乳膏。适宜的载体包括，但不限于，矿物油，山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨酸酯60，鲸蜡酯，蜡，鲸蜡醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。
对于眼内用药，药物组合物可以制备成微粒化的在等渗的，调节了PH的灭菌盐水中的悬浮液，或优选在等渗的，调节了PH的灭菌盐水中的溶液，并且加或不加防腐剂如苯甲羟胺氯化物。此外，对于眼内使用，药物组合物可以制成软膏如凡士林软膏。
本发明的药物组合物可以鼻气雾剂或吸入剂形式给药。这些组合物可以根据药物制剂领域中已知的常规技术制备并可以制备成在盐水中的溶液，用苄醇或其它适宜的防腐剂，可以提高生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物，和/或其它常规的增溶剂或分散剂。
与载体材料混合以制备单位剂量形式的化合物和神经营养因子(在这类组合物中含有神经营养因子)的用量取决于所治疗的宿主，具体的给药模式。优选地，本发明组合物可以制成含有可以服用的本发明化合物在0.01-10mg/kg体重/天的制剂形式。更优选地，剂量范围在0.1-10mg/kg体重/天。
这些组合物含有神经营养因子，这些因子和本发明化合物协同作用以刺激轴突突起或预防神经变性。因此，在该组合物中神经营养因子的用量少于单独使用该因子治疗所需要的量。在该组合物中可服用的神经营养因子的剂量范围在0.01-10mg/kg体重/天。
可以理解对于每一个具体患者的具体剂量和治疗情况取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，服药时间，排泄率，联合用药，治疗医生的判断和所治疗的疾病的严重程度。活性成分的用量取决于具体化合物和神组合物中的神经营养因子。
根据另一个方案，本发明提供刺激轴突突起和神经生长并预防神经变性的方法。对于该方案，本方法用于刺激患者的轴突突起和神经生长并预防神经变性并且是提供给患者服用含有本发明任意化合物和药用载体的的药物组合物而实现的。这些方法中所用化合物的量在0.01至10mg/kg体重/天。
该方法用于治疗神经损伤和预防有多种疾病或生理损伤引起的神经变性。这包括但不限于，三叉神经痛，舌咽神经痛，贝尔氏瘫痪，重症肌无力，肌肉营养不良，肌肉损伤，渐行性肌肉萎缩，渐行性球根遗传肌萎缩，脱肠(herniated)，破裂的或下垂的无脊椎板综合症，子宫颈脊椎关节强硬，神经丛疾病，胸口破损综合症，外周神经病，如由铅，氨苯砜，壁虱，或紫质症引起的神经病，或其它外周髓磷脂疾病，阿尔茨海默氏疾病，古兰-贝尔(Gullain-Barre)综合症，帕金森病和其它帕金森神经机能障碍疾病，ALS，多硬化症，其它中枢髓磷脂疾病，中风和与中风有关的局部缺血，神经paropathy，其它神经变性疾病，运动神经元疾病，坐骨变形，与糖尿病有关的神经病，脊椎索损伤，面部神经变形和其它外伤，化学治疗-和其它药物-诱导的神经病和亨廷顿氏疾病。
在该方案的另一方面，是用于刺激体外神经生长的方法。为此，上述化合物或组合物可以直接用于培养中的神经细胞。本发明的这一方面是用于体外神经的再生。
根据另一方案，刺激轴突突起或预防神经变性的方法包括给患者外加的治疗步骤或有神经营养因子培养的体外神经细胞，这些因子如上述的本发明组合物中含有的因子。该方案包括以单剂量形式或分开的多剂量形式给患者服用化合物或神经营养因子。如果用分开剂量，共同地，或在小于5小时的间隔内连续给药。
为了使此处所述的本发明被更完全地理解，提供下列实施例。应该理解这些实施例仅有说明的目的而不以任何方式限制本发明。一般方法质子核磁共振(1H NMR)谱是在Bruker AMX 500仪在500MHz测定的。化学位移是相对于Me2Si每百万部分给出的。高效液相色谱分析是在Hewlett-Packard 1050液相色谱仪上进行的。
实施例1N-(4-氨基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-2-(N-甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺N-(4-氨基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-2-(N-甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺化合物的合成如下。A.(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺
在(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-叔丁基酯(5.0g，21.8mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入EDC(6.0g，191.71，31.2mmol)随后加入2-(2-甲基氨基乙基)吡啶(3.0g，22mmol)并将混合物室温搅拌24小时。
将溶液用200ml乙酸乙酯和水(50ml)稀释。将水层通过加入2NNaOH调节PH至12-13以使其为碱性。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后用2∶98甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到3.8g(收率50％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.49(5∶95甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(S)-哌啶-2-甲酸-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺
在步骤A所得化合物(3.8g，10.9mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中加入三氟乙酸(10ml，130mmol)。将混合物室温搅拌2小时。将溶液减压浓缩至干。将残余物溶解在乙酸乙酯(200ml)和水(50ml)中。将水层通过加入2N NaOH至PH14-15而碱化。
将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后用1∶10∶90NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到2.2g(收率81％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.11(1∶10∶90 NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝5.22分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
C.N-(4-硝基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺
