-2。此外，在此文件中术语"Hu8F4" 一般是指8F4的两种人源化形式（Hu8F4-l和Hu8F4-2)。
[0025] 如本文说明书中所使用的，"一"可意指一或更多。如本文权利要求中所使用的，当 与词语"包含/含有/包括"结合使用时，词语"一"可意指一或多于一。如本文使用的"另 一"可意指至少又一或更多。
[0026] 从以下的详细描述中，本发明的其他目的和特征将变得明显。然而，应理解，虽然 指出了本发明的一些优选实施方案，但是该描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为 通过该详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得明 显。
【附图说明】
[0027] 以下附图构成了本说明书的一部分并且包括在内以进一步证明本发明的某些方 面。参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文所示的具体实施方案的详细描述，可更好 地理解本发明。
[0028] 图1-8F4对PR1/HLA-A2的特异件。用加载有PR1或单氨基酸修饰的PR1类似物 的重组肽/HLA-A2单体进行的ELISA。为了确定PR1序列中对于最优8F4结合必不可少的 氨基酸位置，将加载有包含PR1中丙氨酸替换的肽（ALA1-ALA9)的HLA-A2单体以逐渐增加 的浓度包被在微滴定孔上。然后用固定浓度的8F4或对照抗体bb7. 2(HLA-A* 0201等位 基因特异性小鼠IgG2a单克隆抗体）孵育孔。使用过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体通过 ELISA测量结合。8F4与加载有PR1的HLA-A2结合并且与大多数PR1类似物结合，而显著较 少地与ALA1类似物（肽1位的丙氨酸替换为缬氨酸）结合，并且不与对照肽pp65/HLA-A2 结合。对照抗体bb7. 2与加载有PR1和pp65的HLA-A2结合得同样好。
[0029] 图2-8F4单克降抗体对PR1/HLA-A2的亲和力。使用BIAcore3000通过表面胞质 基因共振确定肽/HLA-A2与8F4和bb7. 2抗体结合的亲和力测量值。测试抗体被捕获到抗 小鼠抗体包被表面上。将分析物肽/HLA-A2稀释至100nM并测试其与抗体包被表面的结合， 一式两份。使用？83,0.005%吐温-20,0.111^/1111854，口117.4作为运行缓冲液在251：进行 分析。为了获得结合亲和力，将实验数据拟合成一级动力学模型（如图中橙色线所示），并 且随后确定8F4和bb7. 2的Kd。
[0030] 图3-8F4对HLA-A2+AML的特异件。用8F4和细胞表面抗体进行白血病和正常PBMC 的多参数流式细胞术。使用aqua在活细胞上对来自AML患者和正常供体的PBMC进行设门， 然后用8F4 (与ALEXAFluor647缀合）、bb7. 2 (与FITC缀合）以及CD13和CD33的表面 表型抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用以下设门策略（gatingstrategy): 首先，分析水中活细胞的CD13和CD33表达，并分析双阳性细胞的PR1/HLA-A2 (8F4)表达 和总HLA-A2表达（bb7. 2)。使用HLA-A2阴性AML对照细胞建立阴性象限设门（negative quadrantgating)〇