在步骤B所得化合物(200mg，0.81mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中加入三乙胺(2.0ml，101.19，19.8mmol)然后加入4-硝基苯磺酰氯(260mg，1.22mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用100ml乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)稀释。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到273mg(收率78％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.57(5∶95甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。D.N-(4-氨基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺(化合物1)
将步骤C所得化合物(273mg，0.63mmol)的乙酸乙酯(10ml)和乙醇(10ml)溶液在室温下用150mg10％钯炭和微阳性氢气压下氢化处理24小时。将混合物过滤并真空浓缩，将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后2∶98甲醇/二氯甲烷再用0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到102mg(收率40％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.36(1∶10∶90 NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝6.86分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例2(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺(化合物2)的合成如下。A.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-2-叔丁氧基羰基)氨基-3-苯基-N-(3-吡啶-4-基)丙基丁基丙酰胺
在Boc-(N-甲基)苯基丙氨酸(5.0g，17.8mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入EDC(6.0g，191.71，31.2mmol)然后加入2-(2-甲基氨基乙基)吡啶(2.5g，18.4mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用200ml乙酸乙酯和水(50ml)稀释。将水层通过加入2N NaOH至PH12而碱化。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后2∶98的甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到2.83g(收率40％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.56(5∶95甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺
在步骤A所得化合物(2.83g，7.1mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中加入三氟乙酸(10ml，130mmol)。将混合物室温搅拌2小时。将溶液减压浓缩至干。将残余物溶解在乙酸乙酯(200ml)和水(50ml)中。将水层通过加入2N NaOH至PH14-15而碱化。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到1.53g(收率75％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.70(1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝5.54分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-硝基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺
在步骤B所得化合物(300mg，1.05mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三乙胺(2.0ml，101.19，19.8mmol)然后加入4-硝基苯磺酰氯(330mg，1.56mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用100ml乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)稀释。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后1∶99甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到453mg(收率89％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.63(5∶95甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。D.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺(化合物2)
将步骤C所得化合物(453mg，0.94mmol)的乙酸乙酯(20ml)溶液在室温下用150mg10％钯炭在微阳性氢气压下氢化处理24小时。将混合物过滤并真空浓缩，将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后2∶98甲醇/二氯甲烷再用0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到194mg(收率46％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.46(1∶10∶90 NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝9.04分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例3N-(4-硝基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-(N甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺N-(4-硝基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-(N甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺(化合物3)的合成如下所述。A.3-(3-溴丙基)-吡啶
在3-吡啶丙醇(9.50g，69.3mmol)的DMF(50ml)溶液中加入三苯基膦(20.0g，76.2mmol)然后加入溴(5.4ml，104mmol)。将混合物室温搅拌48小时。将溶液用200ml水稀释并将水层通过加入2N NaOH至PH12-13而碱化。将有机层溶解在乙酸乙酯(200ml)中。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后1∶99甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到11.8g(收率85％)的桔黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.8(3∶97甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.N-甲基-3-(3-氨基丙基)-吡啶
在步骤A所得化合物(11.8g，59mmol)的甲醇(50ml)溶液中在10至15分钟内吹入N-甲基胺气体直至饱和。将烧瓶密封并将混合物室温搅拌过夜。将混合物真空浓缩并将残余物溶解在乙酸乙酯和水中。将水层通过加入2N NaOH至PH14-15而碱化。将有机层溶解在乙酸乙酯(250ml)中。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后5∶95甲醇/二氯甲烷再用1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到3.2g(收率36％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.14(1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.N-甲基-(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-3-((吡啶-3-基)-丙基)酰胺。
在(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-叔丁酯(2.28g，9.9mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中加入EDC(2.0g，191.71，10.4mmol)然后加入步骤B所得化合物(11.8g，59mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用200ml乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)稀释。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后5∶95甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到1.2g(收率33％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.28(5∶95的甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。D.(S)-哌啶-2-甲酸-((N-甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺
在步骤C所得化合物(1.2g，3.3mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入三氟乙酸(10ml，130mmol)。将混合物室温搅拌3小时。将溶液减压浓缩至干。将残余物溶解在乙酸乙酯(200ml)和2NNaOH(50ml)中。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用5∶95甲醇/二氯甲烷然后1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到850mg(收率98％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.17(1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC＝6.67分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。E.N-(4-硝基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-((N-甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺
在步骤D所得化合物(250mg，0.96mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三乙胺(2.0ml，101.19，19.8mmol)然后加入4-硝基苯磺酰氯(300mg，1.42mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用200ml乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)稀释。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后1∶99甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到165mg(收率37％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.52(5∶95的甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。F.N-(4-硝基苯磺酰氨基)-(S)-哌啶-2-甲酸-((N-甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺(化合物3)。