[0031] 图4A-B-8F4抗体诱导AML的补体依赖件细朐毒件（⑶C)。洗涤靶细朐并将其以 5X105细胞/ml的浓度重悬于10-RPMI/HEPES中。在96孔板中将20微升（ill)抗体与 lOOli1细胞混合并升温至37°C，然后添加20ii1冰冷的标准兔补体（Cedarlane，Ontario, Canada)并在37°C下孵育90分钟。使用Cyto-ToxGlo细胞毒性测定（Promega)来测定 细胞毒性。抗体特异性CDC(AB-CDC)计算为：AB-CDC= ((Lc+AB-Lc_ABV(Lmax-Ls))X100%， 其中。^是在补体加抗体存在下的靶细胞裂解；LT+。是在补体单独存在下的裂解；Lspmt和 1^_在根据制造商说明书将细胞毒剂毛地黄皂苷添加至细胞之前和之后测量。（图4A)用 20iig8F4孵育诱导了取自HLA-A2+AML患者的PBMC和白细胞分离术（leukapheresis，LP) 细胞的补体依赖性细胞毒性，但是不裂解来自HLA-A2阴性AML的PBMC或者来自HLA-A2+正 常供体的PBMC的对照样品。（图4B)HLA-A2+AML的8F4介导裂解是抗体剂量依赖性的，而 同种型对照抗体（IgG2a小鼠抗KLH)和人静脉内免疫球蛋白（商用IVIG)没有显示出AML 裂解。
[0032] 图5-8F4对AML具有特异件而对if常PBMC没有特异件。对于PR1和HLA-A2的 AML、PBMC和T2细胞的表面染色。用抗PR1/HLA-A2抗体（8F4) -alexa-647 (红色）和FITC 缀合的抗HLA-A2 (绿色）染色细胞，用1 %低聚甲醛固定，然后使用共聚焦显微术进行研究。 用作为阳性对照的PR1肽（20 ii g/ml)和作为阴性对照肽的CMV肽pp65 (20 ii g/ml)脉冲 (pulse) T2细胞。PR1/HLA-A2表达在AML和PR1脉冲的T2细胞的细胞表面上是明显的，而 在HLA-A2+PBMC上或在经pp65脉冲的T2细胞上不明显。Dapi蓝用于核染色。
[0033] 图6-8F4抗体在体外模型中防丨hAML的棺入（engraftment)。洗漆原代HLA-A2+白 血病细胞（1〇6个），重悬于PBS(100ill)中，与8F4或同种型对照抗体（20iig)混合并静脉 内注射到经200cGy辐照的HLA-A2+转基因N0D/SCID小鼠中。在两周后将小鼠处死，解剖， 使组织均质化并用人和小鼠细胞表面标志物通过流式细胞术分析白血病细胞的存在。示出 了分离自小鼠骨髓（BM)的细胞的流式细胞术结果。对照（经PBS处理）和接受AML细胞 加8F4(AML+8F4抗体）的实验动物显示出在BM中没有人白血病细胞。相比之下，接受AML 细胞加对照抗体（AML+同种型对照）的动物显示出骨髓中的人CD33+CD45+细胞，其与输注 的AML具有相同表型。
[0034] 图7-获得抗PR1/HLA-A2抗体的免疫策略。MHCI类分子的示意图。MHC类由重 链和0 2微球蛋白链组成。肽抗原结合到MHC-I的沟中，侧翼是链的a1和a2螺旋结构 域。
[0035] 图8A-B-8F4抗体在HLA-A2Tg异种移棺樽型中防丨h人AML的棺入。洗涤原代 HLA-A2+AML细胞（106个），重悬于PBS(250ill)中，与20iig8F4或同种型对照抗体混合并 静脉内注射到经亚致死辐照（200cGy)的HLA-A2TgN0D/SCID小鼠中。通过组织化学（图 8A)和流式细胞术（图8B)在指示时间分析外周血、骨髓和组织中白血病的存在。分别将 没有AML转移和转移前AML细胞的经辐照小鼠用作阴性对照和阳性对照。（图8A)注射 AML细胞加8F4(左图）、注射AML细胞加同种型对照抗体（iso,中图）后的实验小鼠，以及 无AML转移对照小鼠（右图）的组织中的AML浸润。（图8B)为无转移对照小鼠和经8F4 处理实验小鼠的骨髓（上面两行图）和外周血（下面两行图）中没有检测到AML细胞（示 出转移前，左图）。接受与同种型匹配对照抗体（iso)混合之AML细胞的小鼠在AML转移 后两周或四周显示出AML1和AML5的植入。使用延伸图（extendedpanel)(包括小鼠细胞 特异性标志物（mCD45)、3-6 种人标志物（CD45、CD13、CD33、CD34、CD38、HLA-DR)和Live/ DeadFixableAqua(Invitrogen))对AML植入进行流式细胞术分析。所有图示出了有活力 的mCD45-细胞。