在步骤E所得化合物(165mg，0.35mmol)的乙酸乙酯(20ml)溶液在室温下用150mg10％钯炭在微阳性氢气压下氢化处理24小时。将混合物过滤并真空浓缩，将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后2∶98甲醇/二氯甲烷再用0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到60mg(收率41％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.20(5∶95甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝7.25分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例4(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(4-吡啶-3-基)-1-(3-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(4-吡啶-3-基)-1-(3-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺的合成如下。A.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-2-叔丁氧羰基)氨基-3-苯基-N-(4-吡啶-3基)-1-(3-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺
在Boc-(N-甲基)苯基丙氨酸(1.42g，5.1mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入EDC(0.98g，191.71，5.1mmol)然后加入N-甲基-1，7-双(3-吡啶基)-4-庚胺(1.2g，18.4mmol)。将混合物室温搅拌24小时。将溶液用100ml乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)稀释。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用2∶98甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到970mg(收率42％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.51(5∶95的甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(S)-(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(3-吡啶-4-基)-1-(4-(吡啶-3基)丙基)丁基)丙酰胺。
在步骤A所得化合物(5.0g，9.2mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入三氟乙酸(20ml，260mmol)。将混合物室温搅拌3小时。将溶液减压浓缩至干。将残余物溶解在乙酸乙酯(200ml)和饱和碳酸氢钠溶液(100ml)中。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用1∶99甲醇/二氯甲烷然后5∶95的甲醇/二氯甲烷再用1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到3.12g(收率76％)的无色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.38(1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝9.52分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-4-硝基苯磺酰氨基)-3-苯基-N-(4-(吡啶-3-基)-1-(3-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺。
在步骤B所得化合物(1.5g，3.4mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入三乙胺(5.0ml，101.19，35.8mmol)然后再加入4-硝基苯磺酰氯(1.0g，4.7mmol)。然后将混合物室温搅拌24小时。将溶液用150ml乙酸乙酯稀释并用水(50ml)洗涤。将分离的有机层用无水MgSO4干燥并减压浓缩。将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后1∶99甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到1.75g(收率83％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.67(5∶95的甲醇/二氯甲烷)，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。D.(S)-(N-甲基)-2-(甲基-(4-氨基-苯磺酰氨基))-3-苯基-N-(4-吡啶-3-基)-1-(3-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺(化合物4)
将步骤C所得化合物(1.75g，2.78mmol)的乙酸乙酯(50ml)溶液在室温下用1.0g10％钯炭在微阳性氢气压下氢化处理24小时。将混合物过滤并真空浓缩，将粗品通过中压液相色谱纯化用二氯甲烷然后1∶99甲醇/二氯甲烷再用3∶97的甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到0.79mg(收率47％)的黄色油状标题化合物。TLC∶Rf＝0.36(1∶10∶90的NH4OH/甲醇/二氯甲烷)，HPLC∶Rt＝7.97分，[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
本发明化合物，包括列于上述表1中的化合物的合成可以通过对实施例1-4列出的合成方案并用现有技术中已知的适宜试剂进行修饰而完成。
实施例5(S)-哌啶-2-甲酸，(4-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐(S)-哌啶-2-甲酸-1-(叔丁酯)-2-(4-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐(化合物1)如下。A.(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-(4-吡啶基甲基)酰胺
按照实施例1中A部分的方法，将(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)(2.0g，8.72mmol)和4-(氨基甲基)吡啶(3.18g，29.41mmol)转化成0.75g(收率27％)的产品。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(S)-哌啶-2-甲酸，(4-吡啶基甲基)酰胺
按照实施例1中B部分的方法，用(S)-哌啶-1-甲酸-1-(叔丁酯)-2-(4-吡啶基甲基)酰胺(0.75g，2.35mmol)得到0.49g(收率95％)标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.(S)-哌啶-2-甲酸，(4-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐
将步骤B所得的胺(107mg，0.48mmol)和柠檬酸(94mg，0.48mmol)的乙醇溶液加热到60℃直至溶解。将溶液真空浓缩并将残余物溶解在绝对乙醇中再真空浓缩至发泡。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例6(S)-哌啶-2-甲酸，(4-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-(3-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐的合成如下。A.(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-(3-吡啶基甲基)酰胺
按照实施例1中A部分的方法，将(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)(2.0g，8.72mmol)和3-(氨基甲基)吡啶(3.18g，29.41mmol)转化成1.0g(收率36％)产品。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(S)-哌啶-2-甲酸，(3-吡啶基甲基)酰胺
按照实施例1中B部分的方法，用(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-(3-吡啶基甲基)酰胺(1.0g，3.13mmol)得到0.56g(收率82％)的标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.(S)-哌啶-2-甲酸，(2-吡啶基甲基)酰胺，柠檬酸盐
将步骤B所得的胺(111mg，0.51mmol)和柠檬酸(97mg，0.51mmol)加热至60℃直至溶解。将溶液真空浓缩并将残余物溶解在无水乙醇中再真空浓缩至发泡。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例7(S)-哌啶-2-甲酸-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺，柠檬酸盐
按照实施例5，C部分的方法，将(S)-哌啶-2-甲酸-2-((N甲基)-2-吡啶基乙基)酰胺(实施例1，B部分产品)转化成柠檬酸盐。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例8(S)-哌啶-2-甲酸-((N-甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺，柠檬酸盐
按照实施例6，C部分的方法，将(S)-哌啶-2-甲酸-((N-甲基)-3-(吡啶-3-基)丙基)酰胺(实施例3，D部分产品)转化成柠檬酸盐。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例9(S)-哌啶-2-甲酸，(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)-酯，富马酸盐A.(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)-2-(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯
在(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-醇(6.6g，24.41mmol)的THF(30ml)溶液中加入(S)-哌啶-1，2-二甲酸-1-(叔丁酯)(5.0g，21.81mmol)和EDC(4.7g，24.52mmol)然后室温搅拌18小时。将反应液用乙酸乙酯(200ml)稀释并用水洗涤。将有机层用无水MgSO4干燥，真空浓缩并通过中压液相色谱纯化用1∶100甲醇/二氯甲烷溶液洗脱得到2.0g(收率20％)的标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。B.(S)-哌啶-2-羧酸，(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯
按照实施例1，B部分的方法，用实施例10，A部分的化合物，(1.0g，4.30mmol)得到1.45g(收率88％)的标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。C.(S)-哌啶-2-甲酸，(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯，二富马酸盐
按照实施例6，C部分的方法，用1当量的胺和2当量的富马酸将实施例10，C部分得到的胺并且转化成标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例10(S)-1-甲基-哌啶-2-甲酸，(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯
在实施例10，B部分得到的胺(300mg，0.79mmol)和多聚甲醛(500mg)在甲醇(15ml)中的混合物加入Na(CN)BH3(500mg)。将混合物室温搅拌65小时。将反应物真空浓缩并溶于2N NaOH水溶液中，再用乙酸乙酯(150ml)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，真空浓缩并通过中压液相色谱纯化用2∶98甲醇/二氯甲烷然后0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到230mg(收率74％)的清澈油状标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例11(S)-1-(2-甲基丙基)-哌啶-2-甲酸，(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯
按照实施例11所述方法，将实施例10，B部分所得的胺(300mg，0.79mmol)和2-甲基丙醛(1.6g，22.0mmol)在甲醇(15mml)中的混合物中加入Na(CN)BH3(500mg)。将混合物室温搅拌65小时。将反应物真空浓缩并溶解在2N NaOH(20ml)中再用乙酸乙酯(150ml)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，真空浓缩并通过中压液相色谱纯化用2∶98甲醇/二氯甲烷然后0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到170mg(收率49％)的清澈油状标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例12(S)-1-(吡啶-4-基甲基)-哌啶-2-甲酸(1，7-二-吡啶-3-基)庚烷-4-基)酯