[0036] 图9A-C-由于保守PR1序列在表汰HLA-A2的鼠诰血细朐h.表汰，8F4在HLA-A2 转某闵N0D/SCID中诱导瞬时（21天）嗜中件粒细朐减小。向HLA-A2TgN0D/SCID小鼠注 射20〇1^(1〇11^/1^)8?4或同种型对照413。这些动物显示出呈递内源？1?1。9天后，收获骨 髓细胞，用针对小鼠抗原的mAb(B220-PE、Gr-l-PB、CD1lb-APC、F4/80-PE-Cy7、CD3-FITC和 LIVE/DEADFixableAqua)进行染色并通过流式细胞术进行检查。（图9A)粒细胞的减少 在骨髓的散点图中是明显的（左图）。存在Gr-llo不成熟嗜中性粒细胞，但是8F4处理小 鼠骨髓中的Gr-lhi成熟嗜中性粒细胞少很多（中图）。另外，在8F4处理动物中单核细胞 (SSCloCDllb+ ;右图的右下门）减少。（图9B)静脉内注射8F4(5mg/kg)诱发HLA-A2Tg N0D/SCID小鼠中循环的成熟粒细胞、巨噬细胞和单核细胞的绝对数目瞬时减少。处理后三 周，所有群体保持。图9A示出的门用于确定每种细胞类型作为活细胞百分比的频率。误 差条是每组n= 2只动物的标准偏差。示出了三个中的一个代表性实验。（图9C)在注射 200iig(10mg/kg) 8F4后7天，在HLA-A2TgN0D/SCID小鼠的肝、肺、脾、肾、心脏或脑中，没有 明显的显著病理学变化。示出了来自2只小鼠的代表性组织的H&E切片。
[0037] 图10A-B-在将富含人CD34+细朐的脐带血转移到N0D/SCID小鼠中之后，8F4诱 导R律立的人诰血细朐的瞬时白细朐减小。使用Histopaquel077对新鲜HLA-A2+脐带血 (CB)单元（50-150ml)进行ficoll，用PBS洗涤，然后用CliniMACS缓冲液（PBSpH7. 2/lmM EDTA中的0. 5%HSA，Miltenyi)洗涤。将108个细胞重悬于300mlMACS缓冲液中，与100ml CD34微珠（Miltenyi)混合，在4°C下孵育30分钟并洗涤。使用2LS柱（Miltenyi)对标 记有磁珠的CD34+细胞进行纯化。将CD34+细胞从柱洗脱，计数并静脉内（iv)注射到经辐 照（400rad)N0D/SCID小鼠（1X106至2. 5X10 6个细胞/小鼠）中。对照小鼠CB1-5不接 受CB细胞。（图10A)移植后4周开始，每周或每隔一周取小鼠的外周血以通过使用小鼠 ⑶45、人⑶45和HLA标志物的FACS监测脐带血植入。转移后9至12周，向小鼠静脉内注 射2〇11§(111^/1^)8?4两次，注射之间的间隔为1周（虚线箭头）。（图108)第二次8?4注 射后四周，处死小鼠。如上分析血液、脾和骨髓的人细胞植入。
[0038]图 11 ?DCh8F4、 dHu8F4-1、 dHu8F4-2 和 dHu8F4-2-AA(统称为表汰载体）的示意件 结构。从顶部Sail位点顺时针继续下去，质粒包含重链转录单元，其以人巨细胞病毒（CMV) 的主要立即早期启动子和增强子（CMV启动子）开始，以起始抗体重链基因的转录。CMV启 动子后是VH外显子（包含人y-1重链恒定区的基因组序列），包含CH1、铰链、CH2和CH3 外显子以及介于其间的内含子，并且CH3外显子后面是聚腺苷酸化位点。重链基因序列之 后，轻链转录单元开始于CMV启动子，然后是VL外显子和包含人k链恒定区外显子的基 因组序列（CL)，在其之前具有一部分内含子，并且在CL外显子后面是聚腺苷酸化位点。接 着，轻链基因后面是SV40早期启动子（SV40启动子）、大肠杆菌（E.coli)黄嘌呤鸟嘌呤磷 酸核糖基转移酶基因（gpt)和包含SV40聚腺苷酸化位点（SV40poly(A)位点）的区段。最 后，质粒包含质粒PUC19的一部分，其包含细菌来源的复制（pUCori)和内酰胺酶基因 (3-内酰胺酶）。
[0039] 图12. 8F4VH、人源化8F4 (Hu8F4)VH和人夸体U96282VH的氨某酸序列比对。氨基 酸残基以单字母代码示出