按照实施例11的方法，在实施例10，B部分所得的胺(300mg，0.79mmol)和4-吡啶羧甲醛(4-pyridinecarboxalhehyde)(0.5g，4.67mmol)和甲醇(15ml)的混合物中加入Na(CN)BH3(500mg)。将混合物室温搅拌65小时。将反应液真空浓缩并溶于2N的NaOH(20ml)水溶液中再用乙酸乙酯(150ml)萃取。将有机层用无水MgSO4干燥，真空浓缩并通过中压液相色谱纯化用2∶98甲醇/二氯甲烷然后0.5∶5∶95的NH4OH/甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱得到70mg(收率19％)的清澈油状标题化合物。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例13(S)-(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺，柠檬酸盐
按照实施例6，步骤C的方法，将(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)丙酰胺(实施例2，B部分产品)转化成柠檬酸盐。[1H]-NMR(CDCl3)与结构一致。
实施例14(S)-(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(3-(吡啶-4-基)-1-(4-(吡啶-3-基)丙基)丁基)丙酰胺，柠檬酸盐
按照实施例6，C部分的方法，将(S)-(N-甲基)-2-(甲基氨基)-3-苯基-N-(3-(吡啶-4-基)-1-(4-(吡啶-3基)丙基)丁基)丙酰胺(实施例4，B部分产品)转化成柠檬酸盐。[1H]-NMR(CDCl3)与结构-致。
实施例15旋转异构酶抑制试验对FKBP酶活性的抑制通过S.T.Park等在J.Biol.Chem.，267，pp.3316-24(1992)所述的PPIase试验确定，该公开插入此引作参考。这是胰凝乳蛋白酶-偶联试验其中FKBP催化将肽基质Suc-Ala-Leu-Pro-Phe-pNA中的亮氨酸-脯氨酸键从顺式异构化为反式。只有反式，而不是顺式可以被胰凝乳蛋白酶裂解。释放的Phe-pNA可以通过在400nm的吸收监控。胰凝乳蛋白酶裂解非常快因此顺式到反式的异构化是限速步骤。
各反应混合物的组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲剂，PH7.8，15nMFKBP，30μM基质和0.5mM至10μM稀释在Me2SO中的试验化合物。将混合物在15℃保温5分钟然后将反应物通过加入胰凝乳蛋白酶(最终浓度为100μg/ml)初始化然后进行分光光度测定5分钟。反应液总体积为1ml。没有一个本发明化合物的Ki值小于10μM，如下表所示。表4.旋转异构酶的抑制<
<p>实施例16MDR敏化试验为了证明本发明化合物没有MDR逆转活性使用已知的对具体药物具有抗药性的细胞系。
用L1210vMDRC.06或HL60/Vinc细胞进行多抗药性(MDR)试验。L1210vMDRC.06是用带有MDR1 cDNA的pHaMDR1/A逆转录病毒传导的L1210鼠白细胞，如Pastan等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.4486-4490(1988)上所述。L1210vMDRC.06多抗药系是已经通过在0.06μg/ml秋水仙碱中培养转染细胞而进行药物选择的细胞系。HL60/Vinc人早幼粒细胞白细胞系是从HL60药物敏感母细胞衍生来的多抗药细胞系，该母细胞是通过增加长春花新碱的浓度而选择的。
用L1210vMDRC.06进行的多抗药性试验，是在被制成1×104细胞/孔的96孔微量滴定盘上并将其暴露于有或没有本发明化合物(0.1，0.25，0.5，1.0，或2.5μM)存在下在浓度范围(50nM-10μM)的阿霉素中进行的，该方法描述于U.Germann等的Anti-CancerDrugs，8，pp.125-140(1997)中。培养3天后，细胞的成活力可以用XTT染色评价线粒体功能而定量[Roehm等J.Immunol.Methods142，pp.257-265(1991)]。所有测定均至少重复4次。通过将单独使用阿霉素测得的IC50和阿霉素+化合物的IC50进行比较得出结论。计算MDR率(IC50阿霉素/IC50阿霉素+抑制剂)并其整数值用于比较化合物的效能。
用HL60/Vinc细胞的试验通过制成浓度为4×104细胞/孔的96孔微量滴定盘而完成。然后将细胞暴露在有或没有各种浓度本发明化合物(0.5，1.0，2.5，5.0或10μM)存在下的各种浓度阿霉素(9nM至6.7μM)中，该方法描述于U.Germann等的Anti-CancerDrugs，8，pp.141-155(1997)中。将细胞培养3天后，细胞的成活力可以用XTT染色法评价线粒体功能而定量(Roehm等suDra)。结果表示为阿霉素的IC50与阿霉素加化合物的IC50的比值。在所有试验中，MDR抑制剂本身的抗增殖或细胞毒活性也用HL60/Vinc细胞测定。多种本发明化合物的试验结果列于下表中。
*在化合物浓度为2.5μM时的MDR率，但化合物5，6和7是在10μM浓度下测定的。
从上述结果可以看出，结构和MDR率之间似乎没有很强的相关性。影响因素是化合物进入细胞的能力，化合物的毒性和化合物在细胞内的代谢。因此，MDR率高于7的化合物并不包括在根据本发明参数缺乏MDR逆转活性的化合物中。
实施例17在PC12细胞系中轴突突起的定量为了直接测定本发明化合物的神经营养活性，轴突突起试验可以在Lyons等(1994)描述的嗜铬细胞瘤PC12细胞系上进行。
将PC12细胞在补充有10％热-灭活马血清，5％热-灭活胎牛血清(FBS)，和1％谷氨酸的Dulbecco氏改进的Eagle介质(DMEM)和5％CO2中保持37℃。
然后将细胞在涂有5m/cm2鼠尾胶原的96孔盘上制成105/每孔并使其粘附过夜。然后将介质用DMEM，2％热-灭活马血清，1％谷氨酸，1-5ng/mlNGF(Sigma)替换并改变本发明化合物的浓度(0.01nM-10000nM)。背景对照培养可以在单独使用105ng/mlNGF而没有化合物的情况下进行。阳性对照培养是在高浓度NGF(50ng/ml)下进行。然后将细胞在37℃和5％ CO2中培养72小时，用3％的甲醛固定并在0至4的可见范围内测定轴突突起。
结果见下表。表6本发明化合物的轴突突起活性
>*在每个试验浓度测定3次。所示结果为3个样品的平均值。**测定重复两次，每次用三份进行。结果是六个样品的平均值。***在每个试验浓度测定4次。所示结果为三个样品的平均值。
用化合物1-18，101和103-113列出的本发明化合物相对于背景对照培养具有显著的增加轴突突起的作用。某些化合物在高浓度下缺乏神经生长刺激活性(如表示为“0”)是由于这些化合物在高浓度下对细胞的毒性。化合物103在每次3个浓度测定中只有一个样品在一个试验中出现阴性结果。当重复该试验时我们证实该化合物显示了一些神经生长刺激活性。
本发明的其它化合物也被证明具有显著的神经生长刺激活性。
在通过上文提供多个本发明方案后，可以看出在本发明的基本教导下用本发明方法进行改进而得到其它方案是显而易见的。因此，本发明范围是通过所附的权利要求书定义而不是上文通过具体实施例提出的具体方案来定义的。
权利要求
1.下式化合物及其药用衍生物
其中A和B分别选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中A或B中所述烷基，链烯基或炔基链上任何一个CH2基均可以被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替代；其中R选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，或(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；Ar选自苯基，1-萘基，2-萘基，茚基，薁基，芴基，蒽基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡咯基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，吡唑基，2-吡唑啉基，吡唑烷基，异噁唑基，异噻唑基，1，2，3-噁二唑基，1，2，3-三唑基，1，3，4-噻二唑基，1，2，3-噻二唑基，1，2，4-三唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，4-噻二唑基，苯并噁唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，1，3，5-三嗪基，1，3，5-三噻嗪基，中氮茚基，吲哚基，异吲哚基，3H-吲哚基，二氢吲哚基，苯并[b]呋喃基，苯并[b]噻吩基，1H-吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，4H-喹嗪基，喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，异喹啉基，1，2，3，4-四氢-异喹啉基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，喹唑啉基，喹恶啉基，1，8-二氮杂萘基，哌啶基，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基或吩恶嗪基或其它化学上可行的单环，双环或三环系统，其中每个环由5至7个环原子组成并且其中每个环含有0至3个分别选自N，N(R)，O，S，S(O)，或S(O)2的杂原子，并且其中每个Ar任选地被一至三个分别选自下列的取代基所取代卤原子，羟基，硝基，-SO3H，三氟甲基，三氟甲氧基，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基，O-[(C1-C6)-直链或支链烷基]，O-[(C2-C6)直链或支链链烯基，O-苄基，O-苯基，1，2-亚甲二氧基，-N(R1)(R2)，羧基，N-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰氨基，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)甲酰氨基，N-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，N，N-二-(C1-C5-直链或支链烷基或C2-C5-直链或支链链烯基)磺酰氨基，吗啉基，哌啶基，O-Z，CH2-(CH2)q-Z，O-(CH2)q-Z，(CH2)q-Z-O-Z，或CH＝CH-Z；其中R1和R2分别选自(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，氢原子或苄基；或其中R1和R2与和它们相连的氮原子一起构成5-7员杂环；Z选自4-甲氧基苯基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，吡唑基，喹啉基，3，5-二甲基异噁唑基，异噁唑基，2-甲基噻唑基，噻唑基，2-噻吩基，3-噻吩基，或嘧啶基；和q是0，1，或2；X是N，O，或C(R)；其中当X是N或C(R)时，Y选自氢原子，Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；当X是0时，Y是孤电子对；K选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或环己基甲基；其中K中所述烷基，链烯基或炔基链中的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；n是0，1或2；J选自氢原子，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；或环己基甲基；且D选自Ar，(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烷基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烷基，被(C1-C6)-直链或支链烷基取代的(C5-C7)-环烯基，或被(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基取代的(C5-C7)-环烯基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，或Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中D中所述烷基链中不直接与化合物中SO2相连的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或NR替换。
2.下式化合物及其可药用衍生物
其中A，B，Y，D，n和其所属基团定义同权利要求1；m是0，1，或2；n+m是1，2或3；所示的环为饱和的，部分饱和的或不饱和的；所示环中的1至2个碳原子可任选地被分别选自O，S，S(O)，S(O)2或N(R)的杂原子所替换；且所示环可任选地与苯稠合。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中A或B中至少有一个是终端被吡啶基取代的(C1-C6)-直链烷基。
4.根据权利要求1的化合物，其中X是氮原子或氧原子。
5.根据权利要求1的化合物，其中J是(C1-C3)-直链烷基。
6.根据权利要求1的化合物，其中K是终端被苯基取代的(C1-C3)-直链烷基。
7.根据权利要求1或2的化合物，其中D选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，或CH2-S(O)2-(C1-C4)直链或支链烷基。
8.根据权利要求1至7的化合物，其中D选自氨基苯基，硝基苯基，异丙基，苄基，氟苯基，氰基苯基，甲氧基苯基，二甲氧基苯基，甲磺酰基甲基，亚乙基苯基，二硝基苯氨基苯基，N，N-二甲基氨基苯基偶氮苯基，N，N-二甲基氨基萘基或乙酰氨基苯基。
9.根据权利要求1或2的化合物，其中Y是甲基。
10.根据权利要求1或2的化合物，其中n是0。
11.根据权利要求1或2的化合物，其中n是0；m是2；且所示的环为完全饱和的。
12.根据权利要求1或2的化合物，其中化合物是选自表1中化合物2，或4至18的任一化合物或表2中化合物1至3中的任一化合物。
13.下式化合物及其可药用衍生物
其中A，B，X，Y，K，J，n和其所属基团定义同权利要求1；且R3选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中R3中烷基，链烯基或炔基中的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；并且其中在R3中的烷基，链烯基或炔基中除与氮原子相连的CH2基以外的任一CH2基可任选地被C(O)替换。
14.下式化合物及其药用衍生物
其中A，B，X，Y，n，m和其所属基团定义如权利要求2；及R3选自(C1-C6)-直链或支链烷基，Ar-取代的(C1-C6)-直链或支链烷基，(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基，Ar-取代的(C2-C6)-直链或支链链烯基或炔基；其中R3中烷基，链烯基或炔基中的任一CH2基可任选地被O，S，S(O)，S(O)2或N(R)替换；其中在R3中的烷基，链烯基或炔基中除与氮原子相连的CH2基以外的任一CH2基可任选地被C(O)替换。并且其中当n是0且m是1时，R3中的烷基，链烯基或炔基链中的第二个CH2基不能被C(O)替换。
15.根据权利要求13或14的化合物，其中A或B中至少有一个是Ar-取代的(C1-C6)-烷基链。
16.根据权利要求15的化合物，其中A或B中至少有一个是终端被苯基或吡啶基取代的(C1-C6)-烷基链。
17.根据权利要求13或14的化合物，其中X是N或O。
18.根据权利要求13的化合物，其中K是苄基。
19.根据权利要求13的化合物，其中J是氢原子或甲基。
20.根据权利要求13或14的化合物，其中R3选自氢原子，(C1-C6)-烷基，终端被吡啶基或3，4，5-三甲氧基苯甲酰基甲基取代。
21.根据权利要求13的化合物，其中n是0。
22.根据权利要求14的化合物，其中n是0；m是2；且所示环为完全饱和的。
23.根据权利要求13或14的化合物，其中所述化合物是选自表3中化合物101至113中的任一化合物。
24.具有下述特征的化合物a.具有神经原活性；b.能够增加细胞浆Ca2+浓度或与利阿诺啶受体结合；c.不与FKBP结合；且d.不具有MDR逆转活性。
25.含有下列成分的组合物a)具有神经营养量的权利要求1，2，13或14任一的化合物；和b)药物适用载体。
26.根据权利要求25的组合物，进一步含有神经营养因子。
28.根据权利要求27的组合物，其中神经营养因子选自神经生长因子(NGF)，胰岛素生长因子(IGF)和其活性截短衍生物，酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)，碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)，血小板-衍生生长因子(PDGF)，大脑衍生的神经营养因子(BDNF)，纤毛神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养素-3(NT-3)，神经营养素4/5(NT-4/5)。
29.根据权利要求28的组合物，其中所述神经营养因子是神经生长因子(NGF)。
30.在患者体内或体外神经细胞中刺激神经原活性的方法，包括给所述患者或所述神经细胞服用神经营养量的权利要求1，2，13或14任一的化合物。
31.根据权利要求30的方法，其中将所述化合物给患者服用并将其与适宜药用的载体一起制成药用组合物。
32.根据权利要求31的方法，另外包括给所述患者服用作为多剂量形式一部分或以分剂量形式的神经营养因子。
33.根据权利要求32的方法，其中神经营养因子选自神经生长因子(NGF)，胰岛素生长因子(IGF)和其活性平截衍生物，酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)，碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)，血小板-衍生生长因子(PDGF)，大脑衍生的神经营养因子(BDNF)，纤毛神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养素-3(NT-3)，神经营养素4/5(NT-4/5)。
34.根据权利要求33的方法，其中神经营养因子是神经生长因子(NGF)。
35.根据权利要求30的方法，其中所述方法是用于治疗患有下列疾病的患者三叉神经痛，舌咽神经痛，贝尔氏瘫痪，重症肌无力，肌肉营养不良，肌肉损伤，渐行性肌肉萎缩，渐行性球根遗传肌萎缩，脱肠，破裂的或下垂的无脊椎板综合症，子宫颈脊椎关节强硬，神经丛疾病，胸口破损综合症，外周神经病，如由铅，氨苯砜，壁虱，或紫质症引起的神经病，或其它外周髓磷脂疾病，阿尔茨海默氏疾病，古兰-贝尔综合症，帕金森病和其它帕金森神经机能障碍疾病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，多硬化症，其它中枢髓磷脂疾病，中风和与中风有关的局部缺血，神经paropathy，其它神经变性疾病，运动神经元疾病，坐骨变形，与糖尿病有关的神经病，脊椎索损伤，面部神经变形和其它外伤，化学治疗-和其它药物-诱导的神经病和亨廷顿氏疾病。
36.根据权利要求30的方法，其中所述方法是用于体外刺激神经再生。
37.根据权利要求36的方法，包括另外是神经细胞接触神经营养因子的步骤。
38.根据权利要求37的方法，其中所述神经营养因子选自神经生长因子(NGF)，胰岛素生长因子(IGF)和其活性平截衍生物，酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)，碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)，血小板-衍生生长因子(PDGF)，大脑衍生的神经营养因子(BDNF)，纤毛神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养素-3(NT-3)，神经营养素4/5(NT-4/5)。
39.根据权利要求38的方法，其中是营养因子是神经生长因子(NGF)。
40.刺激患者体内或体外神经细胞的神经原活性的方法，包括给所述患者或神经细胞服用神经营养量的根据权利要求24的化合物。
全文摘要
本发明神经刺激神经细胞中轴突生长的化合物,方法和药物组合物。该化合物和组合物及使用它们的方法是单独使用或与神经营养因子,如神经生长因子联合使用,以促进由疾病或生理外伤引起的神经原损伤的修复。
文档编号A61P25/28GK1271354SQ98809355
公开日2000年10月25日 申请日期1998年8月27日 优先权日1997年8月29日
发明者P·麦卡夫雷, P·M·诺瓦克, M·穆里堪 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司